鼠李糖乳杆菌菌株LRa05在制备增强免疫力制品和/或缓解湿疹制品方面的用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及鼠李糖乳杆菌菌株LRa05在制备增强免疫力制品和/或缓解湿疹制品方面的用途。

背景技术

肠道是人体微生物聚集最密集的部分，是人体最大的免疫器官，肠道粘膜上有大量的免疫细胞。免疫力是人体的防御机制，能处理体内突变细胞和外来病毒、细菌等感染的细胞。在正常情况下，免疫系统会识别和消灭侵入的异物，突变细胞会被抑制，清除。而由环境、感染、衰老、生活方式、手术和营养不良等挑战会带来肠道菌群失调，免疫力低下。肠道菌群失调会增加肠道内致病菌的生长，有益菌减少，导致机体免疫应答紊乱，同时，还会导致内毒素(LPS)增加并转移，激活多种免疫细胞上表达的toll样受体(TLRs)，粘膜屏障被破坏，从而导致炎症反应。过度的炎症反应会造成人体正常组织被破坏，促进肿瘤的发生等。近年来，湿疹的流行率正在上升，这种类型的过敏反应是T淋巴细胞在抗原刺激下转化为致敏淋巴细胞，然后产生临床症状。Th细胞通过分泌大量细胞因子发挥免疫学效应，Th1和Th2免疫反应的失衡被认为是皮炎-湿疹发病机制中的重要因素。

益生菌是一种活的微生物，当给予足够的数量时，对宿主具有有益的生理作用。一些乳酸菌可以在不同的发酵食品中发现，如酸奶、奶酪和泡菜，通常被认为是安全的，并被归类为益生菌，因为它们对健康有益。益生菌对胃肠道中胃酸，胆汁耐受，可通过定植于肠道细胞，对宿主的肠道菌群产生积极影响，能够通过减少体内有害细菌的数量来促进机体健康，并有助于消化、调节免疫细胞，增强机体免疫力，减少炎症或过敏反应。

益生菌已被证明可以增加巨噬细胞的吞噬作用或自然杀伤细胞的淋巴细胞活性，并直接通过与肠上皮细胞(IEC)和树突状细胞上的一系列受体相互作用来调节胃肠道中的免疫。一些菌株能发出树突状细胞信号刺激先天免疫系统，激活淋巴细胞，巨噬细胞等的增殖活性，调节机体血清中细胞因子分泌，从而提高对病原体的防御能力和增强免疫应答。益生菌通过产生短链脂肪酸，间接改善肠道屏障功能，激活组蛋白乙酰转移酶(HAT)，抑制炎症，调节免疫细胞。益生菌还可以改善结肠粘膜损伤，调节细胞因子的分泌，抑制肠道免疫系统的炎症反应等调节机体免疫系统。通过益生菌可以补充过敏性人群肠道菌群中缺乏的微生物种类，使其获得口服耐受。当外来抗原再次进入肠道，减少产生皮肤的过敏反应，降低湿疹带来的风险。

目前，益生菌增强免疫力以及湿疹的预防，治疗已成为研究热点，但益生菌是能以菌株特异性的方式，影响免疫细胞的簇分化以及血清中细胞因子的产生。因此对不同的菌株及其组分的功能需要进行进一步的深入研究。

其中，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)就是益生菌的一种，这类菌已被报道在提升免疫力、缓解便秘、调节肠道等多方面具有有益效果，然而，目前市面上提供的鼠李糖乳杆菌尚不能满足工业生产、市场及消费者等多重选择需求，可供选择的空间较小，尤其在增强免疫力、缓解湿疹方面，本领域现有技术提供的鼠李糖乳杆菌菌株较少，因此本领域仍需开发更多有益的鼠李糖乳杆菌新菌株。

发明内容

基于本领域现有技术存在的上述需求，本发明要解决的技术问题是基于发明人筛选出的一株全新鼠李糖乳杆菌菌株LRa05(Lactobaccillusrhamnosus)开展功能性实验，并证实鼠李糖乳杆菌对胃酸，胆汁酸盐有较强耐受性，并能抵抗病原菌的侵袭，定植于肠道，维持肠道菌群稳态，并能促进细胞炎性因子的表达，增强机体免疫力。

本发明的技术方案如下：

保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05在制备增强免疫力制品和/或缓解湿疹制品方面的用途。

所述增强免疫力包括：促进淋巴细胞增殖和/或调节细胞因子水平。

所述淋巴细胞指脾脏淋巴细胞；

优选地，所述调节细胞因子水平指：提高因CTX引起的血清中降低的细胞因子的水平；

优选地，所述细胞因子选自：IL-6、IL-10、TNF-α或IgG。

所述缓解湿疹指：降低因DNCB引起的上升的IgE或IL-6水平、和/或，增加因DNCB引起的降低的IFN-γ、TNF-α或IL-10水平。

所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品。

一种增强免疫力制品，其特征在于，其增强免疫力的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05。

所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述食品还包括食用辅料。

所述增强免疫力包括：促进淋巴细胞增殖和/或调节细胞因子水平；

优选地，所述淋巴细胞指脾脏淋巴细胞；

优选地，所述调节细胞因子水平指：提高因CTX引起的血清中降低的细胞因子的水平；

优选地，所述细胞因子选自：IL-6、IL-10、TNF-α或IgG。

一种缓解湿疹制品，其特征在于，其缓解湿疹的活性成分包括：保藏号为CGMCCNo.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05。

所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述食品还包括食用辅料；

优选地，所述缓解湿疹指：降低因DNCB引起的上升的IgE或IL-6水平、和/或，增加因DNCB引起的降低的IFN-γ、TNF-α或IL-10水平。

在一些国家或地区的专利法允许的前提下，本发明还请求保护保藏号为CGMCCNo.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05在增强免疫力和/或缓解湿疹方面的用途。

本发明提供一株从人体粪便分离出的鼠李糖乳杆菌LRa05，于2022年1月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.24377。

一株高活性鼠李糖乳杆菌LRa05的筛选，鉴定，保藏以及其在制备调节机体免疫力产品的应用。其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌为LRa05，保藏编号为CGMCC No.24377。

一种抑制病原菌的菌剂，其特征在于：使用所述的鼠李糖乳杆菌LRa05制备，所述抑制病原菌包括大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌。

一种鼠李糖乳杆菌LRa05在功能性菌剂、食品、保健品或药品中的应用，用于下列的至少之一：增强免疫力；治疗、预防或缓解炎症；促进细胞炎性因子表达，增强淋巴细胞增殖。

所述为免疫力低下，任选地，所述免疫力低下由化合物环丙酰胺所导致。所述细胞炎性因子包括选自TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β至少之一。

一种增强机体免疫能力的产品，其特征在于：包含鼠李糖乳杆菌LRa05，保藏编号为CGMCC No.24377。

一种具有抗炎作用，改善湿疹的功能性产品，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌LRa05，保藏编号为：CGMCC No.24377。

一种鼠李糖乳杆菌LRa05，该菌株是从微康益生菌保藏菌种资源库中筛选得到的一株生长速度快，细胞密度高的菌株，其微生物保藏号为CGMCC No.24377；分类命名为：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus；保藏时间：2022年1月24日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述的鼠李糖乳杆菌LRa05，经过5L发酵罐放大，其最大活菌数是LGG的3.24倍。该菌株具有较好的耐受性、抗病能力，对多种抗生素敏感。

所述的鼠李糖乳杆菌LRa05显著提高小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IgG水平，增加短链脂肪酸含量，增强免疫低下小鼠的免疫力。

所述的鼠李糖乳杆菌LRa05显著提高湿疹小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-10，IgE水平，降低IL-6水平，从而调节免疫平衡，抵抗炎症，缓解机体湿疹。

本发明的另一个方面，提供鼠李糖乳杆菌在食品或药品中的应用，所述鼠李糖乳杆菌对肠道病原菌有广谱抑菌能力，且能在肠道内黏附定植，在缓解炎症，增强机体免疫力，改善湿疹方面效果较优。因此，可应用于发酵乳制品，健康食品以及保健品中。

本发明提供一株新的鼠李糖乳杆菌LRa05，以及该菌株在增强免疫力和改善湿疹方面的应用。所述鼠李糖乳杆菌于2021年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：鼠李糖乳杆菌LactobaccillusrhamnosusLRa05。该菌株具有较强的抑菌能力，良好的抗炎和免疫调节功能，对肠道壁紧密连接有极好的强化作用，对小鼠脾淋巴细胞转化值，细胞炎性因子，以及肠道短链脂肪酸水平具有调节作用；可促进免疫细胞活性，降低炎症发应，显著改善湿疹患者症状。该菌株可作为肠道抗炎，改善肠道保健功能，增强免疫力，减少皮肤过敏反应，缓解湿疹的益生菌，可以广泛应用于乳制品，健康食品，保健食品，或药品中。

本发明的鼠李糖乳杆菌菌株LRa05的保藏信息如下：

菌种保藏名称：LRa05

保藏号：CGMCC No.24377

分类命名：鼠李糖乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus rhamnosus

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年1月24日。

附图说明

图1是本发明实验例6鼠李糖乳杆菌自聚能力以及与病原菌共聚能力图表。

图2是本发明实验例8鼠李糖乳杆菌对免疫低下模型小鼠体重及脏器指数的影响图。

图3是本发明实验例8鼠李糖乳杆菌对免疫低下模型小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响图。

图4是本发明实验例8鼠李糖乳杆菌对免疫低下模型小鼠细胞因子的影响图。

图5是本发明实验例9鼠李糖乳杆菌对湿疹模型小鼠特异性抗体的影响图。

图6是本发明实验例9鼠李糖乳杆菌对湿疹模型小鼠细胞因子的影响图。

图2-图4中，NC代表：空白对照组，MC代表：免疫低下模型对照组，鼠李糖乳杆菌LRa05+CTX代表：免疫低下模型小鼠灌胃鼠李糖乳杆菌LRa05的实验组。

图5-6中，NC代表：空白对照组，MC代表：湿疹模型对照组，益生菌组代表：饲喂含鼠李糖乳杆菌LRa05的饲料的实验组。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。所描述的实验例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实验例2使用的对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG菌株购自广东微生物菌种保藏中心；

实验例6-7使用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌购自广东微生物菌种保藏中心。

实验例8-9使用的小鼠购自华中农业大学动物中心。

第1组实施例、本发明菌株LRa05的制品用途

本组实施例提供保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05在制备增强免疫力制品和/或缓解湿疹制品方面的用途。

任何使用、制备、生产、销售、许诺销售、培养、扩繁、发酵保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05并将其用于制备增强免疫力制品或缓解湿疹制品的行为均落入本发明的保护范围。

在一些实施例中，所述增强免疫力包括：促进淋巴细胞增殖和/或调节细胞因子水平。

在另一些实施例中，所述淋巴细胞指脾脏淋巴细胞；

优选地，所述调节细胞因子水平指：提高因CTX引起的血清中降低的细胞因子的水平；

优选地，所述细胞因子选自：IL-6、IL-10、TNF-α或IgG。

在具体的实施例中，所述缓解湿疹指：降低因DNCB引起的上升的IgE或IL-6水平、和/或，增加因DNCB引起的降低的IFN-γ、TNF-α或IL-10水平。

在更具体的实施例中，所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品。

第2组实施例、本发明菌株LRa05的适应症用途

本组实施例提供保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05在增强免疫力和/或缓解湿疹方面的用途。

任何使用、制备、生产、销售、许诺销售、培养、扩繁、发酵保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05并将其用于增强免疫力和/或缓解湿疹的行为均落入本发明的保护范围。

在一些实施例中，所述增强免疫力包括：促进淋巴细胞增殖和/或调节细胞因子水平。

在另一些实施例中，所述淋巴细胞指脾脏淋巴细胞；

优选地，所述调节细胞因子水平指：提高因CTX引起的血清中降低的细胞因子的水平；

优选地，所述细胞因子选自：IL-6、IL-10、TNF-α或IgG。

在具体的实施例中，所述缓解湿疹指：降低因DNCB引起的上升的IgE或IL-6水平、和/或，增加因DNCB引起的降低的IFN-γ、TNF-α或IL-10水平。

第3组实施例、本发明的增强免疫力制品

本组实施例提供一种增强免疫力制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种增强免疫力制品的增强免疫力的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05。

在具体的实施例中，所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述食品还包括食用辅料。

在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段(例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LRa05制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

在一些实施例中，所述增强免疫力包括：促进淋巴细胞增殖和/或调节细胞因子水平；

优选地，所述淋巴细胞指脾脏淋巴细胞；

优选地，所述调节细胞因子水平指：提高因CTX引起的血清中降低的细胞因子的水平；

优选地，所述细胞因子选自：IL-6、IL-10、TNF-α或IgG。

第4组实施例、本发明的缓解湿疹制品

本组实施例提供一种缓解湿疹制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种缓解湿疹制品的缓解湿疹的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)菌株LRa05。

在一些实施例中，所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述食品还包括食用辅料；

在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段(例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LRa05制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

优选地，所述缓解湿疹指：降低因DNCB引起的上升的IgE或IL-6水平、和/或，增加因DNCB引起的降低的IFN-γ、TNF-α或IL-10水平。

实验例1、鼠李糖乳杆菌的分离筛选与鉴定

(1)菌株的分离筛选

采集健康人体粪便样品，取1g至9mL无菌生理盐水中，充分振荡分散样品，取100μL样品梯度稀释，选取合适梯度均匀涂布于MRS琼脂平板上，置于厌氧条件下，37℃培养36～48h后，挑选疑似单菌落，进行革兰氏染色，镜检观察菌落形态特征，初步筛选疑似乳杆菌的菌株。菌株在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，获得乳杆菌纯化菌株，然后，将纯化菌株在-80℃甘油管保藏。

MRS培养基配方(g/L)：蛋白胨10、牛肉浸粉5、酵母粉5、葡萄糖20、无水乙酸钠5、柠檬酸氢二铵2、吐温80 1、K

(2)分子生物学鉴定

对筛选的目的菌株液体扩培，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer 10ul，10mM dNTP 2ul，上下引物各1ul，DNA模板2ul，Taq酶0.5ul，ddH

菌种保藏名称：LRa05

保藏号：CGMCC No.24377

分类命名：鼠李糖乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus rhamnosus

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年1月24日。

实验例2、鼠李糖乳杆菌菌株生长速度比较实验

将菌种资源库中不同鼠李糖乳杆菌菌株和对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG菌株以MRS液体培养基体积计按3％接种于MRS液体培养基中，37℃培养15h，连续活化二代，再以2％接种量转接到10mL/15mL的离心管中，37℃培养，不同时间段取样，分别涂布测定菌株的活菌数。记录不同菌株的最大活菌数见表1，实验重复三次。

由表1可知，8株菌株最大活菌数均高于对照菌株LGG，其中有7株菌株与LGG的最大活菌数有显著性差异，且编号为LR-05的菌株活菌数最高。选择该菌株进行发酵罐放大试验的比较。

表1.不同鼠李糖乳杆菌的最大活菌数结果

实验例3、鼠李糖乳杆菌发酵罐放大比较实验

种子培养：将鼠李糖乳杆菌接入10mL种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子，将活化的一级种子以5％(v/v)的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子。

发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，115℃灭菌20min，以2％(v/v)的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23％碳酸钠维持pH为5.8，通入氮气维持罐压为0.03MPa，发酵10h。所得发酵液中的活菌数见下表2。

所述的种子培养基的配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半胱氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

所述发酵培养基配方为：50g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

表2.鼠李糖乳杆菌发酵液中活菌数

编号LR-05的菌株发酵液中活菌数为1.46×10

实验例4、鼠李糖乳杆菌LRa05胃肠道耐受性实验

模拟人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3％胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

模拟人工肠液：配制PBS溶液，加入0.1％胰蛋白酶和0.3％的牛胆粉，用0.1mol/LNaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

鼠李糖乳杆菌在MRS液体培养基中37℃过夜培养，活化培养2代。将活化后的鼠李糖乳杆菌菌液离心，弃上清，收集菌体，调整菌液浓度是10

表3.鼠李糖乳杆菌LRa05模拟胃肠道耐受实验数据表

上述表3结果表明，鼠李糖乳杆菌LRa05在pH2.5人工胃液中存活率94.68％，在人工肠胆盐液中存活率为97.76％，这说明鼠李糖乳杆菌具有较强的胃肠道耐受能力。

实验例5、抗生素敏感性评价

采用滤纸片扩散法测定抗生素敏感性，将培养至对数期的菌悬液调整浓度为10

根据实验结果可知：鼠李糖乳杆菌LRa05对上述16种抗生素敏感。庆大霉素，苯唑西林和头孢曲松对本细菌有不同程度的抑制作用，而LGG显示耐药性。

表4.鼠李糖乳杆菌LRa05抗生素敏感性实验数据表

实验例6、鼠李糖乳杆菌LRa05自聚能力以及与病原菌共聚能力

菌株的自聚集能力(自聚集率、自聚能力、自聚力)是评价菌株黏附能力的一项指标，是微生物领域的常用术语，本文中的“自聚集”一词具有与《肠炎沙门氏菌耐药性分析及环丙沙星诱导耐药对其毒力的影响》一文中记载的“自聚集”一词相同的含义。

菌株的共聚集能力(共聚集率、共聚能力、共聚力)是评价菌株黏附能力的一项指标，是微生物领域的常用术语，本文中的“共聚集”一词具有与《羊奶源产细菌素乳酸菌筛选、鉴定及益生特性研究》一文中记载的“共聚集”一词相同的含义。

将培养的鼠李糖乳杆菌菌液，离心，收集菌体，用PBS缓冲液冲洗2次后，再用PBS重悬，调至OD600＝0.6。取40mL细胞悬浊液于50mL离心管中，涡旋充分混合后置于37℃条件下孵育，菌悬液孵育24h时后，分别小心吸取上层菌液2.5mL，测定菌悬液在600nm处的吸光值OD，重复3次测定，计算菌株自聚力。自聚力％＝1-(At/Ao)，其中Ao＝起始吸光值，At＝取样时的吸光值。

鼠李糖乳杆菌菌株活化培养2代。将活化后的鼠李糖乳杆菌LRa05菌液离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，然后重悬，调整OD600在0.6左右。病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌分别活化后，离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，然后重悬，调整OD600在0.4左右。取4mL鼠李糖乳杆菌菌液与4mL病原菌菌液等体积混合，涡旋，充分混匀，室温静置孵育2h、5h、21h、24h后，分别吸取上清测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，重复3次测定，计算菌株与病原菌的共聚力。同时以菌株LGG作为对照，该菌株是公认的具有多种益生功能的商业菌株。

由图1可知，在凝集时间为5h，鼠李糖乳杆菌LRa05的自聚力显著高于LGG。鼠李糖乳杆菌LRa05的自聚力在24h时显著增加到37.89％，这表明LRa05能有效粘附肠上皮细胞和防止病原体定植。在凝集时间为5h，与LGG相比，鼠李糖乳杆菌LRa05与大肠杆菌，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌表现出更强的共聚力，尤其是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，共聚力分别为17.37％，14.90％。鼠李糖乳杆菌LRa05与病原菌的共聚力随时间增加而增加，在凝集时间为24h，共聚力最强。这表明鼠李糖乳杆菌LRa05可以通过与病原菌的共聚集的方式来清除病原菌，减少肠道病原菌黏附，更有利发挥益生作用，从而达到改善健康的作用。

实验例7、鼠李糖乳杆菌LRa05的抑菌能力评价

取拮抗菌株按2％(V/V)接种至MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养16-24h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在10

表5.鼠李糖乳杆菌LRa05发酵液对病原菌的抑制作用

结果如表5所示，鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌拮抗直径分别是35mm、23mm、33mm。表现出对肠道致病菌极强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力。

实验例8、鼠李糖乳杆菌LRa05对免疫低下模型小鼠的免疫增强效应

1、实验菌株活化与制备

将实验菌株从-20℃冰箱中取出，接种到MRS液体培养基中，培养好后转接传代，培养至对数生长期。采用平板计数法确定鼠李糖乳杆菌LRa05活菌数，4000r/min离心10min后，用PBS洗涤3次后重悬，配制成浓度为1×10

2、小鼠免疫低下模型建立

选择SPF级BALB/c雌性小鼠(21-24g)36只，在实验室适应3天后，将被随机分成：空白对照组(NC)，模型对照组(MC)，鼠李糖乳杆菌LRa05+环丙酰胺组(CTX)。空白组和模型组灌胃等量生理盐水，连续14天，每日灌胃1次，一次0.2ml。除空白组外，其余组在实验的第7，8，9三天注射剂量为80mg/kg的环磷酰胺。鼠李糖乳杆菌LRa05+CTX组的小鼠从实验第7天用菌液浓度为1×10

3、体重及脏器指数测定

记录实验前后记录每只小鼠体重，实验结束后处死解剖得到脾脏，置于生理盐水中洗去血液，并用滤纸吸干表面残留血水，称重。其中，脾脏指数(mg/g)＝体重脾脏(mg)/体重(g)。结果如图2所示，鼠李糖乳杆菌干预后，最终体重以及脾脏指数显著高于模型组，说明鼠李糖乳杆菌能够显著缓解由免疫低下造成的体重下降，有效缓解脾脏的萎缩和损伤。

4、小鼠淋巴细胞增殖能力测定

实验14天后处死小鼠，无菌取出脾脏，加入Hank’s液清洗3次，每次清洗1000r/min离心10min，然后计数活细胞数，调整细胞浓度为1×10

5、小鼠血清中特异性抗体及细胞因子的测定

实验结束后，取小鼠眼眶血，收集血液室温静置30min，3000r/min离心10min后收集上层血清，采用ELISA酶联免疫法测定每组小鼠外周血中特异性抗体和细胞炎性因子含量。对比空白组和模型组中炎性因子含量(图4)，表明CTX显著降低了小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IgG水平。而喂食鼠李糖乳杆菌LRa05后，血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IgG水平明显高于模型组，说明鼠李糖乳杆菌LRa05干预组，可以调节小鼠体内免疫活性分子含量，进而提升机体免疫水平，提高机体抗病能力。

6、小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量测定

取小鼠盲肠，挤出其中内容物，加入1mL 0.005M NaOH水溶液，与50μL DL-2-甲基丁酸，振荡混合均匀，然后4℃，12000r/min离心20min，并采用气相色谱仪分别测定小鼠肠道中总酸，乙酸，丙酸，丁酸含量。根据下表所示，与模型组相比，益生菌干预组盲肠内容物中总酸含量上升，短链脂肪酸中，乙酸，丙酸，丁酸含量均显著升高，尤其是丁酸含量。

表6.鼠李糖乳杆菌LRa05对小鼠盲肠中短链脂肪酸的影响

7.小鼠血清共轭亚油酸(CLA)含量变化

收集小鼠血清，并采用气相色谱仪测定小鼠血清中CLA含量。与模型组相比，小鼠血清中CLA水平显著下降(P<0.05)，益生菌治疗后，小鼠血清中CLA水平显著提高。CLA是一种具有多种生理活性功能且人体自身不能大量合成，需从食物中获得的必需脂肪酸，具有抗癌、抗动脉粥样硬化、调节免疫力、促进生长发育和减肥等生理功能。试验结果表明，模型小鼠分泌CLA的水平下降，伴随肠道免疫功能的下降，而益生菌治疗后，小鼠血清中CLA含量上升，说明在小鼠肠道内该益生菌菌剂有较高活性，转化CLA能力较强，且CLA协同增加肠道免疫能力。

表7.血清中共轭亚油酸含量

实验例9、鼠李糖乳杆菌LRa05对小鼠湿疹的改善作用

1、实验菌株活化与制备

将实验菌株从-20℃冰箱中取出，接种到MRS液体培养基中，培养好后转接传代，培养至对数生长期。菌液4000r/min离心10min后，用PBS洗涤3次后重悬，配制成浓度为1×10

2、小鼠湿疹模型建立

实验使用6周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠36只，在实验室适应3天后，将被随机分成：空白对照组(NC)，模型对照组(MC)，益生菌组。益生菌组先接受一周含鼠李糖乳杆菌LRa05的饲料(15mL鼠李糖乳杆菌LRa05与40g饲料混合)，每日2次，使细菌在小鼠肠道内定植。其余空白组和模型组喂食等量生理盐水。之后对模型组和益生菌组小鼠，用剃须刀和除毛剂去除小鼠毛发，连续3天使用50μL浓度为2％2，4-二硝基氯苯组(DNCB)诱导皮肤致敏。48小时后，用50μL浓度为1％DNCB，连用3天。观察到小鼠耳上有明显肿胀、红斑，水肿，丘疹等过敏反应，表示建模成功。然后，益生菌组小鼠再次喂食含有鼠李糖乳杆菌LRa05的饲料，小鼠被允许自由进食，持续10天。

3.小鼠耳厚、耳肿胀度测定

用游标卡尺测定右耳厚度。耳肿胀是平均右耳的厚度值，耳肿胀程度可以反映炎症的严重程度，小鼠被处死后，立即用6mm穿孔器取出耳组织样本，然后称重。以肿胀程度定义左右耳的重量差。计算公式：肿胀度＝右耳片重量﹣左耳片重量，实验结果如表8。

表8.鼠李糖乳杆菌LRa05对耳肿胀度的影响

实验期间，刺激迟发型超敏反应(DTH)后，DNCB小鼠皮肤症状逐渐加重，小鼠右耳出现明显肿胀。而益生菌治疗组小鼠耳廓肿胀明显改善，说明鼠李糖乳杆菌LRa05对患湿疹小鼠有显著改善作用。

4.小鼠的体重，胸腺指数，脾脏指数测定

小鼠处死后，进行解剖，称重各组小鼠胸腺和脾脏，分别计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数＝胸腺重量/小鼠体重，脾脏指数＝脾脏重量/小鼠体重。实验结果见表9。

表9.鼠李糖乳杆菌LRa05对小鼠体重、胸腺指数和脾脏指数的影响

三组实验小鼠体重差异不显著，这表明湿疹对小鼠体重没有明显影响。观察湿疹对各组胸腺指数、脾脏指数的影响，与空白组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数均升高。与模型组比较，益生菌组小鼠胸腺指数、脾脏指数均显著小于模型组，基本恢复到正常水平。结果表明，DNCB引起的湿疹会损伤小鼠免疫器官，而鼠李糖乳杆菌LRa05对湿疹小鼠免疫器官损伤有一定的改善作用。

5.小鼠血清中特异性抗体及细胞因子含量测定

将小鼠处死后眼眶采血，将血液在室温下静置30min后，3000r/min离心10min获得血清，收集后转入离心管，﹣20℃保存待用。采用96孔板酶联免疫吸附试验测定IgE含量(图5)以及Th-1细胞因子(TNF-α和IFN-γ)、Th-2细胞因子(IL-6)的浓度、Treg型细胞因子IL-10(图6)。均使用相应的ELISA试剂盒对小鼠血清进行检测。

由图5中可知，空白组与湿疹组相比，血清中总IgE的含量由5.29±1.23ng/mL增加至15.29±1.68ng/mL，表明由DNCB引起的湿疹小鼠免疫反应显著增强。而鼠李糖乳杆菌LRa05与湿疹组相比，总IgE的含量降低至7.56±1.04ng/mL，这表明鼠李糖乳杆菌LRa05显著降低血清中IgE(P﹤0.05)的分泌水平，抑制小鼠血清中特异性抗体的升高，缓解了过敏反应，从而改善小鼠湿疹症状。

从图6显示的结果可看出，与空白组相比，患湿疹小鼠Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌显著降低、Treg型细胞因子IL-10显著降低，Th2型细胞因子IL-6显著增加，喂食鼠李糖乳杆菌LRa05后，IL-10的分泌显著增加(P﹤0.05)，表明鼠李糖乳杆菌LRa05能诱导初始T细胞向Treg细胞分化，增强机体的免疫耐受，维持免疫平衡。IFN-γ、TNF-α的分泌水平显著增加(P﹤0.05)，而IL-6的分泌水平显著降低(P﹤0.05)，说明鼠李糖乳杆菌LRa05对由DNCB引起的炎症模型小鼠表现出抗炎作用，可以通过诱导Th1和Treg细胞的分化，从而抑制Th2细胞的极化，调节T细胞平衡，从而达到抵抗炎症，缓解机体湿疹的目的。

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<110> 微康益生菌(苏州)股份有限公司

<120> 鼠李糖乳杆菌菌株LRa05在制备增强免疫力制品和/或缓解湿疹制品方面的用

途

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