同时解析多种抗体同种型的高特异性和灵敏度免疫吸附诊断测定

交叉引用

本专利申请案主张于2018年10月1日提交的第62/739,626号美国临时专利申请案以及于2019年6月17日提交的第62/862,397号美国临时专利申请案的优先权，上述专利申请案全文以引用方式并入本文中。

背景技术

病原体感染的临床检测需要直接检测来自受感染个体的生物学标本中的病原体或间接检测病原体特异性抗体。对于难以通过直接病原体测试检测到的感染(例如，在病原体数量非常少或难以进行组织采样的情况下)，检测病原体特异性抗体是一种更为可靠的诊断测试方法。

用于检测病原体特异性抗体的常规诊断法通常依赖于酶联免疫吸附测定法或蛋白免疫印迹法，其利用病原体裂解物或特定病原体蛋白/肽以与病原体特异性抗体结合，并使它们与病原体或病原体蛋白络合，从而进行下游检测。但是，这些策略具有明显的局限性。使用病原体裂解物时，针对所有种类的病原体所共有的高度保守的内部蛋白，引入了与抗体的非特异性相互作用。另一方面，仅使用一种特定蛋白或肽时，可以专门检测一种特殊亚种，这导致许多感染诊断被遗漏。此外，常规免疫吸附测定法显示并未如同在病原体表面上一般保持其天然构象的蛋白或蛋白肽。

另外，适用于病原体特异性抗体的常规间接测试通常仅测定大部分IgG或IgM和IgG，并且可能遗漏其他主要同种型，例如IgD、IgM、IgA、IgE和IgG，其可以进一步细分为进一步含有多种同种异型的亚类。例如，同种型IgA还含有亚型IgA2，其含有同种异型IgA2m3。不同的同种异型和亚类可以通过免疫系统发挥不同的下游效应子功能。

莱姆病是由细菌伯氏疏螺旋体所引起，这种细菌的数量可能非常少，并且难以直接从组织中采样。因此，莱姆病需要基于感染者所产生的抗体进行间接测试。但是，目前用于此目的的诊断法存在缺陷。感染莱姆病后，在接受当前方法测试的人中，有超过半数的人在感染后前几周的最关键早期治疗窗口期的测试结果呈阴性(参见Branda等人(2018))。

当前用于检测疏螺旋体感染的诊断方法是一种2级方案，其需要酶联免疫吸附测定(ELISA)或间接荧光抗体，然后(如有反应)用蛋白免疫印迹法测定免疫球蛋白M和免疫球蛋白G。这些测定法采用细菌裂解物，其无法维持关键的结合表位，并且通过显示胞内蛋白而无需引入非特异性。蛋白免疫印迹法组成部分进一步引入了对早期感染的主观解释和低灵敏度。

用于检测数量非常少或难以进行组织采样的病原体的改良方法具有重大临床意义。开发和改良灵敏且准确的诊断法对于更深入地了解这些疾病并实现靶向治疗方法的设计内容至关重要。本发明解决了这一问题。

出版物

Benach,J.L.等人，1986.莱姆病患者对螺旋体抗原产生的IgE应答.Zentralblattfür Bakteriologie,Mikrobiologie und Hygiene.A系列：医学微生物学，传染病，病毒学，寄生虫学，263(1–2)，第127–132页.

Bluth,M.H.等人，2007.患有莱姆病的儿童体内的IgE抗伯氏疏螺旋体组分(p18、p31、p34、p41、p45、p60)以及增加的血液中的CD8+CD60+ T细胞。斯堪的纳维亚免疫学杂志，65(4)，第376–382页.

Branda,J.A.等人，莱姆病血清学诊断测试取得进展已近在咫尺。临床传染病VIEWPOINTS·CID，2018，第1133页.

Irani,V.等人，2015.人IgG亚类的分子特性及其对设计针对传染病的治疗性单克隆抗体的意义。分子免疫学，67(2)，第171–182页.

Tjernberg,I.等人，2017.IgE对莱姆疏螺旋体病相关α-Gal的反应性PloS one，12(9)，p.e0185723.

发明内容

本发明提供了用于分析感染的抗体应答以及鉴定个体中的传染性病原体的组合物和方法。所述方法允许同时分析受感染个体中的多种病原体特异性抗体同种型。在所述方法中，使显示出多种病原体蛋白/表位(例如，诊断测试病原体或抗原阵列)的诊断性诱饵与来自个体的含有抗体的样本(包括但不限于血液样本及其衍生物)接触。洗去所述诊断性诱饵中未结合的抗体，并用一种或更多种同种型特异性或糖基化特异性标记试剂染色，其中所述试剂与可检测部分(例如，金属、比色、荧光团等)可操作地连接。分析如此标记的诊断性诱饵，了解病原体特异性抗体水平和抗体同种型分布。所述方法允许同时分析来自受感染个体的多种病原体特异性抗体同种型。鉴定所述病原体特异性抗体，并了解对所述病原体产生的免疫应答的性质，以便针对所述个体进行适当的疗法选择。

在一方面，提供了表征个体对病原体产生的免疫应答的方法，所述方法包含：a)从所述个体中采集至少一个含有抗体的样本；b)使来自所述个体的所述至少一个含有抗体的样本与显示出多种病原体抗原的诊断性诱饵接触；c)使所述诊断性诱饵与一种或更多种同种型特异性或糖基化特异性试剂接触，其中所述试剂与可检测部分可操作地连接；以及d)分析所述诊断性诱饵中是否存在结合的同种型特异性或糖基化特异性试剂，从而确定病原体特异性抗体的存在和类型，其中所述存在和类型指示病原体感染和免疫应答。

在一些实施例中，方法包含在一段时间内通过在多个时间点重复步骤a)-d)来监测所述个体对所述病原体产生的免疫应答。例如，可以在第一时间点从所述个体中采集第一含有抗体的样本，并且可以在稍后的第二时间点从所述个体中采集第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二样本中一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述病原体引起的所述感染正在恶化；以及若检测到所述第二样本中一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述病原体引起的所述感染正在好转。连续采样可用于检测随着时间的流逝对所述病原体产生的免疫应答的差异，这揭示了指示感染的变化。当个体中的所述病原体水平最初处于难以检测的极低水平时，连续采样可能尤为有用，其中与仅在单个时间点采集样本相比，连续采样使得区分受感染个体与未感染个体更加容易。

在一些实施例中，方法进一步包含监测用于治疗病原体引起的感染的疗法的疗效，其中在所述患者接受所述疗法之前从所述个体中采集所述第一含有抗体的样本，并且在所述患者接受所述疗法之后从所述个体中采集所述第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述病原体引起的所述感染正在恶化或对所述疗法无反应；以及若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述病原体引起的所述感染正在好转。

在一些实施例中，所述诊断性诱饵是诊断性病原体，例如，完整病原体。所述诊断性病原体可以是细胞病原体，例如，细菌、真菌和原生动物等，包括，例如螺旋体，例如伯氏疏螺旋体；真菌病原体，例如烟曲霉菌、黄曲霉菌；原生动物，例如刚地弓形虫、恶性疟原虫；等等。例如，所述诊断性病原体可以是临床分离株或环境分离株，或者源自于细胞系或细胞培养物。

在一些实施例中，诊断性病原体经基因修饰以表达荧光团，包括但不限于荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)及其类似物，包括EGFP、EYFP、mYFP、Citrine、ECFP、mCFP、Cerulean、EBFP等。

在一些实施例中，诊断性病原体经进一步基因修饰，以消除在病原体中高度保守的蛋白和其他表位的表达，从而减少与所述诊断性病原体的非特异性结合。在一些实施例中，所述保守的表位存在于细胞表面蛋白上。在一些实施例中，所述表位存在于在所述病原体类别(例如，鞭毛细菌中；螺旋体中；等等)中高度保守的细胞表面蛋白中。在一些实施例中，所述高度保守的蛋白是鞭毛，包括但不限于疏螺旋体的fliH和/或fliI蛋白。在一些实施例中，所述诊断性病原体在于所述患者样本中的抗体结合并用同种型特异性或糖基化特异性试剂标记后失活。

在一些实施例中，所述诊断性诱饵是包含病原体蛋白或肽表位的抗原阵列。

在一些实施例中，所述已标记的诊断性诱饵(例如，病原体或包含病原体蛋白或肽表位的抗原阵列，其与同种型特异性或糖基化特异性试剂(包含可检测部分)结合)通过允许同时分析多个参数的方法进行分析，其中所述参数可以包括：与所述诊断性病原体结合的取得专利的抗体(例如，IgM、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgE等)的所述同种型分布；与所述诊断性病原体结合的抗体的所述糖基化分布；抗体结合的整体水平；等等。在一些实施例中，通过流式细胞术进行所述分析。在一些实施例中，通过大量细胞计数法或显微镜检查进行所述分析。

在一些实施例中，利用同时测量和比较所产生的抗体的不同亚型之间的比率所得到的结果来鉴定传染性病原体，以选择适当的治疗方案，例如，适于治疗传染性病原体相关病症的抗生素。所述感染分期还可以通过所述同种型分布来推断，其中若IgG亚类抗体相对于IgM类抗体有所增加，则指示更晚期的感染，所述分期可用于选择适当的治疗方案，例如，其中对于更为慢性的感染状态，可能需要采用其他药物、抗炎治疗等。对患者产生的传染源和免疫应答进行的评估可以改善护理水平，其中可以用适当的药物治疗根据反应性进行分类的患者。在实施例中，所述方法进一步包含基于所述分析来确定施用于所述受试者的疗程。

可以根据症状的最初表现对患者进行分类，并且可以在病程中对患者进行进一步监测，以维持适当的治疗，或者可以在疾病进展的任何适当分期对患者进行分类。在一些实施例中，所述方法进一步包含对所述个体进行治疗。在一些实施例中，病原体特异性IgE的存在允许采用不同的治疗干预，其中在检测到存在病原体特异性免疫球蛋白E(IgE)抗体的情况下，向所述个体施用/施以抗IgE疗法、肥大细胞稳定剂和抗组胺剂中的一种或更多种。在一些实施例中，所述抗组胺剂是H2拮抗剂。

在实施例中，所述方法在一台或更多台计算机上实现。

在实施例中，所述受试者是人类受试者。

在实施例中，确定个体对疫苗产生的免疫应答，以测试针对所述传染性病原体的保护性应答。在此类实施例中，所述疫苗免疫原与传染性病原体相对应。

在一些实施例中，提供了诊断患有莱姆病的个体的方法，所述方法包含：a)从所述个体中采集至少一个含有抗体的样本；b)使来自所述个体的所述至少一个含有抗体的样本与显示出多种伯氏疏螺旋体病原体抗原的诊断性诱饵接触；c)使所述诊断性诱饵与一种或更多种同种型特异性或糖基化特异性试剂接触，其中所述试剂与可检测部分可操作地连接；d)分析所述诊断性诱饵中是否存在结合的同种型特异性或糖基化特异性试剂，从而确定伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的存在和类型，其中所述存在和类型指示伯氏疏螺旋体感染以及对所述伯氏疏螺旋体病原体产生的免疫应答；以及e)在检测到存在一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的情况下，诊断所述个体患有莱姆病。

在一些实施例中，所述方法进一步包含在检测到存在一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的情况下，治疗所述个体所患的莱姆病。鉴定伯氏疏螺旋体病原体特异性IgE的存在，以便采用不同的治疗干预。在一些实施例中，在检测到存在病原体特异性免疫球蛋白E(IgE)抗体的情况下，向所述个体施用/施以抗IgE疗法、肥大细胞稳定剂和抗组胺剂中的一种或更多种。所述抗组胺剂可以抑制选自由H1、H2、H3和H4组成的群组的一种或更多种组胺受体。在一些实施例中，所述抗组胺剂是H2拮抗剂。在一些实施例中，所述方法进一步包含在检测到存在伯氏疏螺旋体病原体特异性IgE抗体的情况下，耗尽所述个体中的肥大细胞。例如，肥大细胞可以通过单独施以抗c-kit疗法或联合施以抗c-kit疗法和抗CD47疗法来耗尽。在一些实施例中，所述方法进一步包含施用抗生素。在一些实施例中，所述方法进一步包含在检测到存在伯氏疏螺旋体病原体特异性免疫球蛋白E(IgE)抗体的情况下，耗尽所述个体中产生IgE的B细胞。在一些实施例中，抗IgE疗法包含IgE阻断或使IgE特异性抗体与具有有益效应子功能的不同同种型连接。

在一些实施例中，所述方法进一步包含在一段时间内通过在多个时间点重复步骤a)-d)来监测所述个体对所述伯氏疏螺旋体病原体的免疫应答。例如，可以在第一时间点从所述个体中采集第一含有抗体的样本，并且可以在稍后的第二时间点从所述个体中采集第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二样本中一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的水平与所述第一样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述伯氏疏螺旋体病原体引起的所述感染正在恶化；以及若检测到所述第二样本中一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的水平与所述第一样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述伯氏疏螺旋体病原体引起的所述感染正在好转。在一些实施例中，所述方法进一步包含监测用于治疗莱姆病的疗法的疗效，其中在所述患者接受所述疗法之前从所述个体中收集所述第一含有抗体的样本，并且在所述患者接受所述疗法之后从所述个体中收集所述第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述莱姆病正在恶化或对所述疗法无反应；以及若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述莱姆病正在好转。

在另一实施例中，提供了用于本文所述的方法中的伯氏疏螺旋体诊断性病原体。

在另一实施例中，提供了包含伯氏疏螺旋体诊断性病原体以及一种或更多种用于检测伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的同种型特异性或糖基化特异性试剂的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测伯氏疏螺旋体病原体特异性IgE抗体的IgE特异性试剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含抗组胺剂、肥大细胞稳定剂或抗IgE治疗剂中的一种或更多种。

附图说明

结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：

图1展示了诊断性免疫吸附测定的示意图。用来自受感染或未感染宿主的血清温育经基因修饰以表达GFP(Bb-GFP)的伯氏疏螺旋体。接着，用一组荧光标记的同种型特异性二抗探测这些Bb特异性抗体。然后，采用流式细胞术评估这些Bb的细菌杀灭作用(GFP缺失)、聚集体形成的大小以及与螺旋体结合的各种抗体的水平。

图2A-2E展示了疏螺旋体特异性免疫应答的代表性分析以及感染状况影响其的方式。图2A.在峰值炎症水平下的踝关节肿胀。图2B.疏螺旋体特异性抗体的滴度。图2C.抗体滴度与踝关节肿胀的关系图。图2D-2E.适用于IgG2a(图2D)和IgE(图2E)结合的血清来源比较。

图3A-3G提供了对感染的抗体应答的时程分析。图3A.抗体滴度在感染后2周的变化情况。图3B.感染后2周的IgG1分析。图3C.感染后2周的IgG2a分析。图3D.感染后2周的IgM分析。图3E.感染后2周的IgE分析。图3F.感染后2周的血清诱导形成的细菌凝集(由FACS分析评定)。图3G.Bb-GFP尺寸的FACS分析。

图4A-4B表明，感染后7天在C3H小鼠中可检测到对Bb感染的IgE抗体应答，但在C57BL/6小鼠中未检出。图4A展示了用10

图5表明，用西咪替丁(一种H2组胺受体拮抗剂)进行抗组胺剂治疗可减少踝关节肿胀和IgE结合。用10

图6A-6C展示了在将培养的Bb暴露于来自受感染动物的血清中时，不同于Bb杀菌性抗体杀灭的抗体和Bb-免疫复合物形式。如图1所示，用来自未感染或受感染动物的血清温育培养的Bb-GFP。相较于所述尺寸，检查GFP的荧光(前向散射-FSC)或许可以区分单螺旋体、团块、抗体诱导产生的Bb-免疫复合物(称为“超级团块”)以及仍表达或不再表达GFP的细菌。图6A展示了在含有6％兔血清的BSK-H培养基(Sigma)(含或不含来自未感染小鼠或已感染指定时间的小鼠的10μl血清)中温育过夜的10

图7A-7D提供了相较于疟疾(伯氏疟原虫ANKA(Pb-A))感染的红细胞，指定类型的抗体与未感染红细胞结合的分析。

图8A-8D提供了指定类型的抗体与来自烟曲霉菌感染的小鼠的血清结合的分析。

图9.将HA标记的重组疏螺旋体蛋白(p66、p16s和OspA)固定在Ni-NTA微珠上，接着用来自小鼠(伯氏疏螺旋体感染后第28天)的血清温育，然后探测结合的抗体同种型和亚型。针对每种蛋白类型展示了IgE和IgG1的相应情况。OspA的相应信息显示无IgE结合且IgG1结合率低，而p66和p16s均表现出有效的IgG1和IgE结合，这表明二抗谱分析还可以在微珠或芯片蛋白或肽阵列上进行。

图10.感染后7天在C3H小鼠中可检测到对Bb感染的IgE特异性抗体应答，但在C57BL/6小鼠中未检出。用10

图11.肥大细胞脱粒致使肿胀加剧。用10

实施方式

根据本文中的描述，本发明的这些特征和其他特征会变得更加显而易见。尽管结合各种实施例描述了本发明，但无意将本发明局限于此类实施例。相反，本领域技术人员应当理解，本发明涵盖各种替代方案、修改方案和等同方案。

本说明书中使用的大多数词语具有本领域技术人员针对这些词语提供的含义。本说明书中具体定义的词语具有在本发明的范围(作为整体)内提供的、本领域技术人员通常所理解的含义。如果在本领域对单词或短语的理解定义与本说明书中具体阐明的单词或短语的定义之间存在冲突，则以本说明书为准。

必须注意的是，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。

应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

在本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用方式并入本文中，犹如每一单独出版物或专利申请被具体地和单独地表明通过引用方式并入。

病原体。本文中使用的此术语是指在宿主动物中复制从而引发疾病的感染性生物，例如，细菌、真菌、原生动物、病毒等。在一些实施例中，所述病原体是细胞病原体，即，不同于病毒，例如，细菌、单细胞真菌、原生动物等。

病原菌物种可以是细菌、病毒、原生动物寄生虫、真菌物种等。细菌包括疏螺旋体属、布鲁氏菌属、密螺旋体属、分枝杆菌属、李斯特菌属、军团菌属、螺杆菌属、链球菌属、奈瑟菌属、梭菌属、葡萄球菌属或芽孢杆菌属；包括但不限于梅毒螺旋体、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、嗜肺军团菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、诺氏梭菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌等。

寄生虫病原体包括毛滴虫属、弓形体属、贾第虫属、隐孢子虫属、疟原虫属、利什曼原虫属、锥虫属、内阿米巴属、血吸虫属、丝虫属、蛔虫属、片形属；包括但不限于阴道毛滴虫、刚地弓形虫、肠贾第虫、小隐孢子虫、恶性疟原虫、克氏锥虫、痢疾变形虫、兰伯氏贾第虫、肝片吸虫等。

病原体在人类或非人类哺乳动物和禽类中可能具有感染性，例如，牲畜，例如牛、羊、猪、家禽；宠物，例如狗、猫、鸟；实验室试验动物，例如小鼠、大鼠、啮齿动物、非人灵长类动物；等等。感染可以是局部感染或全身感染，例如，皮肤、口腔、消化道、耳部等。

螺旋体是螺旋体门的成员，其含有独特的双层膜(双膜)细菌，其中大多数具有较长的螺旋卷曲细胞。螺旋体门与其他细菌门的区别在于其鞭毛(有时称之为轴丝)的位置，其鞭毛在周质空间内的细菌内膜与外膜之间纵向延伸。这些鞭毛会促使进行扭转运动，使螺旋体能够四处移动。

螺旋体门中的许多生物都会引发常见疾病。此门的病原性成员包括钩端螺旋体物种；伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体和阿弗西尼疏螺旋体(引发莱姆病)；回归热疏螺螺旋体和赫姆斯疏螺旋体(引起回归热)；梅毒螺旋体亚种(引发梅毒和雅司病)；结肠菌毛样短螺旋体和奥尔堡短螺旋体(引发肠道螺旋体病)。

蜱传疾病。在一些实施例中，所述方法分析个体样品，以寻找受蜱传寄生虫感染的证据。此类疾病和寄生虫包括但不限于无形体病(HGA)：细菌嗜吞噬细胞无形体；蜱传回归热：赫姆斯疏螺旋体、特里蜱疏螺旋体或/帕克氏疏螺旋体；科洛拉多蜱传热：科罗拉多蜱传热病毒；波瓦桑脑炎：玻瓦桑病毒；巴贝西虫病：巴贝西虫寄生虫；落基山热：立氏立克次体；埃里希体病(HME)：查菲埃立克体、伊氏埃立克体或鼠埃立克体欧克莱尔亚种。在此类实施例中，可以对每种诊断性病原体进行唯一标记，并且同时可以对诊断性病原体的混合物进行分析。

广义伯氏疏螺旋体是属于螺旋体科中的疏螺旋体属的一组螺旋体。所述螺旋体通过硬蜱科中的蜱虫在保虫宿主之间传播。人感染伯氏疏螺旋体可能引发莱姆病或莱姆疏螺旋体病，该疾病是北美和欧洲最常见的病媒传播疾病。本发明描述了疏螺旋体属中的40多个物种。这些包括在广义伯氏疏螺旋体复合物中的20种疏螺旋体物种以及与回归热相关的20多种疏螺旋体物种。疏螺旋体属具有原核生物所独有的某些遗传和表型特征。疏螺旋体细胞为螺旋形，其尺寸为0.2至0.5μm×10至30μm，这允许根据所有螺旋体的共同表型特征将其与其他真细菌轻易区分开来。此外，还可以根据形态性状(包括细胞螺旋的波长、有无端钩、细胞极的形状以及周质鞭毛的数量)，将疏螺旋体与其他病原性螺旋体(例如密螺旋体和钩端螺旋体)区分开来。但是，通过表型来区分疏螺旋体属中的不同物种几乎是不可能的。因此，不同疏螺旋体物种和菌株的鉴定和分化在很大程度上取决于对其遗传特征或血清学特征的分析。

五种已命名的疏螺旋体经常可以在人类患者中找到。这些人莱姆病的致病物是广义伯氏疏螺旋体(北美和欧洲)；伽氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、阿弗西尼疏螺旋体(欧洲和亚洲)；以及斯柏曼疏螺旋体(欧洲)。能够准确表征物种和物种内菌株的分型系统(例如，本文提供的分型系统)对于流行病学、临床和进化研究至关重要。

莱姆病。莱姆病是由伯氏疏螺旋体引起的蜱传播感染疾病。早期症状包括游走性红斑样皮疹，数周至数月后可能出现神经系统、心脏或关节方面的异常。在疾病早期阶段，诊断主要依靠临床表现，但通过本文所述的方法进行的血清学测试对于发生在疾病晚期的心脏、神经及风湿相关并发症的诊断是有帮助的。相应治疗采用如多西环素或头孢曲松等抗生素进行，并且在疾病晚期可能纳入其他药物。

莱姆病主要通过4种硬蜱在全球范围内传播：美国东北部及中北部的肩突硬蜱(鹿蜱)、美国西部的太平洋硬蜱、欧洲的篦子硬蜱、亚洲的全沟硬蜱。伯氏疏螺旋体经蜱咬部位进入皮肤。3至32天后，所述生物体在叮咬处周围的皮肤中局部迁移，经淋巴扩散，引起局部腺病，或者随血流扩散至脏器或皮肤其他部位。最初，炎症反应(游走性红斑)的出现早于感染的显著抗体应答(血清学转换)。

莱姆病分为三期：早期局部表现期、早期扩散期和晚期。早期与晚期之间常为无症状期。莱姆病的标志和最佳临床指标——游走性红斑(EM)是莱姆病的最初体征，至少有75％的患者出现此症状。开始时为蜱咬部位出现红斑或丘疹，通常见于四肢的近端或躯干(特别是股、臀和腋下)，通常在蜱咬后3至32天之间出现。病损区向周围扩展，中央与外周之间消退，形似“牛眼”，直径约为50cm。病损区中央可能形成暗色红斑，触诊有热感且有硬结。如不治疗，EM通常会在3至4周内消退。

当这种致病细菌在体内传播时，原发灶出现后数天或数周便会开始出现疾病的早期扩散症状。起病后不久，近半数未经治疗的患者出现多发性且通常较小的环状继发性皮肤病变，中央无硬结。这些继发性病变的活检标本培养物检测结果呈阳性，表明感染扩散。患者还会出现肌肉骨骼、流感样综合征，包括可能持续数周的不适、疲劳、寒战、发热、头痛、颈部僵硬、肌痛和关节痛。由于症状通常为非特异性症状，因此若无EM，往往会漏诊。症状的特点是间歇性及多变性，但不适和乏力可能会持续数周。一些患者出现纤维肌痛症状。在疾病晚期，已消退的皮肤病变可能会再次出现，但较轻微，有时会在复发性关节炎发作之前出现。

在EM出现数周至数月内，约15％的患者出现神经系统异常(通常在关节炎发生之前)，往往会持续数月，但通常可完全消退。最常见的异常是淋巴细胞性脑膜炎或脑膜脑炎、脑神经炎以及感觉性或运动性神经根神经病，它们可单独发生也可联合发生。在EM出现数周内，约8％的患者出现心肌异常。这些异常包括程度不同的房室传导阻滞(1度、文氏型或3度)，极少数出现心肌心包炎伴胸痛、射血分数下降和心脏肥大。

若莱姆病未经治疗，则会在初次感染后数月至数年进入疾病晚期。约60％的患者在起病(根据EM定义)后数月内(偶尔可达2年)发生关节炎。少数大关节，特别是膝关节可发生间歇性肿胀和疼痛，典型的可反复发作达数年之久。受累关节通常是肿甚于痛；常发热，但发红罕见。贝克氏囊肿可以形成并破裂。不适、乏力和低热可先于或伴随关节炎发作。约10％的患者膝关节受累为慢性。其他晚期症状(起病后数年发生)包括抗生素过敏性皮肤病变(慢性萎缩性肢端皮炎)和慢性中枢神经系统(CNS)异常、多发性神经病或伴有情感、记忆和睡眠障碍的隐晦脑病。

治疗替代方案可能随疾病分期而变化，但用药通常包括阿莫西林、多西环素和头孢曲松。在疾病晚期，抗生素可清除致病细菌，减轻大部分患者的关节炎。但是，即使在感染消除后，个体也可能由于持续存在炎症反应引发持续性关节炎，并且可能需要使用抗炎药进行进一步治疗。

可对内部检测到伯氏疏螺旋体特异性IgE抗体的个体施以抗IgE疗法、肥大细胞稳定剂或抗组胺剂，例如但不限于西咪替丁、雷尼替丁、苯那君、苯海拉明、氯雷他定、多塞平、噻普酰胺和氯苯丙酸。治疗还可以包括耗尽个体中的肥大细胞，使伯氏疏螺旋体特异性IgE抗体水平升高。例如，肥大细胞可以通过单独施以抗c-kit疗法或联合施以抗c-kit疗法和抗CD47疗法来耗尽。

术语“抗体”以广义使用，并且具体而言涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，前提是它们表现出所需的生物活性。抗体可以指存在于受感染个体中的病原体特异性血清抗体；并且还可以用作同种型或糖基化特异性标记剂。

“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键数目不同。每条重链和每条轻链也都具有规则排列的链间二硫桥。每条重链在一端均具有可变结构域(V

Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中其恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')

本文中使用的“抗体片段”及其所有语法变体被定义为完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中所述部分不含完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3和CH4，具体取决于抗体同种型)。

“分离的”抗体是指已经鉴定且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将所述抗体纯化至(1)经Lowry法测定，75％以上(按抗体重量计)，最优选80％、90％或99％以上(按重量计)，或(2)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。由于所述抗体的天然环境中至少有一种组分缺失，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

肥大细胞稳定药物抑制肥大细胞释放过敏介质，并且可供临床使用，例如，以防止过敏反应。肥大细胞因对引起过敏反应的物质产生超敏反应而在过敏性疾病中发挥作用，例如，释放预先形成的化学介质(例如组胺)、合成脂质介质(例如PG和LT)、产生细胞因子和趋化因子等。肥大细胞稳定剂可以常规剂量使用，以减少不良的肥大细胞活化。

最常用的肥大细胞稳定剂是色甘酸二钠，它能够抑制IgE依赖性肥大细胞活化。天然肥大细胞稳定剂包括，例如，木犀草素；香叶木素；槲皮素；非瑟素；山柰酚；银杏素；水飞蓟素；莨菪素；Scaporone；Artekeiskeanol；丝立尼亭；肉桂酸；鞣花酸；木兰醇和厚朴酚；白藜芦醇；虎杖苷；姜黄素；倒捻子素-α、-β和-γ；小白菊内酯；倍半萜内酯；单萜；青藤碱；吲哚啉；光溜海绵素；茶氨酸；等等。生物抑制剂还包括，例如，补体衍生的肽C3a以及由此衍生的C3a9肽。已鉴定出其他抗过敏肽，例如，LVA、LSY、RVS、ETI、TDG、RVV和GFW，其可抑制抗原刺激引起的RBL-2H3细胞中的β-己糖胺酶释放。

合成和半合成肥大细胞稳定剂在本领域中也是已知的。例如，茚满酮类倍半萜已经修饰，并且包括茚满酮、蕨素Z。合成稳定剂包括，例如，Compound 13、R112、ER-27317、U63A05、WHI-131、寄端霉素、米哚妥林(PKC412)、CP99994、K1、Ro 20-1724、咯利普兰和氰胍佐旦、富勒烯、Vacuolin-1、CMT-3、OR-1384、OR-1958、TLCK、TPCK、溴烯醇内酯(BEL)、西立伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀、尼洛替尼等。

术语抗组胺剂采用其常规含义，即，一类对抗体内组胺受体活性的药物，其可根据其作用的组胺受体进行细分。两个最大的抗组胺剂类别分别是H1抗组胺剂和H2抗组胺剂。H1抗组胺剂通过与机体内的肥大细胞、平滑肌和内皮细胞以及脑内的结节乳头核中的组胺H1受体结合来发挥作用。H2抗组胺剂主要在胃中与上胃肠道中的组胺H2受体结合。

大多数H1抗组胺剂是受体拮抗剂。在临床上，H1抗组胺剂可用于治疗过敏反应和肥大细胞相关病症。H1拮抗剂的示例包括：阿伐斯汀、氮卓斯汀、比拉斯汀、溴苯海拉明、溴苯那敏、布克利嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯苯海拉明、氯苯那敏、氯马斯汀、赛克利嗪、赛庚啶、地氯雷他定(Aerius)、右溴苯那敏、右旋氯苯吡胺、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羟嗪、左卡巴斯汀、左西替利嗪、氯雷他定、氯苯甲嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、

喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏、曲普利啶。反向H1激动剂包括，例如，左西替利嗪、地氯雷他定、吡拉明等。

H2抗组胺剂包括，例如，西咪替丁、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁、罗沙替丁、硫替丁等。

除非另有明确相反规定，否则本文描述和声明的术语“共轭物”被定义为通过将一个或更多个抗体片段与一个或更多个可检测部分共价连接而形成的异质分子。

“合适的条件”的含义应当取决于此术语的使用环境。也就是说，当与抗体结合使用时，该术语应表示允许抗体与其相应抗原结合的条件。当与使药剂与细胞接触的操作结合使用时，该术语应表示允许能够如此操作的药剂进入细胞并发挥其预期功能的条件。在一实施例中，本文中使用的术语“合适的条件”是指生理条件。

在本发明的范围内，“受试者”或“患者”通常是指哺乳动物。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表炎症动物模型的受试者。受试者可以是男性/雄性或女性/雌性。

本文中使用的术语“可检测部分”、“检测剂”和“可检测标记”可互换使用，是指能够检测的分子或物质，包括但不限于荧光剂、化学发光剂、发色团、生物发光蛋白、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、同位素标记物、半导体纳米颗粒、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、链霉亲和素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示出荧光的物质或其部分。可用于实施本发明的标记的具体示例包括但不限于荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、增强型GFP(EGFP)、超折叠GFP(sfGFP)、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2)、黄色荧光蛋白及其衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)、dsRed、eqFP611、Dronpa、TagRFPs、KFP、EosFP/IrisFP和Dendra；荧光染料，包括但不限于SYBR染料(例如SYBR green和SYBR gold)、CAL Fluor染料(例如CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610和CAL Fluor Red 635)、Quasar染料(例如Quasar 570、Quasar 670和Quasar 705)、Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 350、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 784)、花青染料(例如Cy 3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)荧光素、2',4',5',7'-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)、羧基荧光素(FAM)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)、六氯荧光素(HEX)、罗丹明、羧基-X-罗丹明(ROX)、四甲基罗丹明(TAMRA)、FITC、丹磺酰基、伞形酮、二甲基吖啶酯(DMAE)、Texas red、鲁米诺和量子点；以及酶，例如碱性磷酸酶(AP)、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo

“分析”包括通过测量样本中的标志物(例如，抗体同种型的存在与否)来确定与样本相关的一组值，并将这些测量值与来自同一受试者或其他对照受试者的样本或一组样本的测量值进行比较。本发明的标志物可通过本领域中已知的各种常规方法中的任何一种来分析。“分析”可包括进行统计分析，以诸如确定受试者是否感染了目的病原体、感染分期等。

在本发明的范围内，“样本”是指从受试者中分离出的任何生物学样本。样本可包括但不限于单个细胞或多个细胞、细胞碎片、体液等分试样、全血、血小板、血清、血浆、红细胞、白细胞或白血球、内皮细胞、组织活检、滑液、淋巴液、腹水和间质或细胞外液。术语“样本”还涵盖细胞之间的空间中的液体，包括龈沟液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰、精液、汗液、尿液或任何其他体液。

“血液样本”可以指全血或其任何部分，包括血细胞、红细胞、白细胞或白血球、血小板、血清和血浆。样本可通过以下方式从受试者中获得，所述方式包括但不限于静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针吸、灌洗、刮擦、手术切除或介入或本领域中已知的其他方式。

“数据集”是在所需条件下通过评估样本(或抽样总体)所得到的一组数值。所述数据集的值可通过以下方式获取：例如，通过实验从样本中获取测量值，并利用这些测量值构建数据集；或者，从服务提供商(例如实验室)处或从其中/上存储有数据集的数据库或服务器中获取所述数据集。类似地，术语“获取与样本相关联的数据集”涵盖获得通过至少一个样本确定的一组数据。获取数据集涵盖获取样本并处理样本，以通过实验确定数据，例如，通过本文所述的方法进行测量来确定。该短语还涵盖诸如从第三方(其已对样本进行处理，以通过实验确定数据集)处接收一组数据。另外，该短语涵盖从至少一个数据库或至少一份出版物或数据库与出版物的组合中挖掘数据。

在本发明的范围内，“测量”是指确定临床样本或源自受试者的样本中物质(通常为病原体特异性抗体)的存在与否、其数量、量或有效量(包括此类物质的存在与否或其浓度水平)；和/或基于对照品评定受试者临床参数的值或分类。

可根据预测性建模方法进行分类，所述建模方法会设置用于确定样本属于给定类别的概率的阈值。所述概率优选为至少50％、至少60％或至少70％或至少80％或更高。还可通过确定获取的数据集与参考数据集之间的比较是否有统计学上显著差异来进行分类。如有，则将从中获取数据集的样本归类为不属于参考数据集类别。相反，如果这种比较与参考数据集在统计学上无显著差异，则将从中取数据集的样本归类为属于参考数据集类别，即，是否存在感染、感染分期等。

可根据其提供特定值或值域的质量度量标准(例如AUC或准确度)的能力来评估预测能力。在一些实施例中，预期的质量阈值是以至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或更高的准确度来进行样品分类的预测模型。作为替代量度，预期的质量阈值可指以至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高的AUC(曲线下面积)来进行样品分类的预测模型。

本领域已知，可以“调整”预测模型的相对灵敏度和特异性以支持选择性度量或灵敏度度量，其中两个度量具有反比关系。可以调整如上所述的模型中的限制以提供选定的灵敏度或特异性水平，这取决于所执行的测试的特定要求。灵敏度和特异性中的一项或两项可以是至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高。

除非上下文明显指出，否则本发明的所有元素、步骤或特征均可与其他元素、步骤或特征以任何组合使用。

分子学和细胞生物化学的一般检查方法可参阅以下标准教材：分子克隆：实验室手册，第3版(Sambrook等人，Harbor Laboratory Press 2001)；精编分子生物学实验指南，第4版(编辑：Ausubel等人，John Wiley&Sons 1999)；蛋白质方法(Bollag等人，JohnWiley&Sons 1996)；用于基因治疗的非病毒载体(编辑：Wagner等人，Academic Press1999)；病毒载体(编辑：Kaplift和Loewy，Academic Press 1995)；免疫学方法手册(编辑：I.Lefkovits，Academic Press 1997)；细胞与组织培养：生物技术实验室程序(Doyle和Griffiths，John Wiley&Sons 1998)。本发明中提及的用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供货商处获得，例如，BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和Clontech。

为了包括本发明优选的实施方式，已根据发明人发现或提出的特定实施例来描述本发明。本领域技术人员应当理解，根据本发明所述，在不脱离本发明的预定范围的情况下，可对例举的特定实施例做出大量修改和变更。此外，出于对生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用种类或数量的情况下改变蛋白质的结构。所有这些修改都会包括在所附权利要求的范围内。

标的方法用于诊断或治疗目的。本文中使用的术语“治疗”用来指代预防复发和治疗既往病症。例如，可以通过在感染早期阶段施用所述药剂(即，通过具有高灵敏度的方法)来预防因感染引起的炎性疾病。特别受关注的是当前疾病的治疗，其中所述治疗可稳定或改善患者的临床症状。

方法

本发明提供了用于分析感染的抗体应答以及识别个体中的传染性病原体的方法。所述方法允许同时分析多种病原体特异性抗体同种型。在所述方法中，使显示出多种病原体抗原/表位或完整病原体的诊断性诱饵与来自个体的含有抗体的样本(包括但不限于血液样本及其衍生物)接触。洗去所述诊断性诱饵中未结合的抗体，并用一种或更多种同种型特异性或糖基化特异性标记试剂染色，其中所述试剂与可检测部分(例如，金属、比色、荧光团等)可操作地连接。分析如此标记的诊断性诱饵，了解病原体特异性抗体水平和抗体同种型分布。鉴定所述病原体特异性抗体，并了解对所述病原体产生的免疫应答的性质，以便针对所述个体进行适当的疗法选择。

在一些实施例中，所述诊断性诱饵是完整的活病原体(即，诊断性病原体)。所述诊断性病原体经基因修饰以表达荧光团，包括但不限于荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)及其类似物，包括EGFP、EYFP、mYFP、Citrine、ECFP、mCFP、Cerulean、EBFP等。所述诊断性病原体可以是与所述传染性病原体相同的物种，也可以是密切相关的物种，例如，所述诊断性病原体可以是疏螺旋体属中的一个物种，但是可以用来检测密切相关的疏螺旋体。

在一些实施例中，所述诊断性病原体经进一步基因修饰，以消除在病原体中高度保守的蛋白和其他表位的表达，从而减少与所述诊断性病原体的非特异性结合。在一些实施例中，所述表位存在于细胞表面蛋白上。在一些实施例中，所述表位存在于在所述病原体类别(例如，鞭毛细菌中；螺旋体中；等等)中高度保守的细胞表面蛋白中。在一些实施例中，所述高度保守的蛋白是鞭毛蛋白，包括但不限于疏螺旋体的fliH和/或fliI蛋白。

在一些实施例中，所述诊断性病原体在与所述同种型特异性和/或糖基化特异性标记试剂接触之前加以固定。例如，在某些实施例中，细胞病原体可以用一种或更多种交联剂(例如甲醛、戊二醛)或双官能连接子(例如乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS))固定；或者通过用醇(例如甲醇或乙醇)脱水固定。

在其他实施例中，所述诊断性诱饵是显示病原体蛋白或肽的抗原阵列。所述抗原阵列可与来自个体的含有抗体的样本接触，其中来自所述样本的病原体特异性抗体与所述抗原阵列的蛋白/肽上所显示的表位结合。抗原阵列可通过使用本领域所熟知的方法将病原体蛋白和/或肽固定在固体支持物上来生成。所述固体支持物可以包括，例如但不限于载玻片、塑料、金属、凝胶、膜、二氧化硅、微珠或纳米颗粒。可将此类抗原阵列设计成显示代表性数量的来自所述病原体蛋白质组的肽或蛋白，以及(尤其是)引起病理性炎性免疫应答的目的病原性蛋白。另外，所述阵列可以包含并非源自所述病原体的蛋白，以令其作为对照品。有关制作抗原阵列的方法的讨论内容，请参见，例如，Yuan等人.(2017)分子生物学方法.1654:271-227和Robinson(2006)化学生物学新见.10(1):67-72；其内容以引用方式并入本文。

在一些实施例中，所述已标记的诊断性诱饵通过允许同时分析多个参数的方法进行分析，其中所述参数可以包括：与所述诊断性病原体结合的取得专利的抗体(例如，IgM、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgE等)的所述同种型分布；与所述诊断性病原体结合的抗体的所述糖基化分布；抗体结合的整体水平；等等。

在本文提供的方法中，可以使用标记试剂混合物，其中每种试剂都对抗体同种型或糖基化模式具有特异性。混合物可以包含2、3、4、5、6、7、8或更多种不同的标记试剂。在一些实施例中，所述标记试剂是与可检测部分共轭的抗体，其中抗体与目的同种型或糖基化模式特异性结合。在其他实施例中，所述试剂是对同种型具有特异性的已标记的适配子，例如，以下出版物中所述的适配子：Ma等人，(2013)遗传学和分子研究，12(2):1399-410；或从Aptagen处购得的适配子；人免疫球蛋白G(IgG)(Apt 8)(ID#44)。

每种标记试剂通常用不同的标记来标记，例如，荧光团、金属等。通常选择一组荧光标记，以便采用FACS来鉴定它们，例如，FITC、BV650、eVolve 655、BV605、K-Orange、eF450、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、PE、FITC/AF488、APC-eF780、AF700和APC等基本等效的荧光团。可以使用这些标记的任何组合。

或者，可以使用大量细胞计数法。大量细胞计数法适合于同时检测一种以上的标记原子，从而允许进行多重标记检测，例如，至少3、4、5、10、20、30、32、40、50个，甚至是100种不同的标记原子。可以使用的标记原子包括任何通过ICP-MS可检测到且所述未标记样本中基本上不存在的物质。在优选实施例中，所述标记原子是过渡金属，例如稀土金属(15种镧系元素，加上钪和钇)。这17种元素提供了许多不同的同位素，其可以通过ICP-MS轻松区分。这些元素中的许多元素均可以富集同位素的形式提供，例如，钐具有6种稳定同位素，而钕具有7种稳定同位素，所有这些都可以富集形式提供。所述15种镧系元素提供至少37种具有非冗余唯一质量的同位素。适合用作标记原子的元素的示例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆、(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除稀土金属外，其他金属原子也适用于通过ICP-MS进行检测，例如，金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。

为了允许对同种型或糖基化结构进行差分检测，所述标记试剂应携带有不同的标记原子，以便可以通过ICP-MS来区分其信号。例如，在检测到十种不同的同种型的情况下，可以使用十种不同的抗体，每种抗体携带独特的标记，从而可以区分来自不同抗体的信号。

其他分析方法可以包括DNA序列条形码编码抗体的聚合酶链式反应(PCR)。PCR是一种使DNA的特定片段呈指数式扩增，以生成特定DNA序列的许多拷贝的技术。或者，序列条形码编码抗体可以通过对DNA条形码进行测序来加以分析。测序是确定DNA序列中的核苷酸排列顺序的过程。

抗体的比色或荧光标记可通过高维、多参数显微镜检查来检测，这有助于同时或依次检测多种不同的抗体。可以将其与DNA序列条形码编码抗体结合使用，以便依次成像和淬灭，从而鉴定出特定样本中2至50种(或可能甚至更多种)不同类型的抗体。

可以采用任何适宜的方案(例如，如上所述)，利用生物学样本产生针对病原体的免疫应答模式。所述读数可以是与测量相关的平均值、平均数、中值、方差或其他统计学或数学导出的值。通过直接比较相应的参考或对照模式，可以进一步细化标志物读数信息。可以在多个点上评估结合模式：确定数据矩阵中的任一点处是否存在统计学上显著变化；所述变化是结合增加还是结合减少；所述变化对于一种或更多种生理状态是否具有特异性；等等。在相同条件下针对各标志物获得的绝对值将显示出活生物体所固有的变异性，还可以反映出个体之间固有的变异性。

从待测定样本中获得对病原体的免疫应答模式后，将所述对病原体的免疫应答模式与参考或对照图谱进行比较，以针对从中获取所述样本/所述样本所属的患者的感染状态和分期进行预测。通常，与来自未受影响的正常来源的样本或一组样本进行比较。另外，参考或对照模式可以是从已知受感染的患者样本中获得的特征模式，因此可以是阳性参考或对照图谱。

可使用基于临床的标准来评估患者的感染和分期状态。为了鉴定出指示这些分期和子集的子集，统计测试会针对测试与对照图谱之间被视为具有显著性的表达、滴度或标志物浓度变化提供置信水平，其中所述对照图谱可用于反应性或非反应性。原始数据最初可以通过测量每种标志物的所述值来分析，通常是每种标志物重复两次、三次、四次或5-10次。

如果所述图谱内的所述参数值中的一个或更多个超过与预先定义的显著性水准相对应的限值，则认为测试数据集与对照数据集不同。

为了排序显著性，可以确定错误发现率(FDR)。首先，生成一组相异值的零分布。在一实施例中，对观察到的图谱中的值进行置换以创建偶然获得的相关系数的分布序列，从而创建相关系数的适当零分布集(参见Tusher等人，(2001)PNAS 98，5116-21，其内容以引用方式并入本文)。此分析算法目前可作为Microsoft Excel的软件“插件”使用，这被称为微阵列显著性分析(SAM)。通过以下方式获得零分布集：针对所有可用图谱排列各图谱中的值；计算所有图谱的成对相关系数；计算该排列的相关系数的概率密度函数；并重复该过程N次，其中N是大数目，通常为300。使用N分布，计算相关系数值计数的适当度量(平均值，中值等)，其值超过利用在给定显著性水平通过实验观察到的相似性值分布获得的(相似性)值。

FDR是预期的错误显著相关性的数量(根据大于从随机数据集中选择的Pearson相关性的相关性估计)与经验数据中大于该选择的Pearson相关性(显著相关性)的相关性的数量的比值。该分界相关性值可以应用于实验图谱之间的相关性。

对于SAM，Z分数表示数据集中方差的另一度量，并且等于X的值减去X的平均值，再除以标准差。Z分数阐明了单个数据点与正常数据分布的比较方式。Z分数不仅显示数据点是高于平均数还是低于平均数，而且还显示测量值的异常程度。标准偏差是数据集中每个值与该数据集中值的平均值之间的平均距离。

使用上述分布，选择一个置信水平以计算显著性。该方法用于确定相关系数的最低值，该值超过偶然获得的结果。使用这种方法，可以获得正相关、负相关或两者的阈值。使用该阈值，用户可以过滤成对相关系数的观察值并消除那些不超过阈值的值。此外，可以针对给定阈值估计假阳性率。对于每个单独的“随机相关”分布，可以找到观察值超出阈值范围的数量。此过程提供了一系列计数。序列的平均值和标准差提供了潜在假阳性的平均数及其标准差。

可以对数据进行非监督层次聚类，以揭示图谱之间的关系。例如，可以执行层次聚类，其中将Pearson相关性用作聚类度量。一种方法是在“监督学习”问题中将患者疾病数据集视为“学习样本”。CART是医学应用的标准(Singer(1999)保健学中的递归分区，Springer)，其可以通过将任何定性特征转换为定量特征进行修改；通过达到显著性水平对其进行排序，通过Hotelling T

可以使用的其他分析方法包括逻辑回归。一种逻辑回归的方法，Ruczinski(2003)，计算与图形统计杂志，12:475-512。逻辑回归类似于CART，因为它的分类器可以显示为二进制树。不同之处在于，每个节点都有比CART生成的简单“and”语句更通用的特征的Boolean语句。

另一种方法是最近的质心收缩法(Tibshirani(2002)PNAS 99:6567-72)。该技术类似于k-means，但其优点是通过缩小集群中心，可以自动选择功能(如lasso算法中的功能)，以便将注意力集中在少数信息丰富的功能上。该方法可作为微阵列预测分析(PAM)软件——Microsoft Excel的软件“插件”使用，并且已得到广泛应用。另外两组算法是随机森林(Breiman(2001)机器学习45:5-32)和MART(Hastie(2001)统计学习精要，Springer)。这两种方法已经是“委员会方法”因此，它们涉及对结果“投票”的预测因子。这些方法中的其中一些以斯坦福大学开发的“R”软件为基础，该软件提供了能够持续改进且不断更新的统计框架。

其他统计分析方法包括主成分分析、递归分区、预测算法、贝叶斯网络和神经网络。

这些统计工具适用于所有形式的血清学数据。其提供了一组易于确定，并且对于检测感染个体的不同分期以及对治疗的反应性非常有用的数据。还提供了对病原体的免疫应答的特征模式的数据库。此类数据库通常包含具有特定类型和阶段的免疫应答等的个体的特征模式，其中此类图谱如上所述。

分析和数据库存储可以在硬件或软件中，或者两者的组合中实现。在本发明的一个实施例中，提供了一种机器可读存储介质，该介质包括由机器可读数据编码的数据存储材料，当使用用所述数据的指令编程的机器时，该数据存储材料能够显示任何数据集和本发明的数据对比。这些数据可以用于多种目的，例如患者监测、初始诊断等。优选地，本发明通过在可编程计算机上执行的计算机程序实现，所述计算机包括处理器、数据存储系统(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)、至少一个输入设备和至少一个输出设备。程序代码应用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。以已知方式将输出信息应用于一个或更多个输出设备。计算机可以是例如常规设计的个人计算机、微型计算机或工作站。

每个程序都可以优选地用高级程序或面向对象的编程语言实现，以便与计算机系统通信。但是，如有必要，所述程序可以用汇编或机器语言实现。在任何情况下，所述语言都可以是编译或解释型语言。每个这样的计算机程序都可以优选地存储在通用或专用可编程计算机可读的存储介质或设备(例如ROM或磁盘)上，用于在计算机读取存储介质或设备以执行本文所述的程序时配置和操作计算机。所述系统也可被视为以配置有计算机程序的计算机可读存储介质的方式实现，其中配置的存储介质可使计算机以特定和预定义的方式操作以执行本文所述的功能。

用于输入和输出装置的各种结构格式可用于在本发明的基于计算机的系统中输入和输出信息。用于输出的一种格式是与可信库具有不同程度相似性的测试数据集。这种情况为技术人员提供了相似性排序，并确定了在测试模式中含有的相似性程度。

特征模式及其数据库可以在各种介质中提供以便于其使用。“介质”是指含有本发明的特征模式信息的制品。本发明的数据库可以记录在计算机可读介质中，例如，任何可以由计算机直接读取和访问的介质。这些介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；以及这些类别的混合体，如磁/光学存储介质。本领域技术人员可以轻易理解如何使用任何目前已知的计算机可读介质来创建包含当前数据库信息记录的制品。“记录”是指使用本领域已知的任何这样的方法将信息存储在计算机可读介质上的过程。基于用于访问存储信息的装置，可以选择任何适宜的数据存储结构。可以使用各种数据处理器程序和格式来存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。

在一些实施例中，在一段时间内通过在多个时间点重复步骤诊断方法的步骤来监测所述个体中对病原体的免疫应答。例如，可以在第一时间点从所述个体中采集第一含有抗体的样本，并且可以在第二时间点(稍后)从所述个体中采集第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二含有抗体的样本中一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述病原体引起的所述感染正在恶化；以及若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述病原体引起的所述感染正在好转。连续采样可用于检测随着时间的流逝对所述病原体产生的免疫应答的差异，这揭示了指示感染的变化。当个体中的所述病原体水平最初处于难以检测的极低水平时，从个体中对抗体水平进行连续采样可能尤为有用，其中与仅在单个时间点采集样本相比，连续采样使得区分受感染个体与未感染个体更加容易。

在一些实施例中，通过连续采样来监测通过使用本文所述的方法来治疗患者出现的感染的疗法的疗效。例如，可以在所述患者接受所述疗法之前从所述个体中采集第一含有抗体的样本，并且可以在所述患者接受所述疗法之后从所述个体中采集第二含有抗体的样本，其中若检测到所述第二含有抗体的样本中一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所提高，则表明所述病原体引起的所述感染正在恶化或对所述疗法无反应；以及若检测到所述第二含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的水平与所述第一含有抗体的样本中所述一种或更多种病原体特异性抗体的所述水平相比有所降低，则表明所述病原体引起的所述感染正在好转。

本文中使用的术语“抗生素”包括所有常用的抑菌和杀菌抗生素，通常口服给药。抗生素包括氨基糖苷类，例如丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素和妥布霉素；头孢菌素，例如头孢羟唑、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢甘酸、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林和头孢拉啶；大环内酯类，例如红霉素和醋竹桃霉素；青霉素，例如青霉素G、阿莫西林、氨比西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、非奈西林和替卡西林；多肽类抗生素，例如杆菌肽、甲磺酸粘菌素、粘菌素、多粘菌素B；四环素，例如氯四环素、地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、四环素和氧四环素；以及其他抗生素，例如氯霉素、克林霉素、环丝氨酸、林可霉素、利福平、壮观霉素、万古霉素和紫霉素。其他抗生素请见以下出版物：“雷明顿药物科学”，第16版(Mack Pub.Co.，1980)，第1121-1178页。

本文中使用的免疫抑制或免疫抑制方案是指用减少宿主免疫系统对自身抗原或移植物的免疫应答的试剂来治疗个体，例如移植受体。示例性免疫抑制方案在本文中提供了更为详细的描述。

主要的免疫抑制剂包括钙调磷酸酶抑制剂，其与结合蛋白结合以抑制钙调磷酸酶活性，并且包括例如他克莫司、环孢霉素A等。必须仔细监测环孢霉素和他克莫司的水平。起初，可以将所述水平保持在10-20ng/mL的范围内，但是3个月后，可以将所述水平保持在更低的水平(5-10ng/mL)，以降低肾毒性风险。佐剂通常与钙调磷酸酶抑制剂联合施用，并且包括类固醇、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯和西罗莫司等。目的方案包括钙调磷酸酶抑制剂和吗替麦考酚酯。佐剂的使用便于临床医生在降低单种药剂的剂量和毒性的同时实现适当的免疫抑制。

经配制以用于治疗各种病症的药物组合物中的活性成分如上所述。所述活性成分以治疗有效量存在，治疗有效量即为施用时足以有效调节靶向蛋白或多肽的作用以治疗由此介导的疾病或医学病症的量。所述组合物还可以包括各种其他试剂，以增强递送和疗效，例如，以增强活性成分的递送和稳定性。

因此，例如，基于所需制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这种稀释剂的示例是蒸馏水、缓冲液、生理盐水、PBS、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。另外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体；佐剂；无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂；赋形剂；等等。所述组合物还可以包括与生理条件接近的其他物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和清洁剂。所述组合物还可以包括多种稳定剂中的任何一种，例如抗氧化剂。

所述检测试剂(例如一种或更多种同种型特异性或糖基化特异性试剂)可以作为试剂盒的一部分提供。因此，本发明进一步提供了用于检测生物学样本中目的病原体特异性抗体的存在情况的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包含用于检测目的病原体特异性抗体的诊断性诱饵，其可以包括，例如，诊断性病原体或抗原阵列。临床实验室、实验室、执业医师或私人均可执行使用这些试剂盒的程序。本发明的用于检测标志物的试剂盒包含经基因修饰的病原体以及用于评估的标记试剂。所述试剂盒可以任选地提供在此程序中发挥效用的其他组分，包括但不限于缓冲液、显影剂、标记、反应表面、检测装置、对照样本、标准品、说明书和解释性信息。

除上述组件外，标的试剂盒将进一步包括用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的试剂盒中，其中一种或更多种可能存在于所述试剂盒中。这些说明书可能存在的一种形式是印在合适的介质或基材(例如，其上印有信息的一张纸或几张纸)、试剂盒包装、包装说明书等之上的印刷信息。其存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、CD、硬盘驱动器、网络数据存储器等。这些说明书还可能存在的一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。所述试剂盒中可能存在任何合适的装置。

在一些实施例中，所述试剂盒包含伯氏疏螺旋体诊断性病原体以及一种或更多种用于检测伯氏疏螺旋体病原体特异性抗体的同种型特异性或糖基化特异性试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测伯氏疏螺旋体病原体特异性IgE抗体的IgE特异性试剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含抗组胺剂、肥大细胞稳定剂和抗IgE治疗剂中的一种或更多种。

提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制本发明的范围。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度、浓度等)的准确性，但是应该允许存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。

实验

本文内容表明，全面的抗体同种型谱分析将IgE鉴定为免疫病理反应的关键生物标志物和诱因。免疫球蛋白水平和比率的谱分析可以表明所述致病细菌的存在，并且可以评估每位患者的免疫应答状态，这可以为临床决策提供相应信息。用于全面分析血清中所有抗体同种型及其相对量的方法请参阅下文“示例”部分。

IgE具有临床意义，因为它可与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的Fc受体以高亲和力结合，引起明显的局部组胺释放，这进一步增强了IgE介导的免疫应答，同时抑制了IgG介导的免疫应答。抗原与肥大细胞Fc受体上附着的IgE结合后，嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱粒，这使得机体释放组胺和其他过敏因子，引起广泛组织损伤，此外，所述脱粒也对报告的许多莱姆病体征和症状产生影响，例如，包括关节炎、不适、乏力和认知障碍。因此，IgE的产量可以影响发病机理。不同小鼠品系中IgE的产量和2型免疫应答的严重程度有所不同，这表明莱姆病患者报告的症状的多样性与个体的基因组成有关。

为了在高分辨率下研究个体免疫应答，针对所有抗体同种型中抗体的存在和相对量，开发出了一种全面的血清学测试方法。此方法将抗同种型和抗亚型检测套组与流式细胞术的效能和解析相结合，以测量推定患者中的病原体特异性抗体与表达GFP的活病原体细胞的结合情况。

例如，用血清样本温育完整的GFP标记细菌，并用经流式细胞术分析的综合性二抗检测套组检测与细菌表面表位结合的Bb特异性抗体。此方法可以对结合的Bb特异性抗体的同种型库进行谱分析，并确定Bb感染阳性评分的阈值。此方法的假阳性率较低，因为抗体的底物是完整细菌，而非暴露出保守的细胞内细菌表位的细菌裂解物。此外，流式细胞术的解析可提供较高的灵敏度和可重复性。在此高灵敏度下，在感染后第一周即可检测到典型的感染指征，例如IgM和IgG抗体亚型，而对于目前使用的方法，为了取得可靠结果，建议在感染后8周进行测试。令人惊讶的是，我们还发现，在动物模型以及取自在感染后较长时间加以分析的两级测试阳性患者的样本中，对抗Bb的IgE抗体对细菌病原体产生意料之外的应答。

对于疏螺旋体感染，易感性小鼠品系(C3H/HeJ)与对Bb诱导的病理反应具有抵抗力的小鼠品系在IgE应答的动力学特征和强度方面存在显著差异。我们还观察到肥大细胞浸润至受Bb感染的C3H/HeJ小鼠的肿胀关节中。我们的数据表明，IgE诱导的肥大细胞脱粒在莱姆关节炎中属于病理性症状。由于肥大细胞脱粒过程中组胺释放是许多途径的主要调节方式，并且可能直接影响肥大细胞脱粒致使关节周围肿胀的方式，因此我们测试了抗组胺治疗在感染过程中产生的影响。自感染后2周起，在小鼠的饮用水中施用2型组胺受体拮抗剂(H2阻滞剂)进行治疗可防止踝关节肿胀，而1型组胺受体拮抗剂则无效果。这些发现表明，肥大细胞脱粒过程中组胺释放以及通过2型组胺受体在靶细胞上进行信号传导会导致胫跗水肿肿胀，并且可以用来解释一些与莱姆病相关但与Bb感染无明显关系的临床症状。

优化了制备用于诊断的Bb的条件；制定了固定和保存方案，以保存细菌表位并消除两次测试之间的批次效应。固定可以减少对生物安全性的担忧，因为固定会使细菌失去感染性。例如，在不同浓度、浸泡时间和温度下重复使用醛系固定剂(最开始用甲醛和戊二醛固定)，这样可以最佳方式维持表面表位，且不会穿透外膜，导致暴露高度保守的细胞内蛋白。

我们目前在指数生长期和稳态生长期都使用Bb，并在这两个阶段测试所有样本。在与同一批细菌培养物结合后，在相同染色条件和同一天的流式细胞术分析下，比较来自给定队列的所有样本。这可以防止队列内出现批次效应，但是为了比较一个队列的结果与另一队列的结果，我们将测定中的细菌数量和浓度归一化，并相较于用二抗温育(未用血清预先温育)的细菌来比较结合百分比。

可以对Bb进行进一步基因修饰以提高特异性。现在对Bb诱饵进行基因修饰以表达GFP，以便通过流式细胞术对其进行阳性鉴定。可以根据需要对Bb进行进一步基因修饰，以消除高度保守的表面蛋白。或者，鉴定与抗体结合的最具免疫原性的表位，并用以产生一组作为筛选用底物的抗原。

免疫球蛋白重链可区分免疫系统产生的5种主要的抗体同种型。这些同种型分别是IgD、IgM、IgA、IgE和IgG，可以进一步将其归入亚类(即，IgG1)中，每个亚类均含有发挥不同效应子功能的多种同种型。测量大部分IgG或IgM的莱姆病诊断法不仅无法找到其他主要的同种型，而且还会遗漏抗体亚类解析，而抗体亚类解析是详细了解患者的免疫应答的最佳方式。这些测定采用细菌裂解物，其可以使关键结合表位变性，并且可能通过显示细胞内蛋白使结果具有非特异性。这些缺点致使灵敏度较低，且使得相应测试无法适当检测出早期感染。因此，在关键早期窗口期(抗生素疗法最有效的时期)，就诊患者(CDN推荐的两级测试测得血清反应呈阳性)出现游走性红斑(EM)样皮疹的比例不足30％。在大多数情况下，如果及时开始使用多西环素、阿莫西林或头孢呋辛等抗生素治疗，便足以消除感染。因此，至关重要的是，通过测试所有抗体同种型来确定处于Bb感染早期的血清反应阴性患者是否为真阴性。

通过当前诊断方法鉴定的IgM和IgG抗Bb抗体为鉴定出感染Bb的患者提供了一个小窗口。在纳入IgE和其他抗体同种型后，我们能够更好地区分经两级验证的莱姆病患者与未感染的健康对照者。在这种方法下，在具有蛋白免疫印迹法测得的不确定值和流式细胞术测定测得的明显阳性值的患者中，即使IgG1本身也对所进行的ELISA较为敏感，但其灵敏度高于蛋白免疫印迹法中所表现出的灵敏度。纳入其他参数，无论是其他IgG亚型还是其他同种型(例如IgE)，以进一步区分患者，其中IgE与IgG亚型抗Bb抗体的比率将健康对照者和患者分为两个不同的、明确的聚类。另外，我们可以通过鉴定患者中的IgE针对IgG或IgM呈阴性但在直接测试中呈阳性(避免假阴性)，从而鉴定出对感染产生非典型反应的患者。

虽然IgG和IgM被视为是主导对细菌感染产生免疫应答的典型抗体同种型，但IgA也被视为与神经疏螺旋体病有关。我们会确定治疗前和治疗后患者样本中所有抗Bb抗体同种型和亚型的水平。此外，我们也会跟踪IgE或IgA水平(单独使用或与其他抗体同种型水平比较)是否会对与非治疗后患者相比已恢复的患者进行聚类。

还采用了可消除莱姆病小鼠或患者过敏反应的IgE上游方法。除了使用抗组胺剂或IgE阻断外，还通过在肥大细胞IgE结合和组胺释放的更上游位置实施免疫调节策略来提供更持久的解决方案。在肥大细胞脱粒上游起作用的方法可以降低小鼠和/或患者中对莱姆病产生的IgE介导的应答。奎利珠单抗是一种单克隆抗体，靶向膜表达IgE的M1主链链段CεmX。所述抗体使B细胞上的膜结合的IgE抗原受体交联，从而诱导IgE阳性B细胞凋亡，使游离循环IgE水平降低并抑制IgE的产生。为了体内评估此抗人抗体的功效，采用经基因修饰的小鼠模型，在此模型中，将人M1'结构域插入小鼠IgE基因座，使产生IgE的B细胞容易因临床批准的抗体的介导作用而耗尽。将这些小鼠与C3H回交以确保其对Bb敏感，而后用病原体感染并用奎利珠单抗治疗。测试在有无CD47阻断剂的情况下，奎利珠单抗联合疗法进一步改善IgE+ B细胞清除率和细菌清除率的情况。

使用共培养系统来测试Bb感染后经历IgE同种型转换的B细胞中IgE+ B细胞耗尽的有效性。在同一模型中，还测试了也能耗尽IgE+ B细胞的另一种药物——XmAb7195(单独使用或与CD47阻断剂联合使用)。XmAb7195最具综合性，并且在II型免疫应答中与最上游相互作用。XmAb7195以其可靠的双重机制而闻名。该机制能够分离出血清中的游离IgE，并使其与B细胞上的FcγRIIβ和IgE受体结合形成复合物，从而阻断IgE的信号传导。这可以抑制IgE阳性B细胞的分化，减少分泌IgE的浆细胞，抑制IgE阳性B细胞的形成，同时减少游离IgE和总IgE。该机制对其他B细胞的抗原同种型无影响。这些药物可以减少用循环IgE和/或IgE阳性B细胞所观测到的应答，从而减少II型免疫应答。作用位置越上游，阻断越全面，血清中的游离IgE和IgE阳性B细胞越少。相对于目前可用的治疗方法，这可以降低莱姆病的影响并持续作用更长时间。

示例1

我们已开发出使用完整的、经基因修饰的病原体对病原体特异性抗体进行最佳检测的方法。该方法利用与荧光、比色或金属检测测定相关联的免疫吸附测定，同时检测多种抗体同种型、亚型和糖基化状态。通过并行检查多种抗体同种型/亚型/糖基化基序，可以确定这些不同抗体形式的比率，从而对疾病状态进行详细分组，并以高分辨率显示对病原体的免疫应答。

对病原体进行基因修饰使其发出荧光，从而快速鉴定出完整的活病原体，将其与死病原体和碎片区分开来。保持病原体完整并仅将表面蛋白暴露于病原体特异性抗体中，避免暴露会影响特异性的高度保守的细胞内蛋白。

对病原体进行进一步基因修饰，消除在病原体表面表达的高度保守的表位，针对病原体特异性抗体的免疫吸附检测产生最具特异性的复合物，同时使蛋白保持其天然状态，实现最强抗体表位识别能力。这些经修饰的病原体也可用作疫苗株以产生高度保护性抗体。

由细菌伯氏疏螺旋体引起的莱姆病是众所周知的难以精确检测的疾病的示例。当前的诊断测试或缺乏特异性，或缺乏灵敏度，或仅对一种特定菌株敏感，而其他测试呈阴性。据证实，本文提供的测定法甚至在疏螺旋体感染早期也能提供高特异性和高灵敏度的诊断。此外，同时解析了不同抗体同种型、亚型和糖基化状态，从而将患者归入莱姆病的不同亚组，这为制定治疗方案提供了关键信息。

据证实，这种测定法可在感染后第一周内通过一小滴血液检测出活体小鼠的感染情况。该测定法还能确定不同类型的抗体之间的临界比率，这些比率可以指示免疫应答状态。虽然细菌感染通常会引发保护性IgG应答，但我们发现实验室小鼠品系C3H中的疏螺旋体感染也会引发IgE应答，这更常见于对寄生虫或过敏原产生的应答。将诊断信息与成像结果和其他观测结果相结合，进一步了解不同感染条件触发不同免疫应答的方式。

图1是诊断性免疫吸附测定的示意图。悬液中完整的游离伯氏疏螺旋体病原体经基因修饰后可表达绿色荧光蛋白(GFP)。用来自受感染或未感染宿主的血浆温育病原体。多次洗涤后，用一组与抗体同种型、亚型和同种异型特异性结合的荧光标记二抗探测这些病原体以及附着于暴露表面蛋白上的任何病原体特异性抗体。这一策略同样适用于与可用于检测的其他分子(例如用于大量细胞计数法的金属)共轭的抗体。对碳水化合物基序具有特异性的抗体也可以纳入此检测套组中。

图2A-2E是疏螺旋体特异性免疫应答的代表性分析以及感染状况影响其的方式。对多种同种型和亚型进行谱分析，以更好地解析对感染产生的应答。用伯氏疏螺旋体-GFP感染C3H小鼠，并在持续67天的感染过程中测量踝关节肿胀程度。在第48天观察到踝关节肿胀峰值，并在第67天终点测量抗体水平。图2A展示了按组分列的踝关节宽度(单位：mm)，其中最大肿胀程度和最高关节炎症水平见于被CHO培养基中注入的疏螺旋体感染的组中。这还导致疏螺旋体结块成较大的聚集体。

图2B展示了感染后第67天的抗体同种型水平，其中描绘了IgG2a和IgE同种型的相关情况。鼠IgG2a可与人IgG1相媲美，在所有IgG亚型中具有最高活化/抑制率。出人意料的是，还发现了IgE同种型，因为它通常与寄生虫感染和过敏反应有关。

采用本文所揭示的方法测量一组疏螺旋体特异性抗体，这相对于常规方法可以更好地解析免疫应答状态。这一点至关重要，具体如图2C所示，其中在感染后第67天，CHO培养基和含有佐剂的CHO培养基的IgE/IgG2a抗体比率与感染后第48天的踝关节肿胀测量值峰值相关联。图2D展示了感染后第67天鼠IgG2a抗体水平的代表性FACS图，而图2E展示了此时鼠IgE的相应图。

图3A-3G提供了对感染的抗体应答的时程分析，所述应答可在感染后1周检测到，并在感染后2周进一步增加，表明这是一种早期检测感染的灵敏方法。用伯氏疏螺旋体-GFP感染C3H小鼠，并每周分离一次血浆。用1×10

图3A描绘了相较于未感染小鼠，在感染后1周和2周的鼠抗体水平。图3b-3e是IgG1、IgG2a、IgM、IgE各自在感染后第2周的鼠IgG2a抗体水平的代表性FACS图。第一排是未感染小鼠的血浆。第二排含有来自受感染小鼠的血浆。第三排仅含有Bb-GFP，无血浆或二抗。第四排含有Bb-GFP和所有二抗，但无血浆。最后一个条件是噪声的量度，而未感染血浆的第一个条件用于将每种抗体的门设置为结合抗体百分比(％)。图3F测量相较于未感染小鼠，感染后2周的鼠血清诱导形成的细菌凝集(由FACS分析评定)。图3G是Bb-GFP尺寸的代表性FACS分析。

示例2

测定对伯氏疏螺旋体感染的免疫应答状态的诊断方法适用于检测人体中的早期和晚期感染，并且能将诊断特异性系统地提高至接近100％。

在健康个体上测试对人抗体同种型、亚型和同种异型具有特异性的二级检测套组，以确定与疏螺旋体-GFP结合的本底水平。

对免疫吸附测定中使用的疏螺旋体进行进一步基因修饰，以提高特异性。鞭毛在不同的细菌品系中是高度保守的。对鞭毛突变体进行分析，相较于未受疏螺旋体感染的对照品，比较在感染过程中的连续时间点所取得的患者血浆样本中的Bb-GFP。测定暴露于Bb-GFP的表面蛋白与其他细菌物种的保守程度，并按照保守程度排列顺序使其发生系统性突变，以进一步提高特异性。收集临床分离株，并通过基因改造引入GFP。根据需要对鞭毛和其他基因进行基因修饰，以确保这种检测方法在地理上不局限于一种形式的疏螺旋体，而是可以检测所有引起莱姆病的菌株。

通过变更细菌的血浆温育时间、二抗浓度和电压(通过流式细胞术实现)或变更抗体共轭物和检测方法来优化此测定法的灵敏度。

采集具有治疗史的人类患者的样本，以利用诊断方法将莱姆病症状细分归入特定亚组，这些亚组由对疏螺旋体感染的免疫应答状态定义。

从健康对照者中采集患者血浆样本，并将其与来自使用当前血清学方法(区分经抗生素治疗后症状有所缓解的个体与具有持续性症状的个体)测得对疏螺旋体抗体呈阳性的个体中的样本进行比较。测定抗体亚型比率，以鉴定出可区分对治疗有反应或无反应的患者的指征。

在出现游走性红斑(早期疏螺旋体感染)时采集患者血浆样本，并将诊断策略与当前血清学诊断方法进行比较，每周进行一次，持续8周。跟踪患者对治疗的反应。通过我们的诊断策略分析样本的感染指征，这些指征在当前血清学方法实施之前是显而易见的。采用当前血清学方法(仅探测IgM和大部分IgG)检测前几周测试呈阴性的患者中的IgE。

检测免疫状态的诊断策略已扩展至对其他病原体产生的应答。存在肺损伤时，曲霉菌真菌感染会引起非常严重的问题，但是要鉴定曲霉菌感染，则必须将其从呼吸道中提取出来并培养。用来自活动性感染患者的患者血清和人二抗检测套组测试含有不同荧光分子且以不同形式存在的经基因修饰的曲霉菌样本，以表征对曲霉菌感染的抗体应答并评估诊断策略是否适用于真菌感染。

细胞内寄生虫刚地弓形虫感染非常普遍，但相关检测能力严重不足。由于刚地弓形虫非常适合进行基因修饰，并且已有许多基因突变体，因此与已证实发生弓形虫暴露和活动性弓形虫感染的个体相比，该诊断策略已在未受到弓形虫感染的健康对照者中进行了相应测试。

在对病原体产生免疫应答的状态下进行高分辨率分析，可以更好地了解不同症状的机制，因为它们与由不同抗体重链和糖基化基序触发的效应子功能相关。对完整生物体进行基因修饰以消除高度保守的表面暴露蛋白，通过使病原体蛋白保持其天然状态，仅保留对给定病原体具有高度特异性的表面蛋白来提高对抗体检测的特异性。

同时评估感染期间当前被忽略的不同抗体亚类的能力可以改善疾病的检测和治疗。在此免疫吸附诊断策略中，用作诱饵的高特异性模型病原体上结合的抗体类型之间的比率可能允许采用可定制特异性的高灵敏度方法。

疏螺旋体的基因修饰。实施方式请见以下出版物：Moriarty等人.(2008)PLOS病原体.4(6):e1000090。简而言之，为了构建GFP表达质粒pTM61，在侧翼SacI和KpnI位点用引物B696(5′-ccggagctcatgataagctgtcaaacatgag-3′)和B697(5′-ccggtacctcagatctatttgtatagttcatc-3′)对pCE320(GFP)-pFLAB中的终止子序列(T1×4)、rbs、伯氏疏螺旋体flaB启动子序列和GFP编码序列进行pCR扩增，并在接近PstI载体位点的SacI插入位点克隆至pCRBlunt II-TOPO(Invitrogen Canada，安大略省伯灵顿)中，以制备质粒pTM41。该插入片段无法克隆至pBSV2穿梭载体(pBSV2G)的抗庆大霉素类型中，可能是因为复制起点和拷贝数有时会影响大肠杆菌中荧光蛋白的表达和毒性。因此，构建了经修饰的穿梭载体pTM49，其中通过用酶MluI和SnaBI进行限制性消化去除pBSV2G中的colEI ori，并用来自pCR BluntII-TOPO(包含pUC ori)的MluI/SnaBI片段置换。将来自pTM41的(T1×4)-PflaB-gfp盒克隆至pTM49中的SacI/KpnI位点，以生成pTM61。

让所有菌株在内部制备的BSK-II培养基中生长。如前所述，制备了电转感受态传染性伯氏疏螺旋体菌株B31 5A4 NP1和非传染性菌株B31-A(来源均为B31)。在100μg/ml庆大霉素存在的情况下，用50μg pTM61进行镀液转换。对抗庆大霉素伯氏疏螺旋体克隆进行以下筛查：1)通过本文所述的用引物B348和B349进行的菌落筛选PCR检测aacC1序列的存在；以及2)通过常规落射荧光显微镜检查测定GFP的表达。小规模制备的总基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳证实了荧光菌株中非整合形式的pTM61质粒的存在。针对天然质粒含量进行PCR筛选，结果表明一种荧光传染性伯氏疏螺旋体克隆(GCB726)含有除cp9外的所有内源性质粒，其中cp9被基于cp9的pTM61构建体置换。使用非传染性菌株GCB705进行非传染性伯氏疏螺旋体实验。针对天然质粒含量进行的PCR筛选结果表明，GCB705含有与B31-A亲本相同的质粒。现已知质粒lp25、lp28-1和lp36对于传染而言是必不可少的。

删除鞭毛。按照以下出版物中所述的方式进行删除：Lin等人.(2015)mBio 6(3):e00579-15。伯氏疏螺旋体B31衍生物5A18NP1是具有传染性、可适度转化的克隆，其可用于产生fliH和fliI突变体。5A18NP1是经基因改造的克隆，其中质粒lp28-4和lp56缺失，编码假定限制性修饰酶的bbe02已遭到破坏。使用基于Himar1的自杀载体pGKT-STM5或pGKT-STM10，通过随机的、带有标记标签的转座子突变来获得fliH突变体。让伯氏疏螺旋体在3％CO

通过将组成型表达构建体pflaB::fliH、pflaB::fliI和pflaB::fliHI插入穿梭载体pKFSS1中来构建互补穿梭载体。简而言之，在基因改造限制性位点用引物对flaB启动子(PflaB)、基因fliH和fliI以及毗连fliHI基因簇进行pCR扩增，并将其克隆至PCR2.1载体(Life Technologies，纽约格兰德艾兰)中。首先在SacI和KpnI位点将PflaB亚克隆至pKFSS1中，然后在KpnI位点和PstI位点将fliH、fliI和fliHI基因融合至flaB启动子的3'末端，从而形成互补质粒。通过PCR、限制性酶切模式和PCR产物测序确认所得到的构建体。用互补穿梭载体进行转化，使fliH突变体和fliI突变体反互补。如前所述对伯氏疏螺旋体进行电穿孔。通过PCR和测序确认转化株。

在有无1％甲基纤维素的情况下，通过暗场显微镜检查，测定BSKII培养基中fliH和fliI突变体、互补克隆和亲本菌株的形态、运动性和游动能力。

对诊断分析用血清进行染色。抗体购自Biolegend。PE抗小鼠IgE，克隆号RME-1，目录号406908；AlexaFluor 647抗小鼠IgM，克隆号RMM-1，目录号406526；PE/Cy7抗小鼠IgG2a，克隆号RMG2a-62，目录号407114；APC/Cy7抗小鼠IgG1，克隆号RMG1-1，目录号406620。

血液样本通过采集制备。在4℃下以400RCF软旋转5分钟。将血浆移入干净的试管中。在4℃下以10,000RCF硬旋转10分钟。每周采用相同的方案将10μL血浆移入孔板中。如有可能，请制备重复样本。摇晃，并将Bb倒入干净的容器中。使用多通道移液器，将150μL移液至V型底板最右边的两列中。在4℃下以1500RCF/g旋转10分钟。

用50μl抗体溶液/样本进行染色，将其稀释至达到2ml PBS，即50μl/孔的血清样本。在黑暗中置于冰上染色18分钟。加入150μlPBS，在4℃下以1500RCF/g旋转6分钟。移去上清液，用200μl PBS洗涤两次，并在4℃下以1500RCF/g旋转6分钟。

对于流式细胞术，在室温下于黑暗中将样本固定在4％PFA中10分钟。如要立即进行分析，请在PFA中进行，如要将细胞静置24小时以上，请用200μl PBS进行洗涤。

示例3

我们现已开发出了一种使用全面抗同种型检测套组进行的诊断测试，其允许通过流式细胞术检测完整Bb上的所有抗体亚型，具体如示例1和2所述。用含有Bb特异性抗体的血清温育全部细菌，然后使其与细菌表面表位结合。洗涤后，我们使用全面二抗检测套组，通过流式细胞术进行分析，从而对结合的Bb特异性抗体的同种型库进行谱分析，并确定Bb感染阳性评分的阈值(图1)。采用我们的诊断方法诊断时，最早可在感染后第4天检测到感染的典型指征，例如IgM和IgG抗体亚型。

令人惊讶的是，我们发现，在动物模型以及取自在感染后较长时间加以分析的CDC阳性患者的样本中，对抗Bb的IgE抗体对细菌病原体产生意料之外的应答(表1)。先前零星地记录了莱姆病患者中的Bb特异性IgE抗体的相关情况，尽管如此，当前的诊断策略仍不会检测IgE。在当前的诊断方法中，产生排除其他同种型的Bb特异性IgE抗体的个体可能被归类为呈莱姆病阴性

肥大细胞与IgE结合，引发明显的局部组胺释放，这进一步增强了IgE介导的免疫应答，同时抑制了IgG介导的免疫应答

当前测试仅能识别抗Bb IgM和IgG抗体，并且对于因遗传易感性和免疫偏斜导致针对Bb产生的IgE抗体多于IgG的个体，我们认为采用当前方法测试时，其结果会呈阴性。因此，他们可能无法接受感染治疗或感染无法治愈，相关原因如下：基于其测试结果禁止对他们进行相关治疗；产生2型而非1型应答。因此，开发出新的综合诊断方法势在必行。此外，因Bb而产生IgE的现象可以用来解释一些与莱姆病相关但与Bb感染无明显关系的临床症状，例如关节肿胀、乏力、不适、认知障碍等。

我们目前正在筛查患者的血清，以确定Bb感染后产生IgE的普遍程度，并针对以下问题开展研究：1)2型、IgE介导的免疫应答是否引起与Bb感染有关的莱姆病症状，并且相应病理反应是否由特定的细胞类型或分子(例如组胺)介导？以及2)可否利用患者血清中的抗Bb IgE抗体检测来改善诊断并提供治疗干预信息？

重要的是，不同小鼠品系中IgE的产量和2型免疫应答的严重程度有所不同，这表明不同莱姆病患者报告的症状的多样性与每个患病个体的基因组成有关。长期以来，人们一直认为过敏具有家族遗传倾向。如果我们的假设是正确的，我们也许能够更好地理解不同患者之间的莱姆病症状临床表现差异巨大的原因，也能更好地理解某些患者在接受抗生素治疗后仍出现这些症状的原因。当前对特定等位基因和过敏性疾病的全基因组关联研究可以为如何对莱姆病症状已消退或未消退的Bb感染患者进行分类提供线索。

表1.适用于莱姆病患者和对照者的检测套组阐明了我们新颖的诊断策略与现有方法的一致性性，并且展现了我们的测试方法能够提供更详细信息的能力。

由Lyme Disease Biobank提供的来自纽约长岛的患者和地方病健康对照者的样本于2017年采集。第640、663和673号患者在两个时间点采血，连续结果分别用1和2表示。在两次访视之间的时间段内，用多西环素治疗这3例患者。其他患者仅采血一次。在采用针对IgM和IgG的不确定WB后，采用两级方法将第611和674号患者诊断为莱姆病阴性，但可检出的IgG和IgM水平高于其他确诊阴性患者的相应水平。研究发现，受感染患者均产生了对抗Bb的IgE抗体，但个体间的绝对值差异巨大。Stony Brook ELISA使用B31 Bb的全细胞裂解物，而C-6肽ELISA仅使用Bb中的C-6组分。NEG＝阴性；POS＝阳性；IT＝不确定。

示例4

我们的诊断策略确定了导致出现达到显著性水平的Bb特异性IgE的感染状况(图3和4)。IgE抗体是2型免疫应答的标志，同时导致肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和组胺释放增加。这是对细菌病原体产生的非预期应答，我们因此对它与Bb发病机理之间的相关性较为感兴趣。我们研究了针对Bb的2型免疫应答以及治疗性免疫调节与标准抗生素治疗相结合的意义。由于莱姆病难以治疗且发病率较高，现已鉴定出目前存在的可能缓解该疾病的抗过敏化合物。

体内IgE和其他免疫球蛋白同型抗体的产生涉及到许多因素，首先是分泌细胞因子IL-4和IL-13的“辅助性”T细胞的活化，这些细胞会与抗原活化的B细胞结合并触发免疫球蛋白类别向IgE的转换。抗原的进一步活化导致形成分泌IgE的血浆B细胞。分泌的IgE与肥大细胞、嗜碱性粒细胞以及含有对IgE Fc部分具有高亲和力的受体的细胞(FcεRI)结合，并在其他结合受体的IgE抗体之间形成持久交联。过敏原、IgE和FcεRI+细胞之间的相互作用导致这些细胞脱粒，释放出组胺和其他分子。这些过敏反应伴有的大多数炎症、肿胀和疼痛都源于脱粒产物。该途径提供了各种待考虑的目标，并且可以检查每个步骤，以实现有效治疗干预。由于许多患者想要缓解因过敏型免疫应答而出现的症状，许多抗组胺剂的价格都在可承受范围内且获取途径较为广泛，并且将其纳入治疗计划也相对简单，因此研究了抗组胺剂在Bb感染中的治疗潜力。

组胺具有四种独特的受体，并且会对生理学中的诸多非免疫学方面产生影响。我们通过用Bb感染小鼠来阐明组胺在莱姆病症状中所起的作用的性质，并且通过诊断性免疫测定来确认IgE的产生，此外，我们也用各种抗组胺剂来治疗这些症状，同时观察关节炎性肿胀是否消退。通过使用不同的组胺受体拮抗剂(H1：苯海拉明、氯雷他定，H2：西咪替丁、雷尼替丁，H1&2：多塞平，H3：噻普酰胺、氯苯丙酸)，可以确定受到抑制的组胺相关病状。

如果仅使用抗组胺剂不足以缓解病症，则采用在肥大细胞脱粒上游起作用的方法，降低小鼠和/或患者中对莱姆病产生的IgE介导的应答。耗尽小鼠模型中的肥大细胞，以确定这种方法是否可以消除任何过敏反应。消除肥大细胞以实现体内损耗的免疫治疗组合是抗c-kit抗体，其可单独使用或与抗CD47联合使用。

此外，对抗IgE抗体的功效进行了测试，该抗体可以a)降低组织中的IgE水平，b)消除IgE和肥大细胞，以及c)消除IgE+记忆B细胞。这些研究阐明了对Bb的2型免疫应答所起的作用，也介绍了IbE和组胺对莱姆病发病机理和症状表现的影响。

示例5

如示例1和2中所述，我们现已开发出了一种用于对血清中的所有Bb特异性抗体、其同种型及其相对量进行全面分析的方法。该方法利用流式细胞术的效能和解析来测量血清中检测到的Bb特异性抗体与表达GFP的个别活Bb细菌的结合情况，具体如图1-4所示。此外，该技术可测定免疫应答对活菌的影响；它还可以量化Bb免疫复合物和杀菌抗体的水平。通过采用这种技术，我们已经确定了对Bb的非预期抗体应答，由于尚未采用当前诊断方法对此进行测试，因此可能导致在当前仅针对IgM或IgG应答的诊断中出现假阴性结果。

我们正将该方法应用于个体患者血清中各种同种型抗Bb抗体分布的系统表征，然后会将每个患者的临床症状与其体液免疫应答的特定模式相关联。为此，我们收集了人类患者样本和治疗史，并采用诊断方法将出现广泛莱姆病症状的患者归入特定亚组。

从健康对照者中采集血浆样本，并将其与来自使用当前血清学方法测得对Bb抗体呈阳性的个体中的样本进行比较。基于对经抗生素治疗后症状有所缓解的个体与具有持续性症状的个体，可进一步对确诊患者进行分类。测定抗体亚型比率，以鉴定出可区分对治疗有反应或无反应的患者的指征。另外，在出现游走性红斑样皮疹时采集患者血浆样本，以评估我们的诊断策略在早期感染中的表现。将我们的诊断策略与当前血清学诊断方法进行比较，每周进行一次，持续8周。另外，跟踪患者对治疗的反应。为了将我们的新方法与现有诊断方法的灵敏度进行比较，使用传统的血清学方法对样本进行分析，以找出在表现明显之前在感染早期出现的感染指征。特地对在感染后前几周通过当前血清学方法检测呈阴性的患者进行IgE检测。

示例6

疟疾感染后的免疫谱分析

为了测试这种免疫谱分析方法检测与受感染红细胞和未感染红细胞结合的抗体的能力，使用了来自患有伯氏疟原虫ANKA(Pb-A)鼠模型中发生的实验性脑型疟疾(ECM)的小鼠的血清。在这种ECM鼠模型中，60-100％的C57BL/6小鼠在大脑感染期(第6-10天)会出现类似于人CM临床表现的症状。在感染后第15天，未发生ECM的小鼠会出现较为致命的严重贫血和重寄生虫血症。在感染后第3天，用PBS或抗体治疗感染了106种Pb-A寄生虫的C57BL/6小鼠，并评估来自这些小鼠的血清抗体与来自一只感染后第6天的小鼠的受感染和未感染红细胞的结合情况。将20ul血清与5ul全血一起温育，而后将细胞温育30分钟或过夜，然后用针对抗体类型的二抗染色，并采用流式细胞术进行分析。各抗体类型与未感染红细胞的结合率都较低，并且示出了各抗体类型与GFP呈阳性的受感染红细胞的结合情况。相应数据请见图7A-7D。

示例6

曲霉菌感染后的免疫谱分析

用烟曲霉菌的分生孢子过夜温育来自受烟曲霉菌感染后第3天的小鼠的血清或温育1小时，然后用针对小鼠IgG1、IgE、IgM和IgG2a的抗体染色。虽然IgG2a与IgM在感染组和未感染组之间未表现出明显差异，但IgE与IgG2a却表现出了一定差异。利用IgG2a和IgG1可以更好地观察到相应差异，而在明确区分阳性和阴性样本的组间表现出的差异最为明显的是IgE与IgG1。相应数据请见图8A-8D。

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