一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及工业领域，尤其涉及一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法。

背景技术

乳酸乳球菌用于生产各种发酵乳制品，每年大约有1亿吨牛奶接种了乳球菌。乳酸乳球菌最初被纳入链球菌属，1985年被重新分类为乳球菌属(Song et al.(2017)MicrobCell Fact 16:139)。乳酸乳球菌分为三个亚种，其中乳源的有乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)，还有分离自叶蝉的乳酸乳球菌霍氏亚种(L.lactis subsp.hordniae)(Parapouli et al. (2013)Appl Environ Microbiol 79:3476-3484)。乳酸乳球菌主要通过表型特征(生理生化、细胞壁组成、蛋白质印记等)和基因特征(与已知菌相比较，从而得知分类位置)进行鉴定，其中遗传分析具有快速、准确、分辨率高的优点，已经成为乳酸乳球菌鉴定的主要方法。同时16S rRNA技术已经普遍用于乳酸乳球菌的分离和鉴定。迄今已发表了数百个菌株和变异体(Duwat et al.(2011)J Bacteriol 83:4509-4516)。乳酸乳球菌在食品发酵中已经使用了几个世纪，其中一些菌株通过产生细菌素用于食品的防腐。

抗菌肽Nisin是几种革兰氏阳性兼性厌氧菌乳酸乳球菌在生长过程中产生的小肽，是一种由34个氨基酸残基组成的多肽(Liu and Hansen(1990)Appl EnvironMicrobiol 56:2551-2558)。该肽能有效抑制或杀死大多数革兰氏阳性菌，并能阻止孢子的生长(如单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌和黄色微球菌(Hampikyan(2009)J Food Prot 72:1739-1743)。由于其优越的抗菌活性和没有毒副作用,Nisin一直被视为一个安全有效的食品级生物防腐剂和添加剂,并广泛应用于食品工业,主要在乳制品、肉类产品、罐头和其他加工食品(Delves-Broughton et al.(1996)AntonieVan Leeuwenhoek 69:193-202)中。由于它对动物无毒，世界卫生组织(1969 年)和食品和药物管理局(FDA)在1988年批准Nisin用于食品添加剂。

Nisin在生物医学领域的潜在应用前景已经被报道(Shin et al. (2016)J ApplMicrobiol 120:1449-1465)。有研究已验证了Nisin作为一种潜在的治疗药物的多种应用方式。例如，Nisin具有类似于人类防御肽的免疫调节特性，Nisin可以作为一种新的免疫调节治疗药物发挥作用。此外，Nisin对治疗头颈部鳞状细胞癌也有一定效果。

Nisin是由一组11个基因参与合成的多肽。基因簇包括结构基因 (nisA/Z)；参与翻译后修饰(nisB,nisC)、转运(nisT)和细胞外前体加工 (nisP)的基因；编码对生产株(nisI,nisFEG)免疫的基因；而调节基因属于双组分自调节系统，由响应调节(nisR)和组氨酸激酶(nisK)组成 (Kuipers et al.(1995)J Biol Chem 270:27299-27304)。深入研究Nisin 生物合成过程及其代谢调节是实现提高Nisin产量的先决条件。Kim 通过引入含有免疫基因的质粒增加了Nisin耐药性，Nisin产量和水平略有提高(Kim et al.(1998)ApplMicrobiol Biotechnol 50:429-433)。

以往的研究表明，增加Nisin生物合成中关键基因拷贝数，可以增加Nisin产量(Niet al.(2017)Probiotics Antimicrob Protein 9: 204-212))。同样，在生产细胞中，增加参与Nisin生物合成的调控和耐药基因(nisRK,nisFEG)的拷贝数，也被发现可以显著提高Nisin的产量。

因此，通过分子表征和序列转化评价，来分析提高Nisin的产量的方法。该专利描述了如何使用涉及Nisin前肽合成和双组分信号转导的基因高表达来增加Nisin的产量。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种更加可靠，满足设计要求的一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法，将野生型乳酸乳球菌菌株中的nisA和nisRK基因克隆到高拷贝数载体中，将得到的质粒pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK通过单重和三重转化导入乳酸乳球菌。

进一步地，以大肠杆菌DH5a亚型为宿主菌株，进行了质粒的克隆和构建；在培养基中培养大肠杆菌DH5a；利用锥形瓶分批发酵乳酸乳球菌菌株，锥形瓶内包含LM17介质；在30℃，100rpm/min条件下培养18h,培养过程中控制PH；重组菌株的培养基中添加抗生素，大肠杆菌DH5a和乳酸乳球菌培养基中红霉素的用量分别为250μg/ml 和5μg/ml；提取乳酸乳球菌的染色体DNA；从提取的基因组DNA 中，通过聚合酶链式反应，扩增出乳酸乳酸链球菌素生物合成途径中涉及前体合成和调控的nisA和nisRK基因片段；构建重组表达质粒 nisA和nisRK，使用试剂盒将两个含有同源序列的PCR片段按照顺序亚克隆至载体pMG36e上；将重组质粒转化至CaCl

有益之处：本申请实施例的有益效果是：本申请实施例通过在乳酸乳球菌中引入含有nisRK的多拷贝质粒来提高Nisin的产量。我们设计了携带nisA和nisRK基因的表达质粒，并将工程质粒转入野生型菌株。Nisin作为一种信号分子，可通过双组分信号转导诱导Nisin 生物合成基因簇的转录，该信号转导由一个响应调节因子和一个指定 nisRK基因的组氨酸激酶组成；在野生型菌株内转化nisA和nisRK多拷贝基因后，其Nisin产量显著提高。

附图说明

图1(a)为本发明的野生型乳酸乳球菌菌株的发酵概况中乳酸乳酸链球菌素生产图；

图1(b)为本发明的野生型乳酸乳球菌菌株的发酵概况中菌体生长曲线；

图1(c)为本发明的野生型乳酸乳球菌菌株的发酵概况中摇瓶中培养物的pH值；

图2为本发明利用qRT-PCR对乳酸乳球菌菌株中乳酸链球菌素生物合成相关基因的转录分析；

图3(a)为本发明用qRT-PCR对野生型和工程型乳酸乳球菌菌株nisA基因的转录分析以16S rRNA基因为内控基因；

图3(b)为本发明用qRT-PCR对野生型和工程型乳酸乳球菌菌株nisR基因的转录分析以16S rRNA基因为内控基因；

图3(c)为本发明用qRT-PCR对野生型和工程型乳酸乳球菌菌株nisK基因的转录分析以16S rRNA基因为内控基因；

图4(a)为本发明野生型乳酸乳球菌在30℃静态瓶培养、LM17 肉汁和不加控制的pH.细胞生长(a)和Nisin生产(b)r图；

图4(b)为本发明工程型乳酸乳球菌在30℃静态瓶培养、LM17 肉汁和不加控制的pH.细胞生长(a)和Nisin生产(b)r图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明中，野生型乳酸乳球菌菌株中的nisR和nisK基因表达水平较低。因此，我们试图通过在乳酸乳球菌中引入含有nisRK的多拷贝质粒来提高Nisin的产量。我们设计了携带nisA和nisRK基因的表达质粒，并将工程质粒转入野生型菌株。Nisin作为一种信号分子，可通过双组分信号转导诱导Nisin生物合成基因簇的转录，该信号转导由一个响应调节因子和一个指定nisRK基因的组氨酸激酶组成。

为了提高Nisin的表达，将nisA和nisRK基因克隆到高拷贝数载体中。将得到的质粒pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK通过单重和三重转化导入乳酸乳球菌。与单一转化菌株和野生型菌株相比，通过再转化野生型菌株获得的工程菌株表达量最高。通过数据分析得知，nisA 和nisRK基因在工程菌株中的高表达水平能够增加Nisin产量。我们成功地获得了高产量的菌株，而且摇瓶中培养发现，该工程菌株遗传稳定性好。表达多拷贝nisRK的细胞产生Nisin的机制可能是由于 Nisin前体结构基因转录水平的初始增加引起的。因此，最初增加的 Nisin可以作为信号分子，通过双组分信号转导系统后，菌株会产生更多的Nisin。特别是细胞包膜内NisK蛋白(一种传感器蛋白)数量的增加可能会增加Nisin对nisA基因转录的诱导。

通过对野生型菌株进行基因再转化，通过nisA和nisRK基因的过表达，显著提高了Nisin产量。研究结果为Nisin的大规模工业化生产提供了一种提高Nisin产量的方法。为下一步开展高产工程菌株大规模发酵条件的优化提供了研究基础。

野生型乳酸乳球菌菌株的发酵概况。

以美国Invitrogen公司的大肠杆菌DH5a亚型为宿主菌株，进行了质粒的克隆和构建。在LB培养基(Difco)中培养大肠杆菌DH5a， 37℃，180rpm/min。250毫升锥形瓶分批发酵乳酸乳球菌菌株，包含 50毫升LM17介质(Difco)(蔗糖30g/L,胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，KH

按照“Wizard Genomic DNA”纯化试剂盒(Promega,Madison,USA) 说明书提取乳酸乳球菌的染色体DNA。从提取的基因组DNA中，通过聚合酶链式反应，使用表2所列引物，扩增出Nisin生物合成途径中涉及前体合成和调控的nisA和nisRK基因片段。构建重组表达质粒pMG36e:nisA(nisA)和pMG36e:nisRK(nisRK)，使用In Fusion HD 克隆试剂盒(TAKARA,Japan)将两个含有同源序列的PCR片段按照顺序亚克隆至载体pMG36e上。将重组质粒转化至0.1M CaCl

测定野生型乳酸乳球菌菌株在不同时间点的发酵特性。培养22 小时后发酵液Nisin活性为324IU/ml。12小时后，细胞生长达到最大的光密度为1.81。此外，结束发酵后，发酵液pH值为4.5(Figure 1)。野生型乳酸乳球菌乳酸链球菌素生物合成相关基因的转录分析。

根据产品说明书，使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)分离总 RNA。使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) 合成cDNA。实验所用引物见表1。实时定量PCR采用Rotor-Gene Q(Qiagen,Hilden,Germany)和SYBR Green定量PCR试剂盒(Qiagen, Germany)。实时定量PCR条件如下:95℃预变性15分钟，95℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延长30秒，共40个循环。使用 Q-Gene软件。将基因的相对水平以规范化表达处理。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,Inc,city,California)对数据进行单因素方差分析。均数间采用Tukey多重比较检验，P<0.05时存在显著性差异。

表1所用引物一览表

对乳酸乳球菌野生型菌株Nisin生物合成相关基因的表达谱进行了评价。我们发现，大多数涉及Nisin生物合成的靶基因表现出不平等的转录水平。nisI、nisF、nisG基因表达水平较高，nisR和nisK基因在不同的分析时间点均表现为低表达，nisA基因表达呈减少趋势 (图2)。这些结果表明，与Nisin生物合成相关的基因表达水平存在不均衡的差异，增加低表达基因的表达量会促进Nisin的生产。根据这一结果，我们选择了参与前体合成的nisA基因和双组分信号转导的基因(nisRK)，在乳酸乳球菌野生型菌株中进行进一步的遗传转化。 nisA、nisR和nisK基因在野生型和工程型乳酸乳球菌中的转录分析

根据产品说明，使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取总 RNA。使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) 合成cDNA。实验所用引物见表1。实时定量PCR采用Rotor-Gene Q(Qiagen,Hilden,Germany)和SYBR Green定量PCR试剂盒(Qiagen, Germany)进行。实时定量PCR条件如下:95℃预变性15分钟，95℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延长30秒，共40个循环。使用 Q-Gene软件。将基因的相对表达水平规范化处理。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,Inc,city,California)对数据进行单因素方差分析。均数间采用Tukey多重比较检验，P<0.05时存在显著性差异。

将nisA和nisRK基因通过单重和三重转化导入乳酸乳球菌菌株，通过酶切和DNA测序，我们成功获得了携带目的基因的重组质粒 (pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK)。采用电转化的方法构建了含有不同多拷贝质粒的工程菌株，并进行了多次单菌落筛选和纯化。将从转化子中提取的质粒与原菌株进行测序和比较，以证实转化的正确性。我们发现，通过单次转化获得的工程乳酸乳球菌菌株中涉及Nisin生物合成的靶基因(nisA和nisRK)的转录水平高于原菌株。值得关注的是，与野生型菌株相比，经过三重遗传转化后获得的转基因乳酸乳球菌中的基因表现出了显著的高转录水平(图3)。

乳酸乳球菌工程菌株的Nisin产量。

基于已发表的方法，采用RP-HPLC测定nisin浓度[1,4]。RP-HPLC 使用Waterse2695分离模块和Waters 2489紫外/可见检测器，在Waters Empower软件(Waters，都柏林，爱尔兰)上运行，使用Phenomenex(英国Macclesfield)提供的5μm,300A,250mm×4.6mm的反向Jupiter C18柱进行分析。溶剂A为0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)(Sigma-Aldrich, Arklow，爱尔兰)，溶剂B为含有0.1％TFA(v/v)的90％(v/v)色谱级乙腈(Thermo FisherScientific,Dublin，爱尔兰)。以1.0mL/min的流速运行，在30分钟内从22.2％B到55.6％B的线性梯度。在214nm处用吸光度法检测Nisin，其峰值对应于约36％的乙腈的峰值。使用Nisin 标准品(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)生成标准曲线，从214nm处的峰面积计算Nisin的含量。

利用600nm光密度法测定工程菌株的生长和代谢水平。含质粒 pMG36e:nisA、pMG36e:nisA RT、pMG36e:nisRK和pMG36e:nisRK RT 乳酸乳球菌工程菌株与野生型菌株的细胞生长密度接近，说明对菌株的生长没有影响(图4)。摇瓶22小时后，在摇瓶中对野生型菌株和工程菌株(pMG36e:nisA,pMG36e:nisA RT,pMG36e:nisRK和 pMG36e:nisRK RT)的Nisin产量分别进行HPLC测定。野生型和转化菌株单重和三重转化空质粒均能产生相似的Nisin，说明空质粒 pMG36e的引入并没有影响Nisin的产生。而pMG36e:nisA和 pMG36e:nisRK菌株在22小时后，与生产能力为169.3IU/ml的野生型菌株相比，Nisin的产量较高，分别为442.5IU/ml和369.2IU/ml。

在这些工程菌株中，pMG36e:nisA RT(1111.5IU/ml)和 pMG36e:nisRK RT(1041.5IU/ml)的nisin产量增幅最大(图4)，说明经三次再转化的工程菌株对nisin产量有积极的影响。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。