被配置用于生成线焦点的共焦激光扫描显微镜

技术领域

本发明涉及一种被配置为使用在对象内生成的多个线焦点高效地从对象采集三维图像的三维光学成像系统。

背景技术

许多现今的生物医学研究努力以细胞、组织和模型生物体中的复杂动态过程的研究为中心。这些过程在不同时间标度处发生。考虑针对这些研究的要求的空间分辨率，共焦激光扫描显微镜是适合的技术，因为其允许生物材料的高度解析的可视化。共焦显微镜是借助于被配置为阻挡离焦光的空间针孔提供显微照片的增加的光学分辨率和对比度。通常，响应于利用聚焦到样本内的细斑的激光束照射，针孔利用从样本发射的反射光或荧光照射。通过样本光栅扫描激光焦点允许采集不同深度处的二维图像，从而使能对象内的三维结构的重建。此外，使用荧光标记技术允许具有高选择性的细胞的单独生物分子或结构的可视化。然而，由于激光焦点需要通过对象扫描，因而针对许多生物过程，共焦激光扫描显微镜的可实现时间分辨率是不足够的。

针对共焦激光扫描显微镜的另外的应用领域是数字病理学，其中，组织的玻片的数字图像数据被采集用于稍后分析。然而，还在本申请中，要求用于采集三维图像数据的长时间不适于必须处理不断增加的患者数据量的临床工作流程内。此外，组织玻片的横向扩展常常超过成像系统的视场的大小，需要结合第二扫描操作拼接相邻视场或者操作的顺序记录图像，其中，样本关于成像系统扫描，使得组织玻片的所有相关部分在整个图像采集过程期间的某个时间点处的成像系统的视场内。

类似问题存在于依赖于聚焦光束的其他显微成像技术中。

因此，存在对提供更短的图像采集时间的显微成像技术的需要。

发明内容

本公开的实施例涉及一种显微成像系统。所述成像系统包括：光源，其用于生成照明光；光学系统；探测器系统。所述光学系统被配置为聚焦所述照明光以在要检查的对象内同时地形成多个焦点，使得探测光响应于所述照明光而由来自所述焦点的对象发射。所述光学系统还被配置为将所述探测光引导到所述探测器系统，其被配置为探测所述探测光。所述光学系统还被配置为使得当相对于沿着其所述照明光入射在所述对象上的光学系统的光轴查看时，所述焦点在轴向方向上彼此相互移位并且在横向方向上彼此相互移位。针对所述对象中生成的焦点中的每个，所述探测器系统和所述光学系统被配置为实质上分离地探测从相应焦点发射的探测光。所述光学系统和所述探测器系统被配置为补偿沿着所述轴向的移位。所述光学系统和/或所述探测器被配置为使得针对所述焦点中的每个，接收所述探测光的部分的探测器系统的光接收部分实质上位于光学共轭于所述相应焦点的至少部分的位置。

所述显微成像系统可以是共焦成像系统，特别地扫描共焦成像系统。所述显微成像系统可以被配置用于三维成像。所述对象可以对于所述照明光和所述探测光至少部分地透明。通过范例，所述对象可以是组织切片。所述组织切片可以从活检样本或者切除样本取得。

所述光源可以包括激光器。所述激光器可以被配置为发射具有200纳米与1800纳米之间的范围内或300纳米与1500纳米之间的范围内的一个或多个波长的光辐射。激光可以被配置为发射具有适合于激发荧光团的波长的光辐射，荧光团诸如为DAPI、FITC、或荧光蛋白质的若干物质，其通常利用从近紫外线通过可见范围到近红外线范围的激发波长操作。由所述激光器生成的照明光可以是单色或实质上单色的。所述光学系统可以包括分束器系统，其在所述光源与所述对象之间的照明光和探测光中。通过范例，所述分束器系统可以包括分色分束器(诸如分色镜)和/或立方体分束器。所述分束器可以将所述探测光与所述照明光分离。所述探测光可以包括荧光发射光，可以具有大于包括在所述照明光中的激发光的波长的波长。所述分束器可能对光的传播方向和/或波长敏感。

所述焦点定位在公共平面内或实质上在公共平面内。所述公共平面的法线可以相对于沿着其所述照明光入射在所述对象上的光轴成角。通过范例，所述角可以大于0.01度或大于0.03度或大于0.3度或大于1度。所述角可以小于6度或者小于4.5度。这些值中的每个在空气中测量，即，在不考虑所述对象的折射率的情况下。

所述显微成像系统的光学系统可以被配置为使得针对每对焦点并且在空气中测量，所述轴向移位大于10纳米、或大于30纳米、或大于50纳米、或大于100纳米、或大于200纳米、或大于300纳米或大于500纳米。针对具有最小轴向移位的焦点对，在空气中测量的轴向移位可以小于150微米、或小于100微米、或小于50微米、或小于20微米、或小于10微米、或小于5微米、或小于1微米。

针对每对焦点，在空气中测量的轴向移位可以大于沿着所述光轴测量的光学系统的衍射限制焦斑的轴向直径的0.2倍或大于其0.5倍，沿着所述光轴，所述照明光入射在所述对象上。所述衍射限制斑点可以基于所述光学系统的性质并且在不考虑所述光源和所述对象的情况下(即，假设1的数字索引)确定。针对具有最小轴向移位的焦点对，在空气中的测量的轴向移位可以小于沿着所述光轴测量的衍射限制焦斑的轴向直径的150倍、或小于其100倍。所述直径可以是半峰全宽(FWHM)直径。

沿着所述光轴测量并且在所述光学系统的焦平面中的光学系统的衍射限制焦斑的轴向直径可以被定义为等于

所述显微成像系统的光学系统可以被配置为使得针对每对焦点并且在空气中测量，所述横向移位大于100纳米、或大于200纳米、或大于300纳米、或大于500纳米。针对具最小横向移位的焦点对，在空气中测量的横向移位可以小于300微米、小于200微米、小于100微米、或小于50微米、或小于20微米、或小于10微米、或小于1微米。

在空气中测量的横向移位可以大于垂直于所述光轴测量的衍射限制焦斑的横向直径的0.2倍或大于其0.5倍。所述衍射限制斑点可以根据所述光学系统的性质并且在不考虑所述光源和所述对象的情况下(即，假设1的折射率)确定。针对具有最小横向移位的焦点对，在空气中测量的横向移位可以小于所述衍射限制焦斑的横向直径的150倍或小于其100倍。所述直径可以是半峰全宽(FWHM)直径或者艾里斑的直径(对应于第一强度最小值)。

垂直于所述光轴测量并且在所述光学系统的焦平面中的光学系统的衍射限制焦斑的横向直径可以被定义为等于1.22λ/NA，其中，λ是激发波长，n是所述对象的折射率，并且NA是产生焦点的光学系统的物侧数值孔径，其被定义为NA＝nsinα，其中，α是所述光学系统的光轴与会聚到所述焦点的射束的边缘射线之间的角。

所述探测光可以具有表示一个或多个波长范围的光谱分布，该一个或多个波长范围与由所述照明光的光谱分布表示的一个或多个波长范围不同。所述探测光可以是响应于所述照明光从所述样本的部分发射的荧光。也可以想到，所述探测光是反射的照明光，其由所述对象的部分反射。

在所述对象中生成的焦点的数目可以等于或大于2、3、4、5或10。所述焦点的数目可以小于250、小于130、小于50或小于30。所述焦点中的每个可以是线焦点。所述线焦点中的每个可以沿着直线或沿着实质上直线纵轴延伸。所述线焦点的纵轴可以相对于彼此平行或实质上平行延伸。

针对所述焦点中的每个，在空气中测量的相应焦点的最小直径大于200纳米、大于250纳米、或大于300纳米。宽度可以小于5微米或小于3微米。

所述线焦点的纵轴可以垂直或者实质上垂直于沿着其所述照明光入射在所述对象上的光轴。额外地或者备选地，所述线焦点的纵轴可以实质上垂直或者垂直于沿着其所述线焦点的横向移位被测量的横向方向。

针对所述线焦点中的每个，在空气中测量的线焦点的轴向长度可以大于1微米或大于2微米、或大于5微米。所述轴向长度可以小于10毫米或小于5毫米、或小于1毫米、或小于500微米。针对所述线焦点中的每个，所述轴向长度可以是在空气中测量的光学系统的衍射限制焦斑的横向直径(即，垂直于所述光轴测量的)的至少5倍或至少10倍或20倍，和/或垂直于所述光轴测量的相应线焦点的最大横向宽度的至少5倍或15倍。

针对所述线焦点中的每个，垂直于相应线焦点的纵轴并且在空气中测量的相应线焦点的横向宽度可以大于200纳米、或大于250纳米、或大于300纳米或大于500纳米。所述宽度可以小于20微米或小于10微米或小于5微米、或小于1微米。针对所述线焦点中的每个，所述宽度可以大于在空气中测量的光学系统的衍射限制焦斑的横向直径(即，垂直于所述光轴测量的)。针对所述线焦点中的每个，所述宽度可以小于垂直于所述光轴测量的衍射限制焦斑的横向直径的100倍、小于其10倍或小于其5倍。

根据另外的实施例，所述光学系统包括校正光学系统，其被配置为至少部分地补偿所述光学系统的球面像差。所述球面像差能够影响所述焦点中的至少一个的形状和/或位置。特别地，所述球面像差能够影响所述线焦点中的至少一个的形状和/或线宽度。甚至更多地，如下文更详细地描述的，影响所述线焦点的形状和/或线宽度的球面像差可以针对影响线焦点中的每个不同，因为所述线焦点位于样本内的不同深度处。

所述校正光学系统可包括一个或多个折射光学元件和/或一个或多个衍射光学元件。所述一个或多个衍射光学元件的至少部分可以被配置为可寻址的空间光调制器。衍射光学元件可以例如是由玻璃或石英或聚合物制成的透明板，其由所述照明光束穿过并且其具有取决于具有所述折射光学元件的照明光束的截面内的位置的厚度。所述校正光学系统的元件中的每个可以被布置在所述照明光中。所述校正光学系统可以是射束倍增系统的部分或可以构成射束倍增系统。所述射束倍增系统可以被配置为生成多个子射束。所述光学系统可以被配置为将所述子射束中的每个聚集到所述对象内的焦点中的一个中。

所述校正光学系统可以在所述光源与所述对象之间的照明光中，特别地在所述光源与所述光学系统的一个或多个折射光学元件之间的照明光中，其生成所述球面像差的至少部分。所述光学系统可以使用一个或多个折射光学元件将所述照明光聚集到所述对象内的焦点中。所述一个或多个折射光学元件可以包括物镜。所述物镜可以是最后光学系统，其在入射在所述对象上之前由所述照明光穿过。

所述球面像差的至少部分可以由所述对象处的数值孔径引起，其大于或等于0.25、或大于或等于0.5。所述数值孔径可以小于2.0、或小于1.5、或小于1.3、或小于1.0。

如果所述成像系统被配置为扫描共焦显微镜，则在垂直于所述线焦点的纵轴的方向上的聚焦光的最大浓度允许在垂直于所述线焦点的轴的方向上的最大分辨率。

所述探测器系统可以包括多个光敏探测器元件。所述光敏探测器元件中的每个可以被配置为彼此分离地探测光的部分，其入射在相应光敏探测器元件的光敏表面上。通过范例，所述光敏探测器元件可以是光敏像素。所述光敏探测器元件可以以一个或多个规则或不规则阵列布置在所述探测器系统的光接收表面上。针对在所述对象中生成的焦点中的每个，从所述相应焦点发射的探测光可以聚焦或者未聚焦到所述探测器系统的光接收表面上。

所述光接收部分的至少部分可以是所述光接收表面的表面部分。所述光接收部分的至少部分可以包括所述探测器系统的一个或多个光敏探测器元件，诸如例如一个或多个像素。

对沿着所述轴向方向的移位的补偿可以考虑所述对象的折射率。所述对象的折射率的值可以大于或等于1、大于或等于1.2或大于或等于1.3。所述折射率可以小于或等于4、小于或等于3、或小于或等于2.5。所述对象的折射率可以实质上对应于水(即，1.33)。所述对象的主要组分可以是水。

根据另外的实施例，所述探测器系统被配置为使得当相对于沿着其所述探测光入射在所述光接收部分上的光学系统的光轴查看时，针对不同焦点的光接收部分彼此轴向移位。

根据另外的实施例，所述光接收部分位于公共平面或实质上位于公共平面中。所述公共平面的法线被布置在相对于沿着其所述探测光入射在所述光接收部分上的光轴的角处。所述角可以定尺寸以至少部分地补偿所述对象中的焦点的轴向移位。所述公共平面可以是所述探测器系统的光接收表面。所述角可以定尺寸，使得考虑所述对象的折射率。

额外地或者备选地，可以设想，所述探测器的光接收表面具有阶梯表面。所述阶梯表面可以被配置为提供相互轴向移位的光接收部分。

根据另外的实施例，针对所述焦点中的每个，所述光学系统和所述探测器系统被配置用于将所述探测光进行共焦滤波以用于滤除从相应焦点发射的探测光的至少部分。

根据另外的实施例，针对所述焦点中的每个，所述光学系统和所述探测器系统被配置用于相应焦点内的空间解析光探测。所述空间分辨率可以是一维或二维空间分辨率。针对在所述对象内生成的焦点中的每个，所述探测器系统可以包括用于分离地探测从所述相应焦点发射的探测光的部分的多个光敏探测器元件。所述光敏探测器元件中的每个可以探测来自所述焦点内的区域的光，其中，所述区域光学共轭到所述光敏探测器元件。

根据另外的实施例，所述光接收部分中的每个由所述探测器系统的光敏探测器元件的相应组提供。所述光敏探测器元件中的每个可以具有光敏表面。非光敏表面区域分离相邻组的光敏探测器元件的光敏表面。针对在所述组之一中的相邻光敏表面的每个对，所述对的光敏表面之间的移位小于所述分离距离的0.25倍、或小于所述分离距离的0.1倍、或小于所述分离距离的0.05倍。所述分离距离可以小于所述移位的15倍或小于所述移位的45倍或小于所述移位的60倍或小于所述移位的100倍或小于所述移位的200倍。

所述分离距离可以是不同但是相邻光接收部分的光敏表面之间的最小距离。所述相邻光敏表面之间的移位可以被测量为所述光敏表面的区域中心之间的距离。

针对所述组中的一个或多个，相应组的光敏探测器元件可以形成光敏表面的规则阵列(诸如矩形或正方形阵列)或不规则阵列。所述阵列可以具有带有纵轴的纵向形状。所述分离距离可以垂直于所述纵轴来测量。

根据另外的实施例，所述焦点中的每个是线焦点，并且其中，针对所述线焦点中的每个，所述空间解析光探测至少沿着相应线焦点的轴。

根据另外的实施例，所述显微成像系统还包括扫描系统，其被配置为生成一方面所述焦点与另一方面所述对象之间的相对扫描移动。所述成像系统可以被配置为针对所述焦点中的每个，探测从沿着所述扫描路径的多个扫描位置中的每个处的相应焦点发射的探测光。

所述扫描系统可以是一、二、或三维扫描系统。所述扫描系统可以包括所述对象可安装在其上的扫描级。所述扫描级可以被配置为执行所述扫描移动的至少部分。所述相对扫描移动可以包括实质上垂直于沿着其所述照明光入射在所述对象上的光学系统的光轴的对象和/或焦点的移动。额外地或者备选地，所述光学系统可以包括射束扫描单元，其在所述光源与所述对象之间的照明光中。特别地，所述扫描单元可以在所述射束倍增系统与所述对象之间的照明光中。所述扫描单元可以包括一个或多个扫描反射镜。所述扫描反射镜可以被配置为在垂直或者实质上垂直于沿着其所述照明光入射在所述对象上的光轴的方向上使所述焦点同时移位。

根据另外的实施例，所述焦点中的每个是线焦点。所述扫描系统可以被配置为使得所述扫描移动的方向实质上垂直于所述线焦点中的至少一个的轴。所述焦点的轴可以相对于彼此平行或实质上平行取向。

根据另外的实施例，所述光学系统包括射束倍增系统。所述射束倍增系统可以在所述光源与所述对象之间的照明光中。所述射束倍增系统可以被配置为生成多个子射束。

根据另外的实施例，所述射束倍增系统被配置为生成所述子射束，使得所述子射束中的每个从实或虚焦点发散或者朝向实或虚焦点会聚。所述光学系统可以包括聚焦光学器件，其被配置为将所述会聚或发散子射束中的每个聚集到所述对象内的焦点之一中。

根据另外的实施例，所述射束倍增系统包括衍射光学元件，其中，所述子射束中的每个对应于由所述衍射光学元件生成的衍射级。所述光学系统可以被配置为使得入射在所述射束倍增系统上(特别地在所述衍射光学元件上)的照明光是平行或实质上平行光束。换句话说，入射在所述射束倍增系统或者所述衍射光学元件上的照明光包括具有平面或实质上平面波前的射束。所述波前可以相对于所述射束倍增系统的衍射平面或者所述衍射光学元件的折射平面平行或实质上平行来取向。

所述衍射光学元件可以被配置为使得所述子射束中的每个是像散的。所述光学系统可以被配置为将所述像散子射束中的每个聚焦到相应线焦点中。因此，所述线焦点的线形状可以至少部分地由所述子射束的像散引起。将像散子射束中的每个聚焦到相应线焦点中可以由聚焦光学器件执行，其相对于所述光学系统的线性、曲线和/或成角光轴是旋转对称或实质上旋转对称的。

所述衍射光学元件可以被配置为使得所述子射束中的每个是像散的。像散可以至少部分地使得所述子射束聚焦到所述线焦点中。所述像散可以至少部分地由从所述衍射光学元件离开的照明光的相位轮廓引起。

根据另外的实施例，所述衍射光学元件被配置为使得从所述衍射光学元件离开的照明光具有在所述衍射光学元件的衍射平面中测量的相位轮廓。相位轮廓或者所述相位轮廓的多项式表示的加性分量可以具有二重旋转对称性或实质上二重旋转对称性。二重旋转对称的对称轴可以是或可以实质上是所述光学系统的光轴和/或照明射束的射束轴。

所述多项式表示可以是唯一地确定的多项式表示。所述多项式表示的原点(即，其中所述多项式的参数具有零的值的点)可以位于所述光学系统的光轴上和/或进入所述衍射光学元件的照明光的射束轴上。

根据另外的实施例，所述相位轮廓或所述加性分量是或实质上是项或多项式。所述项或所述多项式可以是单变量的。单变量项或单变量多项式可以是2次或更高次或4次或更高次。

所述单变量多项式的二次项的系数与所述单变量多项式的四次项的系数的比可以具有在其中所述照明光穿过所述衍射光学元件的位置处的照明光的射束截面的半径的-1与-11倍之间的值。所述半径可以对应于FWHM(半峰全宽)的一半。所述截面可以垂直于照明光的射束的轴和/或在所述衍射光学元件的衍射平面中获取。

额外地或者备选地，比率可以使得针对由以下等式定义的值p：

p＝R/(F

其中，R是比率，F是将所述子射束聚焦到所述线焦点中的所述光学系统的聚焦光学器件的物侧焦距，并且NA是所述对象处的数值孔径，p具有-3与-10之间或-4和-8之间的值。通过范例，p具有-6的值。

发明人已经示出，针对比率的这些范围对于获得具有沿着相应线焦点的纵轴的较小峰值强度变化和/或较小线宽度变化的线焦点是特别有利的。

根据另外的实施例，所述射束倍增系统包括衍射光学元件，其生成所述多个子射束并且还用作校正光学系统。

额外地或者备选地，所述衍射光学元件可以被配置为针对所述子射束中的每个补偿球面像差。所述球面像差可以至少部分地通过使用聚焦光学器件将所述子射束聚焦到所述线焦点中引起。如下文将详细解释的，所述衍射光学元件允许针对所述不同线焦点中的每个的不同量的球面像差的补偿。

所述衍射光学元件的衍射级的数目可以与所述对象中的焦点的数目相同。所述射束倍增系统可以被配置为将入射在所述射束倍增系统上的照明光的功率集中到多个衍射级，使得进入剩余衍射级的光发射被抑制。换句话说，剩余衍射级的总功率小于用于形成所述对象内的焦点的衍射级的总光功率的30％或小于其20％或小于其10％。

根据另外的实施例，所述射束倍增系统包括折射光学单元阵列，其中，所述折射光学单元中的每个聚焦或者散焦所述照明光的部分以形成所述子射束之一。所述折射光学单元的光轴可以相对于沿着其所述子射束进入所述聚焦光学器件的聚焦光学器件的光轴成角或者相对于入射在所述折射光学单元上的照明光的射束的射束轴成角。所述角可以被定尺寸到至少部分地所述对象内的焦点的轴向移位。

根据另外的实施例，所述射束倍增系统包括可寻址的空间光调制器。所述可寻址的空间光调制器可以是光可寻址和/或电可寻址空间光调制器。所述空间光调制器可以是反射和/或透射空间光调制器。所述可寻址的空间光调制器可以被配置为衍射光学元件。

根据另外的实施例，所述探测光是荧光，其响应于所述照明光而由所述对象生成。

本公开涉及以下实施例：

项1：一种显微成像系统，所述成像系统包括：光源，其用于生成照明光；光学系统；探测器系统；其中，所述光学系统被配置为：聚焦所述照明光以在要检查的对象内同时地形成多个焦点，使得响应于所述照明光而由所述对象从所述焦点发射探测光；并且将所述探测光引导到所述探测器系统，所述探测器系统被配置为探测所述探测光；其中，所述光学系统还被配置为使得当相对于所述光学系统的沿着其所述照明光入射在所述对象上的光轴查看时，所述焦点在轴向方向上彼此相互移位并且在横向上彼此相互移位；并且其中，针对所述对象中生成的所述焦点中的每个焦点，所述探测器系统和所述光学系统被配置为实质上分离地探测从相应焦点发射的所述探测光；其中，所述光学系统和/或所述探测器系统被配置为补偿沿着所述轴向方向的所述移位，使得针对所述焦点中的每个焦点，所述探测器系统的接收所述探测光的部分的光接收部分实质上被定位于光学共轭于相应焦点的至少部分的位置处。

项2：根据项1所述的成像系统，其中，所述探测器系统被配置为使得当相对于沿着其所述探测光入射在所述探测器系统上的光学系统的光轴查看时，针对不同焦点的光接收部分彼此轴向移位。

项3：根据项1或2所述的成像系统，其中，所述光接收部分实质上被布置在公共平面内；其中，所述公共平面的法线被布置在相对于沿着其所述探测光入射在所述光接收部分上的光轴的角处；其中，所述角被定尺寸以至少部分地补偿所述对象中的焦点的轴向移位。

项4：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，针对所述焦点中的每个，所述光学系统和所述探测器系统被配置用于将所述探测光进行共焦滤波以用于滤除从所述相应焦点发射的探测光的至少部分。

项5：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，针对所述焦点中的每个，所述光学系统和所述探测器系统被配置用于相应焦点内的空间解析光探测。

项6：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，所述光接收部分中的每个光接收部分是由所述探测器系统的光敏探测器元件的相应组提供的，其中，所述光敏探测器元件中的每个光敏探测器元件具有光敏表面；其中，非光敏表面区域分离相邻组的所述光敏探测器元件的所述光敏表面；其中，针对在所述组中的一个组中的相邻光敏表面的每个对，所述对的所述光敏表面之间的移位小于分离距离的0.25倍、或小于分离距离的0.1倍、或小于分离距离的0.05倍。

项7：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，所述焦点中的每个是线焦点，并且其中，针对所述线焦点中的每个，所述空间解析光探测至少沿着相应线焦点的轴。

项8：根据前述项中的任一项所述的成像系统，还包括：扫描系统，其被配置生成一方面所述焦点与另一方面所述对象之间的相对扫描移动；其中，所述成像系统被配置为针对所述焦点中的每个探测从沿着所述扫描路径的多个扫描位置中的每个处的相应焦点发射的探测光。

项9：根据项8所述的成像系统，其中：所述焦点中的每个是线焦点；并且所述扫描系统被配置为使得所述扫描移动的方向实质上垂直于所述线焦点中的至少一个的轴。

项10：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，所述光学系统包括射束倍增系统，其是所述光源与所述对象之间的照明光并且其生成多个子射束。

项11：根据项10所述的成像系统，其中：所述射束倍增系统被配置为生成所述子射束使得所述子射束中的每个具有实或虚焦点；并且所述光学系统被配置为将从所述实或虚焦点会聚或朝向所述实或虚焦点发散的子射束中的每个成像到所述对象内的焦点之一中。

项12：根据项10或11所述的成像系统1，其中，所述射束倍增系统包括衍射光学元件，其中，所述子射束中的每个对应于由所述衍射光学元件生成的衍射级。

项13：根据项10至12中的任一项所述的成像系统，其中，所述射束倍增系统包括折射光学单元阵列，其中，所述折射光学单元中的每个聚焦或者散焦所述照明光的部分以形成所述子射束之一。

项14：根据项10至13中的任一项所述的成像系统，其中，所述射束倍增系统包括可寻址的空间光调制器。

项15：根据前述项中的任一项所述的成像系统，其中，所述探测光是荧光，其响应于所述照明光而由所述对象生成。

附图说明

图1是根据第一示范性实施例的成像系统的示意图；

图2是使用在图1中示意性图示的第一示范性实施例的成像系统生成的聚焦光学器件和线焦点的示意图；

图3是在图1中示意性图示的第一示范性实施例的成像系统的探测器系统的光接收表面上的光敏探测器元件的布置的示意图；

图4是根据第二示范性实施例的成像系统的示意图；

图5示意性地图示了根据图4中示出的第二示范性实施例的成像系统中的射束倍增系统的衍射级上的输入功率的分布；并且

图6是根据第三示范性实施例的成像系统的示意图。

具体实施方式

图1是根据第一示范性实施例的显微成像系统1的示意图。显微成像系统1被配置为使得探测光使用探测器系统12来探测，其中，探测光响应于照明光而由对象4生成，其由光源2生成并且其被引导到对象4。探测光可以包括荧光和/或反射照明光。

光源2可以包括激光系统，使得从光源2发射的照明光的射束3是激光束。然而，还可以设想的是(特别地在将结合图6描述的第三示范性实施例中)，光源2包括非激光光源，诸如卤素灯。通过范例，激光器可以被配置为半导体二极管激光器、气体或固态激光器。照明光的射束3使用包括射束倍增器5、分束器6和聚焦光学器件7的光学系统引导到对象4。照明光的射束3可以包括200纳米和1800纳米的范围内或300纳米与1500纳米的范围内的一个或多个波长。更特别地，其可以具有适合于激发常用荧光团的波长，所述常用荧光团诸如为DAPI、FITC、或荧光蛋白质的若干物质，其通常利用通过可见范围从近紫外到近红外线范围的激发波长操作。

射束倍增器5接收由光源2生成的照明光的射束3，以生成照明光的多个子射束8和9。射束倍增器5和子射束8和9的配置将在下面参考结合图4和6所描述的第二和第三示范性实施例进一步详细描述。为了说明简单起见，在图1中，仅示出了两个子射束8和9。然而，可以设想，射束倍增器生成超过两个子射束，诸如超过5个子射束或超过10个子射束。子射束的数目可以小于500或小于130。

由射束倍增器5发射的子射束8和9入射在分束器6上。分束器6可以被配置为波长敏感分束器，诸如分色分束器，其发射与其反射不同的波长。额外地或者备选地，分束器6可以被配置为立方体分束器。图1所示的分束器6被配置为使得反射的照明光的部分与未反射的发射的照明光的部分相比较被抑制。另外，与反射的探测光的部分相比较，未反射的探测光的部分被抑制。在备选实施例中，分束器6被配置为使得未反射的发射的照明光的部分与反射的照明光的部分相比较被抑制，并且反射的探测光的部分与未反射的发射的探测光的部分相比较被抑制。

从射束分离器6离开的照明光的子射束8和9入射在聚焦光学器件7上，其被配置为将小射束8和9中的每个聚焦到对象4内的线焦点LF

聚焦光学器件7是旋转对称或实质上旋转对称的。聚焦光学器件7定义光轴A1，沿着该光轴A1，照明光入射在对象4上。

应理解，聚焦光学器件7实质上与旋转对称偏离的配置是可以设想的。通过范例，聚焦光学器件7可以包括一个或多个平面对称光学元件，诸如圆柱透镜。对于平面对称光学元件，光轴位于对称平面内。此外，本发明不限于仅具有一个光轴的聚焦光学器件7。通过范例，聚焦光学器件7可以包括光学元件阵列，其定义沿着其照明光入射在对象上的多个光轴。

如图2中更详细图示的，光学系统被配置为使得当相对于光轴A1查看时，线焦点LF

特别地，如图2所图示的，当沿着光轴A1测量时，线焦点LF

换句话说，针对线焦点LF

通过范例，光学系统可以被配置为使得线焦点之间的横向移位距离Δx可以大于沿着横向方向d测量的线焦点LF

已经由发明人示出，线焦点位于垂直于光轴的对象平面内并且对象相对于对象平面倾斜的不同配置(其未由权利要求覆盖)导致严重降低显微成像系统的分辨率的显著像差。特别地，这些像差由彗差和像差支配。发明人还已经示出，如果使用其中线焦点LF

返回到图1，成像系统1的光学系统还被配置为对光敏探测器系统12的光接收表面10上的相应光接收部分SP

如可以从图1看到的，光接收部分SP

额外地或者备选地，可以设想，光学系统被配置为至少部分地补偿对象4内的线焦点LF

如图1进一步示意性指示的，对象4沿着相对于焦点LF

图3示意性地图示了探测器系统12(图1所示的)的光接收表面10上的光敏探测器元件20的布置。光敏探测器元件20具有光敏表面并且是像素。光敏探测器元件中的每个被配置为分离地探测从对象发射的探测光的相应部分。针对焦点LF

阵列21和22中的每个被定尺寸，使得其充当共焦空间滤波器，其以类似的方式充当常规扫描共焦显微镜中的针孔。因此，针对线焦点LF

此外，阵列21和22中的每个内的多个光敏探测器元件20允许沿着线焦点LF

与常规二维图像传感器相比，本实施例的光敏探测器系统12防止探测未提供有用信息的像素信号，因为光接收表面10仅具有探测光的焦点位置处(即，在光接收部分SP

图4是根据第二示范性实施例的显微成像系统1a的示意图。类似或者对应于图1至3所图示的第一示范性实施例的部件的成像系统1a的部件标有相同附图标记但是继之以后缀字母“a”以避免混淆。

在第二示范性实施例的成像系统1a中，射束倍增系统5a包括衍射光学元件13a，其在光源2a与射束分离器6a之间的照明光的路径中。反射光学元件13a可以包括光栅，其可以被配置为用作反射光栅或者透射光栅。通过范例，光栅可以包括电可寻址和/或光可寻址光栅。电和/或光可寻址光栅的范例是空间光调制器。空间光调制器可以使用液晶技术。空间光调制器可以包括像素阵列，其中，像素中的每个生成照明光的射束3a的部分的相位延迟，其穿过或入射在相应像素上。相位延迟可以是借助于提供到空间光调制器的信号可调节的。信号可以是电和/或光信号。由衍射光学元件13a定义的衍射平面可以是聚焦光学器件7a或将从衍射光学元件离开的照明光聚集到对象内的焦点(点焦点或线焦点)中的光学器件的光瞳平面。

额外地或者备选地，衍射光学元件13a可以包括将不可调节的相位延迟给予到入射在衍射光学元件13a上的照明光的射束3a的光学元件。通过范例，衍射光学元件13a包括由玻璃、石英和/或聚合物制成的板，诸如聚碳酸酯。板可以具有表面结构，诸如波纹表面结构，其被配置为生成跨射束轮廓的光路长度的期望变化，其生成多个子射束。波纹表面结构可以使用蚀刻和/或压纹过程生成。

如在下文中将描述的，使用衍射光学元件13a生成的子射束8a、9a被配置为使得包括物镜的聚焦光学器件7a将这些子射束聚焦到具有如上文所描述的其相互轴向和横向移位的线焦点LF

衍射光学元件13a被配置为使得通过射束倍增系统5a透射的照明光包括多个子射束8a、9a，使得子射束中的每个从实或虚焦点发散或朝向实或虚焦点会聚。实或虚焦点彼此移位。衍射光学元件13a被配置为使得实或虚焦点的移位使得对象4a中的线焦点的横向和轴向移位。特别地，在根据第二示范性实施例的成像系统1a中，射束倍增系统5a与分束器6a之间的区域中的子射束8a和9a具有涉及子射束8a、9a从其发散并且其彼此移位的虚焦点(在图4中未示出)的不同发散。聚焦光学器件7a被配置为将这些虚焦点中的每个成像为对象内的线焦点LF

如还可以从图4看到，射束倍增系统5a包括适配光学器件24a，其设置在衍射光学元件13a与分束器6a之间的照明光中。适配光学器件24a用作射束扩展器，其将子射束8a、9a中的每个的截面适应于聚焦光学器件7a的入射光瞳。将射束直径适应于聚焦光学器件7a的入射光瞳允许生成具有相当小宽度的对象4a中的线焦点LF

在图4所示的示范性实施例中，适配光学器件24a被配置为具有两个中继透镜14a和17a的无焦开普勒望远镜，其主平面以其焦距的和彼此移位。在备选实施例中，预期了适配光学器件的其他配置，其未被配置为开普勒望远镜或其未被配置为无焦。

由于适配光学器件24a被设置在衍射光学器件13a与分束器6a之间的照明光的子射束8a、9a中，因而适配光学器件24a位于探测光的路径之外。从而，防止光敏探测器12a的光接收表面10a上的探测光的强度由适配光学器件24a降低。从而，可以获得经改进的低光灵敏度。然而，应当注意，针对许多应用，如果适配光学器件24a由照明光以及由探测光穿过，则可以获得足够低的光灵敏度。

衍射光学元件13a被配置为给予照明光的入射射束3上的相位W(x,y)，其中，(x,y)是由衍射光学元件13a定义的平面内的坐标值，其在示范性实施例中垂直于照明光的射束3a的射束轴来取向。

平面可以划分成多个区，其中，对于区中的每个，分配离散指数j，其在本文中被指代为区指数。

如果以下适用则具有坐标(x,y)的点在区j中：

jλ≤K(x,y)＜(j+1)λ,

其中，λ是射束波长，并且K(x,y)是在本文中被指代为区函数的函数。作为说明性范例，在常规光栅中，区函数是x的线性函数。在每个区j内，采取值0≤t＜1的变量t由以下等式给定：

其中，floor(x)定义为小于x的最大整数。添加到照明光的入射射束3a的相位轮廓W(x,y)由本文中指代为轮廓函数的函数f(t)根据以下等式定义：

因此，轮廓函数f(t)取决于每个区内的光栅的形状。被定义为以下等式的针对衍射光学元件13a的复值传输函数：

可以写作具有指数m的衍射级上的和：

其中：

m阶的衍射效率是η

从前述得出，轮廓函数f(t)可以设计为给定衍射级m上的光强度的期望分布，并且区函数K(x,y)可以设计为向不同贡献阶m给定期望相位。

为了获得线焦点LF

K(x,y)＝ax+b(x

如从以下等式可以看到的，a和b是确定线焦点LF

Δx

并且焦线之间的轴向移位Δz

Δz

区域15a中的线焦点与对象4a中的焦点之间的横向放大是M

Δx＝M

Δz＝nM

其中，n是对象4a中的折射率，其通常接近于针对生物样本的水的折射率。从对象4a到传感器12a的放大步骤可以以确切地与上文所描述的相同的方式处理。横向放大是M

Δx

在光接收表面10a的法向量与沿着其探测光入射在光接收表面10a上的光轴之间形成的角α

并且作为光接收表面10a的光敏探测器元件20的相邻阵列21、22之间的移位的Δr(在图3中针对第一示范性实施例示出的)必须满足以下条件：

其中，p是整数。

区函数K(x,y)可以通过添加高次项来改进，高次项取决于坐标x和y以便补偿当高NA的射束由聚焦光学器件7a聚焦以形成对象4a内的线焦点LF

在另外的备选实施例中，衍射光学元件13被配置为使得聚焦光学器件7a将子射束8a、9a聚焦到对象4内的多个线焦点中。发明人已经示出，这可以例如通过以下来实现：添加上文已经描述的相位轮廓W(x,y)，通过添加衍射平面内的二重旋转对称的相位轮廓W

W

其将点焦点变换为对象内的线焦点。特别地，具有二重旋转对称的相位轮廓W

发明人还已经示出，相位轮廓W

通过范例，根据示范性实施例，相位轮廓W

其中，c是常量，使得W

其中，λ是波长，A是常量，并且sinc(x)被定义为sinc(x)＝sin(x)/x。x

根据该表达式得出，如沿着线焦点的纵轴看到的，峰值强度随着

发明人还已经示出，可能的是，适配衍射光学元件13a的相位轮廓W

(即，单变量多项式，其包括2和4次项)导致峰值强度和线宽度的较小变化。值w是针对线焦点的长度的量度，因为2w实质上等于线焦点的长度。可以设想，W

在该方程中，参数p(其是针对2次项与4次项的系数的比的量度)在-3与-10之间的范围内，或在-4与-8之间的范围内。发明人已经示出，如果p具有-6的值，则提供特别有利的配置。

发明人还已经示出，额外地或者备选地，如果二次项

因此，已经由发明人示出，通过使用包括或者表示或实质上表示等于或大于4次的单变量项或单变量多项式，可以获得沿着线焦点的纵轴的更均匀的强度和线宽度。这允许实现沿着纵轴的经改进的均匀分辨率以及图像强度的经改进的均匀动态范围。然而，还已经示出-取决于应用-成像系统的足够性能可以使用相位轮廓W

在其中点焦点或线焦点在对象内生成的另外的备选实施例中，衍射光学元件13a被配置为具有以下区函数：

其中，n是样本的折射率，F是聚焦光学器件7a的物侧焦距(即，针对照明光的部分的焦距，其朝向对象内的焦点会聚)，并且x和y是衍射光学元件13a的衍射平面中的坐标。

已经由发明人示出，以上区函数生成多个焦点并且还提供针对由聚焦光学器件7a引起的球面像差的校正，使得聚焦光学器件7a可以被配置为具有比较高的数值孔径。

特别地，已经由发明人示出，以上区函数允许针对聚焦光学器件7a的球面像差的校正，聚焦光学器件7a被配置为具有对象处的数值孔径，其大于或等于0.25、或大于或等于0.5。球面像差可以至少部分地由聚焦光学器件7a引起，特别地由聚焦光学器件的物镜引起。换句话说，衍射光学元件13a被配置为至少部分地补偿聚焦光学器件7a的球面像差，其中，球面像差影响焦点的至少部分的形状和/或位置。

另外，影响两个或更多焦点的形状和/或线宽度的球面像差可以是针对焦点中的每个不同的。这使得难以使用被配置为校正球面像差的一个值的单个校正器补偿针对所有焦点的球面像差。然而，发明人已经示出，使用一个或多个衍射光学元件，特别地通过使用以上区函数，允许针对焦点中的每个的不同数量的球面像差的补偿。

此外，发明人还已经示出，用于校正球面像差的以上区函数可以与二重旋转对称的相位轮廓W

其中，K(x,y)是得到W

本公开还适用于常规图像传感器，包括相邻像素的2D阵列而不是空间分离线传感器元件的集合，但是仍然以角∝

如在以下中解释的，可以选择将幂分布在阶的有限集m＝m

特别地，发明人已经发现，适合的轮廓函数可以通过参数化轮廓函数f(t)并且使用数值搜索算法找到最佳参数来确定。针对提供阶上的幂的对称分布，即，η

当η

成本函数Z被定义为

其中，使用整数M≥N。现在，Z的最小值可以使用一般数值搜索算法针对参数c

图5是使用上文所描述的方法确定的轮廓函数f(t)的任意单元与衍射级(x轴)的照明光(y轴)的功率的直方图。如可以从图5看到的，可以针对11线获得最佳功率分布，这使用参数N＝5、K＝14、M＝15提供适合的方案。得到的轮廓函数f(t)将入射在衍射光学元件13a(图4所示的)上的照明光的射束3a的功率的87％集中到11个衍射级中。针对这些11个衍射级中的每个，相应衍射级的功率从这些11个衍射级的平均功率值变化小于5％。

图6是根据第三示范性实施例的显微成像系统1b的示意图。类似或者对应于图1至5所图示的第一和第二示范性实施例的部件的成像系统1b的部件标有相同附图标记但是继之以后缀字母“a”以避免混淆。

显微成像系统1b的射束倍增系统5b包括折射光学单元25b、26b的阵列19b，其中的每个接收由源2b提供的照明光的射束3b的分离部分。折射光学单元25b、26b中的每个被配置为聚焦照明光的射束3b的相应部分，从而形成子射束8b、9b之一。折射光学单元25b、26b中的每个被配置为圆柱透镜。针对折射光学单元25b、26b中的每个，相应折射光学单元25b、26b的光轴相对于入射在阵列19b上的照明光的射束3b的射束轴倾斜。

离开相应折射光学单元25b、26b的子射束8b、9b中的每个由相应折射光学单元25b、26b聚焦以形成阵列19b与适配光学器件24b之间的区域中的线焦点，使得线焦点相对于彼此移位轴向距离Δz

尽管在以上示范性实施例中所描述的显微成像系统被配置为扫描共焦显微镜系统，但是应理解，本发明不限于这样的系统。特别地，可以设想，本公开的教导被用于不提供扫描功能和/或不依赖于共焦探测的显微镜系统。通过范例，显微成像系统可以被配置为检查位于不同深度处的对象内的两个选择位置处的反射率和/或荧光发射，使得无扫描功能被要求。另外，如果存在针对轴向分辨率的低要求，则在不使用探测光的共焦滤波的情况下探测探测光是可以设想的。

如所描述的以上实施例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明的技术方法。尽管参考优选实施例详细描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，本发明的技术方法可以修改或者同样替换而不脱离本发明的权利要求的保护范围。在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或者步骤，并且词语“一”或“一个”不排除多个。权利要求中的任何附图标记不应当被解释为对范围的限制。