具有可调的亲和力的免疫调节蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月17日提交的题为“具有可调的亲和力的免疫调节蛋白”的美国临时申请号62/149,437，以及2015年9月14日提交的题为“具有可调的亲和力的免疫调节蛋白”的美国临时申请号62/218,534的优先权，其各自内容通过引用其全文纳入本文。

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技术领域

本发明涉及用于癌症和免疫性疾病治疗中调整免疫应答的治疗性蛋白质。

背景技术

通过对发生在由抗原呈递细胞(APC)或靶细胞和淋巴细胞之间形成的免疫突触(IS)中的过程进行干扰来调整免疫应答受到越来越多的医学关注。当前，用于增强或抑制免疫应答的生物制剂通常限于免疫球蛋白(例如，抗-PD-1mAb) 或可溶性受体(例如，Fc-CTLA4)。可溶性受体具有许多缺陷。尽管其有助于拮抗蛋白质之间的相互作用，但是可溶性受体常常缺少激动这种相互作用的能力。抗体经证实在这一方面受到较少限制，并且激动活性的和拮抗活性抗体的示例是本领域已知的。然而，可溶性受体和抗体两者都缺少对于在IS中作用至关重要的重要属性。在机理上，IS中细胞表面蛋白质可以涉及多个蛋白质靶标与其结合的单一蛋白质的协调且通常同时的相互作用。IS相互作用的发生与两个细胞的连接密切相关，并且在该结构中的单一蛋白质有可能同时与相同细胞(顺式)上的蛋白质以及相关联细胞(反式)上的蛋白质两者相互作用。因此，需要改进的分子对免疫应答进行调整。提供了满足上述需求的实施方式。

发明内容

本文提供了显示出对于作为涉及免疫应答的免疫蛋白配体的结合伴侣具有改变的结合亲和力的免疫调节蛋白。在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白可以调整，例如加强或减弱，免疫蛋白配体的活性，因此调整免疫应答。在一些实施方式中，例如，在通过免疫应答的调整可以治疗的疾病或病症的免疫疗法治疗中，还提供了通过将表达一种或多种免疫蛋白配体的细胞与提供的免疫调节蛋白接触来调整免疫应答的方法和应用。

在一些实施方式中，本文提供的是免疫调节蛋白，其含有至少一个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，所述免疫球蛋白超家族结构域含有在野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代，其中：至少一个亲和力修饰的IgSF结构域相较于野生型IgSF结构域具有对至少两个关联结合伴侣增强的结合；并且至少一个亲和力修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。在一些实施方式中，至少两个关联结合伴侣是表达在哺乳动物细胞表面的细胞表面分子。在一些实施方式中，细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中的一个，并且细胞表面分子各自表达在形成IS的两个哺乳动物细胞中的至少一种上。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生增强的免疫活性。在一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生减弱的免疫活性。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是肿瘤细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域能够特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

在如上所述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，野生型IgSF结构域来自IgSF家族成员，所述IgSF家族成员选自家族：信号调节蛋白(SIRP)家族、表达在骨髓细胞样上的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子 (CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白 (Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG) 家族、V-集跨膜结构域家族(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR) 、连接蛋白(Nec)家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关 (PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白 (TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是IgSF成员，其选自：CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、 CD200、CD200R或Nkp30。在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是人IgSF成员。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，野生型IgSF结构域是IgV 结构域、IgC1结构域、IgC2结构域或其特异性结合片段。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的IgV结构域、亲和力修饰的IgC1结构域或亲和力修饰的IgC2结构域或其含有一个或多个氨基酸取代的特异性结合片段。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方式中，非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自与不同的关联结合伴侣结合，其中两个亲和力修饰的 IgSF结构域特异性地非竞争性结合至少两个不同的关联结合伴侣。在一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自含有在相同的野生型 IgSF结构域中一个或多个不同的氨基酸取代。在一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自含有在不同野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，不同野生型IgSF结构域来自不同的IgSF家族成员。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白只含有一个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二亲和力修饰的IgSF，其中第二亲和力修饰的IgSF含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，野生型IgSF结构域是B7 家族的成员。在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是CD80、CD86或ICOSLG 的结构域。在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是CD80的结构域。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，本文提供的是免疫调节蛋白，其含有至少一个亲和力修饰的CD80免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，所述 CD80免疫球蛋白超家族结构域含有在野生型CD80 IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代，其中至少一个亲和力修饰的CD80 IgSF结构域相较于野生型CD80 IgSF 结构域具有对至少两个关联结合伴侣增强的结合。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，关联结合伴侣是CD28和 PD-L1。在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是IgV结构域和/或亲和力修饰的 CD80结构域是亲和力修饰的IgV结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域含有与野生型CD80结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的 IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过20个氨基酸取代。在一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过10个氨基酸取代。在一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的 IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过5个氨基酸取代。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与至少两个关联结合伴侣各自的结合亲和力的至少120％。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白还含非亲和力修饰的IgSF结构域。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或细胞质结构域。在一些实施方式中，免疫调节蛋白只含有细胞外结构域(ECD)或其含有亲和力修饰的IgSF结构域的特异性结合片段。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白连接多聚化结构域。在一些实施方式中，免疫调节蛋白连接Fc结构域或其效应功能降低的变体。在一些实施方式中，Fc结构域是IgG1结构域、IgG2结构域或其效应功能降低的变体。在一些实施方式中，Fc结构域是哺乳动物的，任选人的；或变体Fc结构域相较于未修饰的哺乳动物的，任选人的FC结构域含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，Fc结构域或其变体含有SEQID NO:226或SEQ ID NO:227 所示的氨基酸序列，或显示出与SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:227至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白通过接头间接地连接。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是二聚体。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白附着于在脂质体膜。

还提供了含有至少两个非免疫球蛋白免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的免疫调节蛋白质，其中：至少一个是亲和力修饰的IgSF结构域，并且至少两个非免疫球蛋白IgSF结构域各自独立地结合至少一个不同的结合伴侣。在一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白IgSF结构域非竞争性地结合不同的结合伴侣。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有在第一野生型或未修饰的IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，IgSF结构域的另一个是野生型或未修饰的IgSF结构域。在一些实施方式中，IgSF结构域的另一个同样是亲和力修饰的IgSF结构域。

在上述的任何免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的非免疫球蛋白IgSF结构域(第一亲和力修饰的IgSF结构域和第二亲和力修饰的IgSF结构域)，其中第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域含有在第一野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代，并且第二非免疫球蛋白修饰的IgSF 结构域含有含有在第二野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代，并且其中第一和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自特异性地结合至少一个不同的关联结合伴侣。在一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白IgSF结构域非竞争性地结合不同的结合伴侣。在一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的，以显示与其关联结合伴侣改变的结合。因此，在一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域相较于第一野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一显示出改变的结合；并且第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域相较于第二野生型IgSF结构域显示出预期关联结合伴侣中至少一个改变的结合。在一些实施方式中，改变的结合是独立地增强或减弱。

在一些实施方式中，不同的关联结合伴侣是表达在哺乳动物细胞表面的细胞表面分子。在一些实施方式中，不同细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中的一个，并且不同细胞表面分子各自表达在形成IS的两个哺乳动物细胞中至少其一上。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。在一些实施方式中，免疫调节蛋白与细胞的结合调整淋巴细胞的免疫活性。在一些实施方式中，该免疫调节蛋白相较于含有野生型 IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生增强的免疫活性。在一些实施方式中，该免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生减弱的免疫活性。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是肿瘤细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中，免疫调节蛋白能够特异性地结合形成 IS的两个哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，根据上述的任一种免疫调节蛋白，第一和第二修饰的 IgSF结构域各自含有在不同野生型IgSF结构域中一个或多个不同的氨基酸取代。在一些实施方式中，不同野生型IgSF结构域是来自不同的IgSF家族成员。因此，在一些实施方式中，第一和第二修饰的IgSF结构域是非野生型组合。在一些实施方式中，第一野生型IgSF结构域和第二野生型IgSF结构域各自独立地来自IgSF 家族成员，所述IgSF家族成员选自家族：信号调节蛋白(SIRP)家族、表达在骨髓细胞样上的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM) 家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白(Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG)家族、V-集跨膜结构域家族(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)、连接蛋白(Nec) 家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白(TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。在一些实施方式中，第一野生型IgSF结构域和第二野生型IgSF结构域各自独立地来自IgSF成员，其选自：CD80、CD86、 PD-L1、PD-L2、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA 、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、 CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R或Nkp30。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一修饰的IgSF结构域和第二修饰的IgSF结构域各自独立地含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是B7家族的成员。在一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF 结构域各自独立地来自CD80、CD86或ICOSLG。在一些实施方式中，第一或第二野生型IgSF结构域来自B7家族的成员，并且第一或第二野生型IgSF结构域的另一个来自另一个IgSF家族。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域来自ICOSLG和NKp30。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域来自CD80和NKp30。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是人IgSF成员。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是IgV结构域、IgC1结构域、IgC2结构域或其特异性结合片段。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的结构域和第二非免疫球蛋白修饰的结构域各自独立地是修饰的IgV结构域、修饰的IgC1结构域或修饰的IgC2结构域或其含有一个或多个氨基酸取代的特异性结合片段。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的结构域或第二非免疫球蛋白修饰的结构域至少中至少其一是修饰的IgV结构域。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过20个氨基酸取代。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过10个氨基酸取代。在一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过5个氨基酸取代。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一或第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域中至少其一具有的结合亲和力是野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的10％和90％。在一些实施方式中，第一或第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域中至少其一所具有的结合亲和力是野生型 IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的至少120％。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地所具有结合亲和力是野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的至少120％。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白连接多聚化结构域。在一些实施方式中，免疫调节蛋白连接Fc结构域或其效应功能降低的变体。在一些实施方式中，Fc结构域是IgG1结构域、IgG2结构域或其效应功能降低的变体。在一些实施方式中，Fc结构域是哺乳动物的，任选人的；或变体Fc结构域相较于未修饰的哺乳动物的，任选人的FC结构域含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，Fc结构域或其变体含有SEQID NO:226或SEQ ID NO:227 所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:227至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，变体CD80多肽通过接头间接地连接。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白是二聚体。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有一个或多个其它非免疫球蛋白IgSF结构域，其是与第一或第二非免疫球蛋白修饰的 IgSF结构域相同的或不同的。在一些实施方式中，一个或多个其它非免疫球蛋白 IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。

在上述的任一种免疫调节蛋白的一些实施方式中，免疫调节蛋白附着于在脂质体膜。

在一些实施方式中，本文所提供了核酸分子，其编码上述的任一实施方式的免疫调节多肽。一些实施方式中，核酸分子是合成的核酸。一些实施方式中，核酸分子是cDNA。

在一些实施方式中，本文所提供了载体，其含有根据上述的任一实施方式的核酸分子。在一些实施方式中，载体是表达载体。

在一些实施方式中，本文所提供了细胞，其含有根据上述的任一实施方式的载体。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞或原核细胞。

在一些实施方式中，本文提供了生产免疫调节蛋白的方法，其包括将如上所述的任一实施方式的核酸分子或如上所述任一实施方式的载体在细胞内表达蛋白质的条件下引入宿主细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括从细胞分离或纯化免疫调节蛋白。

在一些实施方式中，本文提供了药物组合物，其含有上述的任一实施方式的免疫调节蛋白。在一些的实施方式中，药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物是无菌的。

在一些实施方式中，本文所提供了制品，其含有药瓶中的上述的任一实施方式的药物组合物。在一些实施方式中，药瓶是密封的。

在一些实施方式中，本文所提供了试剂盒，其包括上述的任一实施方式的药物组合物，以及使用说明。

在一些实施方式中，本文所提供了试剂盒，其包括上述的任一实施方式的制品，以及使用说明。

在一些实施方式中，本文提供了在对象中调整免疫应答的方法，其包括向对象给予治疗有效量的上述的任一实施方式的免疫调节蛋白。在一些实施方式中，调整免疫应答治疗对象中的疾病或病症。在一些实施方式中，免疫应答是增强的。在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，疾病或病症选自：黑素瘤、肺癌、膀胱癌或恶性血液肿瘤。在一些实施方式中，免疫应答是减弱的。在一些实施方式中，所述疾病或病症是炎性疾病或病症。在一些实施方式中，疾病和病症选自：克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，多发性硬化症，哮喘，类风湿性关节炎或牛皮癣。

在一些实施方式中，本文提供了鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白的方法，其包括：a)将含有至少一个非免疫球蛋白修饰免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域或其特异性结合片段修饰的蛋白质与至少两个关联结合伴侣在能够令蛋白质与至少两个关联结合伴侣结合的条件下接触，其中至少一个修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代；b)b)鉴定相较于含有野生型IgSF 结构域的蛋白质对两个关联结合伴侣中至少其一结合具有增强的含修饰的IgSF结构域的修饰蛋白质；和c)选择非竞争性地结合至少两个关联结合伴侣的含修饰 IgSF结构域的修饰蛋白质，从而鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白。在一些实施方式中，步骤b)包括鉴定相较于含有野生型结构域的蛋白质，对至少两个关联结合伴侣结合都增强的含修饰IgSF结构域修饰蛋白质。在一些实施方式中，先于步骤a)，在野生型IgSF结构域中引入一个或多个氨基酸取代，从而生成含有修饰的IgSF 结构域的修饰的蛋白质。在一些实施方式中，修饰的蛋白质含有至少两个修饰的 IgSF结构域或其特异性结合片段，其中第一IgSF结构域含有在第一野生型IgSF 结构域中一个或多个氨基酸取代，并且第二非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域含有在第二野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自特异性地结合至少一个不同的关联结合伴侣。

在一些实施方式中，还提供了含有至少一个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的免疫调节蛋白质。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合至少两种细胞表面分子。在一些实施方式中，各种分子物质表达在形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中至少其一上。在一些实施方式中，分子物质是顺式构型或反式构型。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中的一个是淋巴细胞，并且亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域，并且免疫调节蛋白特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的IgSF结构域，其中亲和力修饰的IgSF结构域与IgSF结构域不是同种的。

在一些实施方式中，两个哺乳动物细胞中的一个是肿瘤细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、食蟹猴或人细胞。

在一些实施方式中，IgSF细胞表面分子是人IgSF成员。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有亲和力修饰的哺乳动物IgSF成员。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的IgV、IgC1或IgC2 结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域与其野生型IgSF结构域的区别在于至少1个并且不超过10个氨基酸取代。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域与其野生型IgSF结构域的区别在于至少1个并且不超过5个氨基酸取代。

在一些实施方式中，亲和力修饰的人IgSF成员是CD80、PVR、ICOSLG或 HAVCR2中的至少一种。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域包含至少一个亲和力修饰的人CD80结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是人CD80 IgSF结构域。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-27的氨基酸序列或其片段至少85％的序列同一性。在一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自 SEQ ID NO:1-27的氨基酸序列或其片段至少90％的序列同一性。在一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-27的氨基酸序列或其片段至少95％的序列同一性。在一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-27的氨基酸序列或其片段至少99％的序列同一性。在一些实施方式中，具有与选自SEQ ID NO:1-27的氨基酸序列或其片段至少85％、90％、95％或99％的序列同一性的免疫调节蛋白还含有第二免疫调节蛋白，其中第二免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO: 1-27的氨基酸序列或其片段至少85％、90％、95％或99％的序列同一性。

在一些实施方式中，免疫活性被增强。在另外一些中其被抑制。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的10％和90％之间。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合正好一个IgSF成员。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的至少120％

在一些实施方式中，免疫调节蛋白是与抗体可结晶片段(Fc)直接或间接共价结合的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白被包埋在脂质体膜中。在一些实施方式中，免疫调节蛋白通过分子间二硫键二聚化。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白在药学上可接受的运载体之中。

在另一方面，提供了含有至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的免疫调节蛋白。亲和力修饰的IgSF结构域各自特异性地结合其自身细胞表面分子。各种分子物质表达在形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中至少其一上，并且哺乳动物细胞中的一个是淋巴细胞。分子物质，在一些实施方式中，是顺式构型或反式构型。亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个竞争性地结合。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域与IgSF结构域不是同种。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是非野生型组合。在一些实施方式中，细胞表面分子是人IgSF成员。在一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的 IgSF结构域是来自如下至少一种：CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG 、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B 、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160 、CD200、NKp30或CD200R1。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两种亲和力修饰的哺乳动物IgSF 成员。在一些实施方式中，哺乳动物IgSF成员是人IgSF成员。在一些实施方式中，哺乳动物IgSF成员是如下至少两种：CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG 、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B 、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160 、CD200、NKp30或CD200R1。在一些实施方式中，免疫活性被增强。在一些实施方式中，免疫活性被抑制。在一些实施方式中，两个哺乳动物细胞中的一个是肿瘤细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、食蟹猴或人细胞。在一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中至少其一具有的结合亲和力是野生型IgSF结构域与细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的10％和90％。在一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个特异性地结合正好一个细胞表面分子。在一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的至少120％。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是IgV、IgC1或IgC2结构域中的至少一种。在一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的IgSF结构域的每一个与其野生型IgSF结构域的区别在于至少1个并且不超过10个氨基酸取代。在一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的IgSF结构域的每一个与其野生型IgSF结构域的区别在于至少1个并且不超过5个氨基酸取代。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是与抗体可结晶片段(Fc)直接或间接共价结合的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白在药学上可接受的运载体之中。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或 PEG化的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。在一些实施方式中，免疫调节蛋白被包埋在脂质体膜中。在一些实施方式中，免疫调节蛋白通过分子间二硫键二聚化。

在另一方面，本发明涉及编码任意上述总结的免疫调节蛋白的重组核酸。

在另一方面，本发明涉及含有编码任意上述总结的免疫调节蛋白的重组核酸的重组表达载体。

在另一方面，本发明涉及含有上述总结的表达载体的重组宿主细胞。

在另一方面，本发明涉及制造任意上述总结的免疫调节蛋白的方法。该方法包括在免疫调节蛋白表达条件下培养重组宿主细胞，表达由本文的重组表达载体编码的免疫调节蛋白质，以及纯化因此表达的重组免疫调节蛋白。

在另一方面，本发明涉及治疗需要增强的或抑制的免疫应答的哺乳动物患者的方法，通过给予治疗有效量的任意上述的实施方式的免疫调节蛋白。在一些实施方式中，增强的免疫应答治疗患者的黑素瘤、肺癌、膀胱癌或恶性血液肿瘤。在一些实施方式中，抑制的免疫应答治疗患者的克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，多发性硬化症，哮喘，类风湿性关节炎或牛皮癣。

附图简要说明

图1A描述了生物素化的重组CD28 Fc融合蛋白(rCD28.Fc)与固定的CD80 变体A91G ECD-Fc融合分子在未标记的重组人PD-L1-his、人CTLA-4-his或人 -PD-L2-Fc融合蛋白存在下的结合的竞争结合试验结果。

图1B描述了生物素化的重组人PD-L1-his单体蛋白与固定的CD80变体A91G ECD-Fc融合分子在未标记的重组人rCD28.Fc、人CTLA-4.Fc或人PD-L2.Fc存在下的结合的竞争结合试验结果。

参考文献的引用

本说明书中所提及的所有出版物，包括专利、专利申请、科学文章和数据库通过引用全文纳入本文用于所有目的，就如将各篇单独的发表物和专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。就如同各出版物，包括专利、专利申请、科学文章或数据库被具体且单独地指明通过引用纳入本文。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。

具体实施方式

本文提供了可溶性免疫调节蛋白，其能够结合一个或多个蛋白配体，并且通常是两个或多个蛋白配体，从而调整，例如，诱导、增强或抑制免疫学的免疫应答。在一些实施方式中，蛋白配体是由免疫细胞表达的细胞表面蛋白，其与例如在淋巴细胞上的一种或多种其它免疫受体接合以诱导抑制或活化信号。例如，淋巴细胞上某些受体与其关联细胞表面配体的相互作用以形成抗原呈递细胞(APC)或靶细胞和淋巴细胞之间的免疫突触(IS)可以提供可以调节免疫系统的共刺激或抑制信号。在一些方面，本文提供的免疫调节蛋白可以改变细胞表面蛋白配体与其受体的相互作用，从而调整免疫细胞，如T细胞活性。

在一些实施方式中，在正常生理条件下，T细胞介导的免疫应答通过T细胞受体(TCR)进行的抗原识别启动，并且通过共刺激和抑制信号的平衡(即免疫检查点蛋白质)进行调节。免疫系统依靠免疫检查点预防自身免疫(即自身耐受)并且在免疫应答期间保护组织免受过度损伤，例如在针对病原体感染的攻击期间。然而，在一些情况中，作为回避免疫系统的一种机制，这些免疫调节蛋白可能在包括肿瘤的疾病或病症中失调。

因此，在一些方面，改变免疫细胞活性，例如T细胞活性的免疫疗法可以治疗某些免疫应答失调的(dysregulated)疾病和病症。寻求在IS内调整相互作用的治疗方法将受益于同时结合多个IS靶标的能力以及以对时间序列和空间方向敏感的方式。如今的治疗方法并没有达到这个目标。相反，可溶性受体和抗体通常一次结合不超过单一的靶标蛋白。这可能是由于并不存在超过单一的靶标物质。此外，野生型受体和配体对于关联结合伴侣具有低亲和力，这排除了它们作为可溶性治疗剂的应用。

然而，不太重要地是，可溶性受体和抗体常常竞争性结合(例如，一次不超过一个靶标物质)并且因此缺少同时结合多个靶标的能力。并且尽管双特异性抗体，以及含有双抗原结合区域的形态可以同时结合超过一个靶标分子，这些形态的典型三维构型常以与它们时间和空间要求相一致的方式排除它们干预IS中发生的关键过程。

需要的是完全新型的治疗性分子，其具有抗体或可溶性受体的特异性和亲和力，但是除此之外，保持IS所需的尺寸、体积、和空间方向约束，并且对于相应的结合伴侣具有增强的亲和力。此外，这样的治疗剂应具有非竞争性以及竞争性结合其靶标的能力。具有这些性质的分子可以因此在整合到IS处的多蛋白质复合物中的能力中具有新功能，并且生成所需的结合构型和最终生物活性。

为此，新兴的免疫肿瘤治疗方案需要安全地破坏肿瘤诱导的T细胞耐受。当前最先进的免疫治疗剂阻断PD-1或CTLA4——已知限制T细胞效应物功能的 B7/CD28家族的中枢抑制性分子。虽然针对这样的单一靶标的拮抗性抗体起到瓦解免疫突触检查点信号传导复合物的作用，但是它们不能同时激活T细胞。相反地，双特异性抗体方法激活T细胞，但不足以同时阻断调节诱导信号的抑制性配体。

为了解决这些缺点，提供了这样的治疗性分子，在一些实施方式中，其将同样刺激T细胞活化信号传导并同时阻断抑制性调节。在一些实施方式中，提供的免疫调节蛋白涉及免疫突触的免疫球蛋白超家族(IgSF)组分，已知其在T细胞活化和抑制性配体的阻断两者中具有双重作用。在具体方面中，提供的免疫调节蛋白提供了使用亲和力修饰的天然免疫配体的免疫治疗平台以生成免疫治疗生物制剂，其在各种肿瘤和免疫适应症的治疗中以可调的亲和力结合其关联免疫受体中的一种或多种。在一些方面，由免疫系统配体，例如人免疫系统配体改造的基于IgSF 的治疗剂本身更有可能保留它们正常组装成免疫突触的关键途径，并且以抗体或下一代双特异性试剂不可以保持的方式保持正常的相互作用和调节功能的能力。这是由于抗体相对大的尺寸，以及它们不是免疫突触的自然组分的事实。人类免疫系统配体的这些独特特征有望提供免疫治疗效率和安全性的新水平。

本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。

I.定义

除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。

本说明书中所使用的所有术语定义如下，除非在具体实例中另外限制。本说明书和所述权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物，除非上下文另有明确说明。除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语、首字母缩写词、和缩略语均与本发明所属领域技术人员的通常理解一致。除非另外指定，化学和生物学名称的缩略语和符号是按照IUPAC-IUB命名。除非另外指定，所有数值范围包括定义范围的值以及其间的所有整数值。

在免疫球蛋白超家族结构域上下文中所用的术语“亲和力修饰的”，指具有改变的氨基酸序列的(相对于野生型对照IgSF结构域)哺乳动物免疫球蛋白超家族 (IgSF)结构域，并因此其相较于野生型(即非亲合力修饰的)IgSF对照结构域，对于其关联结合伴侣中至少一个具有增强的或减弱的结合亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。在一些实施方式中，IgSF结构域可以包括在野生型或未修饰的IgSF 结构域中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸差异，例如氨基酸取代。具有改变的氨基酸序列(相对于野生型对照IgSF结构域)，但是相较于野生型IgSF对照结构域，对于其关联结合伴侣中至少一个并不具有增强的或减弱的结合亲和力或亲合力的IgSF结构域是非亲和性修饰的IgSF结构域。结合亲和力或亲合力的增强或减弱可以使用已知结合试验，例如流式细胞术确定。Larsen 等,美国移植学报(AmericanJournal of Transplantation),卷5:443-453(2005).。同样参见，Linsley等,免疫力(Immunity),1:7930801(1994).。蛋白质对其关联结合伴侣的结合亲和力或亲合力的增强是其所到数值比野生型IgSF结构域对照的大至少10％，并且在一些实施方式中，是比野生型IgSF结构域对照数值大至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其关联结合伴侣中的至少一个的结合亲和力或亲合力的减弱是其所到数值不大于对照的90％但不小于野生型IgSF结构域对照数值的10％，并且在一些实施方式中，不大于80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于野生型IgSF 结构域对照数值的10％。亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列通过氨基酸残基的取代、添加或删除进行改变。术语“亲和力修饰的IgSF结构域”不应被解释为对产生亲和力修饰的IgSF结构域的任何特定起始组合物或方法所施加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域并不限于其后通过任何特定的亲和力修饰步骤转化成亲和力修饰的IgSF结构域的野生型IgSF结构域。亲和力修饰的IgSF 结构域多肽可以，例如，由野生型哺乳动物IgSF结构域序列信息开始生成，然后在计算机中对其关联结合伴侣的结合进行模拟建模，并且最终重组或化学合成产生亲和力修饰的IgSF结构域物质组合物。在另一实施例中，亲和力修饰的IgSF结构域可以通过野生型IgSF结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的IgSF结构域表示产物，而且不必须是通过任何给定的过程产生的产物。可以使用各种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。

本文所用术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别指蛋白质在特定结合条件下对其关联结合伴侣的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力表示个体非共价的结合相互作用的多种亲和力累积强度，如IgSF结构域和其关联结合伴侣之间的。因此，亲合力是区别于亲和力的，亲和力是描述单一相互作用的强度。用于确定结合亲和力或亲合力的方法是本领域所熟知的。参见，例如，Larsen等,美国移植学报(American Journal of Transplantation),卷5: 443-453(2005)。

术语“生物半衰期”表示物质，如本发明的免疫调节多肽失去其一半的药学或生理活性或浓度所需花费的时间。物质的清除、排泄、降解(例如，酶促的)，或身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩可以影响生物半衰期。在一些实施方式中，可以通过物质的血浆浓度到达其稳态水平的一半(“血浆半衰期”)所需时间对生物半衰期进行评估。可以用于衍生和增加本发明的多肽的生物半衰期的偶联物为本领域所熟知，并且其包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN (延伸重组肽；参见WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)、聚谷氨酸(谷氨酰化) 。

术语“关联结合伴侣”，就蛋白质，如IgSF结构域或亲和力修饰的IgSF结构域而言，表示参照的蛋白质在特定结合条件下特异性地结合的至少一个分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。受体的关联结合伴侣的一个示例是：在特定结合条件下识别并且特异性地结合其关联受体的配体物质。“关联细胞表面结合伴侣”是表达在哺乳动物细胞表面上的关联结合伴侣。在本发明中，“细胞表面分子”是免疫突触(IS) 的关联结合伴侣，其表达在如哺乳动物细胞的细胞上并由该细胞表达，所述细胞形成免疫突触。

本文所用术语“竞争性结合”指蛋白质能够特异性地结合至少两个关联结合伴侣，但是一个关联结合伴侣的特异性结合抑制，如阻止或排除第二个关联结合伴侣的同时结合。因此，在一些情况中，蛋白质不可能在相同时间结合两个关联结合伴侣。通常，竞争性结合物(binder)含有用于特异性结合的相同或重叠的结合位点，但是这不是必须的。在一些实施方式中，由于第二关联结合伴侣的特异性结合，竞争性结合引起蛋白质与其关联结合伴侣之一的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法可以对竞争性结合进行定量，如ELISA(酶联免疫吸附测定)试验。

本文所用术语“保守性氨基酸取代”指氨基酸残基由另一个具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基所取代的氨基酸取代。具有相似化学性质的侧链的一组氨基酸的示例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸，亮氨酸、和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；5) 碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7) 含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。

术语“对应于”就蛋白质的位置而言，例如引述“对应于”公开的序列中的核苷酸或氨基酸位置的核苷酸或氨基酸位置，例如在在序列表中所示，表示根据结构序列比对或采用标准比对算法，例如GAP算法在与公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员能够鉴定对应的残基，例如，采用保守的和相同的氨基酸残基作为导向来鉴定。

术语“细胞因子”包括，例如，但不限于白细胞介素、干扰素(IFN)、趋化因子、造血生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)、和转化生长因子。总的来说，这些是调节免疫系统细胞成熟、活化、增殖、和分化的小分子量蛋白质。

本文所用术语“减弱”或“衰减”或“抑制”指统计上显著数量的降低。降低可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。

术语“衍生物”或“衍生的”表示通过将免疫调节蛋白直接或间接地共价连接对免疫调节蛋白的修饰，从而在改变如半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性，毒性、效力(potency)，或功效(efficacy)这些特性时保留或增强其治疗益处。衍生物可以通过糖基化、PEG化、酯化或Fc融合制造。

如本文所用，结构域(通常是3或更多个，通常是5或7或更多个氨基酸，如10至200个氨基酸残基的序列)表示分子的一部分，例如蛋白质或编码核酸，其与分子的其它部分结构和/或功能不同并且是可以鉴定的。例如，结构域包括这样的多肽链部分，其可以在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或借助功能性活性，如结合活性被识别。蛋白质可以具有1个或超过1个不同的结构域。例如，可以通过一级序列或结构与相关家族成员的同源性(例如与基序的同源性)鉴定、界定或区分结构域。在另一实施例中，可以通过结构域的功能区分结构域，例如与生物分子(例如关联结合伴侣)相互作用的能力区分结构域。结构域可以独立地展现出生物功能或活性，因而独立地或与其它分子融合的结构域可以具有活性，例如，结合。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽含有多个结构域。这样的结构域是已知的，并且可以被本领域技术人员所鉴定。对于本文的示例，提供了定义，但是应该理解的是，本领域技术人员能够通过名称来识别特定的结构域。如果需要，可以使用适合的软件鉴定结构域。应当理解的是，考虑到氨基酸，包括SEQ ID NO中所示的用于描述IgSF结构域的结构域组织的特定序列是用于解释的目的，并且不意味着限制提供的实施方式的范围。应当理解的是，多肽和其结构域的描述理论上是衍生自根据与相似分子的同源性分析和比对。因此，确切的基因座可以是不同的，并且对于各蛋白质不一定是相同的。因此，特定IgSF结构域，如特定IgV结构域或IgC结构域可以是长或短几个氨基酸(1、2、3或4)。

本文所用术语“胞外域”表示如跨膜蛋白的膜蛋白的位于液胞膜外的区域。胞外域常包含结合结构域，其特异性地结合配体或细胞表面受体。细胞跨膜蛋白的胞外域也被称为细胞外结构域。

术语“有效量”或“治疗有效量”表示当将本发明的治疗性组合物离体(通过与来自患者的细胞接触)或体内(通过给予患者)单独地(即，作为单一疗法)或与其它治疗性制剂组合的方式给予之时，通过例如改善或消除疾病的症状和/或病因，产生对疾病进展统计学上显著的抑制的本发明的治疗性组合物的数量和/或浓度。治疗免疫系统疾病或紊乱的有效量可以是缓解、减轻或缓和至少一种与疾病或紊乱相关联的症状或生物反应或影响，防止疾病或紊乱的进展，或改善患者的身体功能的量。在一些实施方式中，所述患者是人类患者。

本文所用术语“增强的”或“增加的”在增强哺乳动物淋巴细胞的免疫活性上下文中是指增加，例如，统计学上显著量的干扰素γ(IFN-γ)的产生。在一些实施方式中，免疫活性可以在混合的淋巴细胞反应(MLR)试验中进行评估。进行MLR 试验的方法为本领域所熟知。Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res).2014 九月:2(9):846-56。在一些实施方式中，增强可以是比非零对照值大至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增长。

术语“宿主细胞”指可以用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌，或者其可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞，猴细胞，仓鼠细胞，大鼠细胞，小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的示例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物，例如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系或缺乏DHFR的CHO品系DX-B11 。

本文所用术语“免疫的突触”或“免疫突触”指表达MHC I(主要组织相容性复合体)或MHC II的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应T细胞或自然杀伤(NK)细胞)之间的界面。

本文所用术语“免疫球蛋白”(缩写“Ig”)是术语“抗体”(缩写“Ab”)的同义词，并且表示包括如下5种人类型的任一种的哺乳动物免疫球蛋白蛋白质：IgA(其包括亚型IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亚型IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4) 和IgM。该术语还包括全部或部分合成的(例如重组或化学合成)或天然产生的小于全长的免疫球蛋白，例如，抗原结合片段(Fab)、含有V

免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)区域或结构域(也称为Fc多肽)大部分对应于免疫球蛋白重链的恒定区域，并且负责各种功能，包括抗体的效应功能。免疫球蛋白Fc融合体(“Fc-融合体”)是含有1或多个被可操作地连接至免疫球蛋白的Fc区域的多肽(或者1或多个小分子)的分子。Fc-融合体可以包括，例如，抗体的Fc区域(其促进药物动力学)和野生型或亲和力修饰的免疫球蛋白超家族结构域(“IgSF”)的IgSF结构域，或其它蛋白质或其片段。在一些实施方式中，Fc 还协助效应功能。在一些实施方式中，Fc是变体Fc，其对于协助效应功能具有减小的(例如，减小大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)活性。IgSF结构域介导关联结合伴侣的识别(与针对抗原的抗体的抗体可变区相当) 。免疫球蛋白Fc区域可以间接或直接连接1或多个多肽或小分子(融合伴侣)。本领域已知多种接头可以用于将Fc连接至融合伴侣以生成Fc-融合体。本发明的 Fc融合蛋白通常含有直接或间接地共价连接至至少一个亲和力修饰的IgSF结构域的免疫球蛋白Fc区域。相同种类的Fc-融合体可以进行二聚化以形成Fc-融合体同源二聚体，或者使用不同种类以形成Fc-融合体异源二聚体。

本文所用术语“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”指涉及细胞识别、结合或粘附过程的细胞表面或可溶性蛋白质的集合。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，分子被归类为该超家族的成员；它们都具有被称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。IgSF的成员包括细胞表面抗原受体、免疫系统的共受体和共刺激分子、涉及将抗原呈递至淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白质。它们一般与免疫系统中的作用相关联。免疫突触中的蛋白质常是IgSF的成员。IgSF可以同样根据共有的属性，例如功能，被分成“亚家族”。这样的亚家族通常由4至30个IgSF成员组成。

本文所用术语“IgSF结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”表示IgSF蛋白的结构性结构域。Ig结构域以免疫球蛋白分子命名。它们包含70至110个氨基酸并且根据其大小和功能进行归类。Ig-结构域具有典型的Ig-折叠，其具有由两片反平行的β链形成的夹心样结构。夹心内侧的疏水性氨基酸与B和F链内半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键之间的相互作用使Ig-折叠稳定。Ig结构域的一末端具有被称为互补性决定区的部分，其对于抗体对其配体的特异性是十分重要的。Ig样结构域可以被分为(分成类)：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大部分Ig结构域要么是可变的(IgV)要么是恒定的(IgC)。具有9条β链的IgV结构域通常长于具有7条β链的IgC结构域。IgSF一些成员的Ig结构域的氨基酸序列类似IgV结构域，然而与IgC结构域的大小相似。它们被称为IgC2结构域，而标准的IgC 结构域被称为IgC1结构域。T细胞受体(TCR)链包含在胞外部分的两个Ig结构域；N-末端的一个IgV结构域和与细胞膜相邻的IgC1结构域。

本文所用术语“IgSF物质”指具有相同或大致相同的一级氨基酸序列的IgSF成员蛋白质的集合。各哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义属于该IgSF成员的所有IgSF物质的独特的相同性。因此，各IgSF家族成员与其它IgSF家族成员是相互独特的，并且相应地，特定IgSF家族成员的各种物质与另一家族成员的各种物质是相互独特的。然而，由于翻译后修饰的不同，如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化，相同的IgSF物质的分子之间可能会出现变异。此外，由于基因多态性，单个IgSF物质内微小的序列差异会在单个IgSF物质内构成另一种形式的变异，如同由于例如蛋白水解切割，IgSF物质的野生型截短形式。“细胞表面IgSF物质”是表达在细胞，主要是哺乳动物细胞表面的IgSF物质。

本文所用术语“免疫活性”在哺乳动物淋巴细胞中指其细胞因子的表达，如趋化因子或白介素。用于确定免疫活性的增强或抑制的试验包括：对干扰素-γ的MLR 试验(Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res).2014九月:2(9):846-56) 、SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激试验(Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res.)2014九月:2(9):846-56)和抗-CD3 T细胞刺激试验(Li和Kurlander, J Transl Med.2010:8:104)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静息的淋巴细胞的增强。本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞试验中相对于野生型IgSF成员或IgSF结构域对照在一些实施方式中可以增强，或者，在其它一些实施方式中可以减弱IFN-γ(干扰素-γ)表达。本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达的增强的原代T细胞试验的形式将不同于用于测试IFN-γ表达的减弱。在测试本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞试验中减弱IFN-γ表达的能力中，可以使用如实施例6中所述混合的淋巴细胞反应 (MLR)试验。合宜地，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域的可溶性形式可以用于确定其在MRL以及实施例6中所述的类似试验中拮抗并因此减弱IFN-γ表达的能力。或者，在测试本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域对原代T 细胞试验中IFN-γ表达的增强的能力中，可以使用共固化试验。在共固化试验中，在一些实施方式中由抗-CD3抗体提供的T细胞受体信号，其与共固化的亲和力修饰的IgSF结构域联用，从而确定相对于野生型IgSF结构域对照增强IFN-γ表达的能力。

“免疫调节蛋白”是一种调整免疫活性的蛋白质。“调节”或“调整”免疫应答是指免疫活性被增强或抑制。免疫调节蛋白可以是单多肽链或通过例如链间二硫键相互共价结合的至少2条多肽链的多聚体(二聚体或更高级的多聚体)。因此，单体、二聚体、和更高级的多聚体蛋白质是在该术语的定义范围内的。多聚体蛋白质可以是同多聚体的(以相同的多肽链)或异多聚体的(以不同的多肽链)。

本文所用术语“增强”指统计上显著量的增长。增强可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大的增长。

本文所用术语“淋巴细胞”指哺乳动物免疫系统中白血细胞的三种亚型中的任一种。它们包括自然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的、细胞毒性固有免疫中作用)、T细胞(用于细胞介导的、细胞毒性获得性免疫)、和B细胞(用于体液的、抗体驱动的获得性免疫)。T细胞包括：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节T细胞或γδT细胞。先天淋巴细胞(ILC) 也包括在淋巴细胞的定义内。

术语“哺乳动物”、“对象”或“患者”具体地包括人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、狗、猫、小鼠或大鼠中的至少一个。

本文所用术语“调节”或“调整”就免疫应答而言，如哺乳动物免疫应答，是表示作为给予本发明的免疫调节蛋白结果所发生的既有的或潜在的免疫应答的任何改变，如增强或减弱。因此，其表示相较于发生在或存在于没有给予免疫调节蛋白的免疫应答，免疫应答的改变，如增强或减弱。这样的调整包括任何诱导，或程度或范围的改变，或免疫细胞免疫活性的抑制。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK(自然杀伤)细胞、NK T细胞、专业抗原呈递细胞(APC)、和非专业抗原呈递细胞、和炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、和嗜碱性粒细胞)。调整包括对既有的免疫应答，发展中的免疫应答，潜在的免疫应答，或诱导、调节、影响或响应免疫应答的能力产生影响的任何改变。调整包括作为免疫应答一部分的免疫细胞中的基因、蛋白质和/或其它分子的表达和/或功能中的任何改变。免疫应答的调整或免疫活性的调整包括，例如，如下：免疫细胞的消除、缺失或隔离；诱导或生成可以调整其他细胞(如自身反应的淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞)的功能能力的免疫细胞；诱导免疫细胞中无反应状态(即无反应性)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。示例包括改变的产生和/或分泌特定类别的分子，如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体或这些调整性事件的任意组合。可以对调整进行评估，例如，通过在原代T细胞试验中，IFN-γ(干扰素γ)表达相对于或相较于野生型或未修饰的IgSF结构域对照的变化(参见，Zhao 和Ji,Exp Cell Res.2016一月1；340(1)132-138)。

本文所用术语”分子物质“指具有相同或大致相同的一级氨基酸序列的蛋白质的集合。各哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义一系列相同的或大致相同的分子物质。因此，例如，人CD80是IgSF成员，因此各人CD80分子是CD80 物质。由于翻译后修饰的不同，如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化，相同的分子物质的分子之间可能会出现变化。此外，由于基因多态性，单个分子物质内微小的序列差异会在单个分子物质内构成另一种形式的变异，如同由于例如蛋白水解切割，单一分子物质的野生型截短形式。“细胞表面分子”是表达在哺乳动物细胞表面的分子物质。两种或多种不同种类的蛋白质，每一种都仅在形成IS的两个哺乳动物细胞的一个或仅在另外一个(但不是两个)上呈递，这被称作是相互处于“顺式”或“顺式构型”。两种不同种类的蛋白质，其第一种仅在形成IS的两个哺乳动物细胞中的一个上呈递，并且其第二种仅在形成IS的两个哺乳动物细胞中第二个上呈递，这被称作处于“反式”或“反式构型”。两种不同种类的蛋白质，各自在形成IS的两个哺乳动物细胞上都呈递，这样的蛋白质既是这些细胞上的顺式构型也是反式构型。

本文所用术语“非竞争性结合”指蛋白质特异性地同时结合至少两个关联结合伴侣的能力。在一些实施方式中，该结合是在特定结合条件下发生的。因此，蛋白质能够在同一时间结合至少两个不同的关联结合伴侣，尽管结合相互作用不需要持续相同的时间，以至于在某些情况下，蛋白质仅与同源结合配偶体中的一个特异性地结合。在一些实施方式中，同时结合使得一个关联结合伴侣的结合基本上不抑制第二个关联结合伴侣的同时结合。在一些实施方式中，非竞争性结合指第二关联结合伴侣与其在蛋白质上的结合位点的结合并不取代第一关联结合伴侣与其在蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法为本领域所熟知，例如在Perez de La Lastra等,免疫学(Immunology),1999四月:96(4):663–670中所描述的方法。在一些情况中，在非竞争性相互作用中，第一关联结合伴侣特异性地结合在与第二关联结合伴侣的相互作用位点不重叠的相互作用位点，以这样的方式，第二关联结合伴侣的结合并不直接干扰第一关联结合伴侣的结合。因此，通过第二关联结合伴侣的结合对关联结合伴侣的任何作用是通过直接干扰第一关联结合伴侣的结合以外的机制进行的。例如，就酶-底物相互作用而言，非竞争性抑制剂结合酶的活性位点以外的位点。非竞争性结合包括非竞争性结合相互作用，其中第二关联结合伴侣特异性地结合相互作用位点，该相互作用位点与第一关联结合伴侣的结合不重叠，但是只有当第一相互作用位点被第一关联结合伴侣占据之时结合第二相互作用位点。

本文所用术语“核酸”和“多核苷酸”是互换使用的，其指以单链或双链形式的核酸残基的聚合物(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)。除非明确限定，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物以及具有与其相似的结合属性并且以与天然存在核苷酸相似的方式代谢的核酸。除非另有说明，具体核酸序列也隐含其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补核苷酸序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代。术语核酸与多核苷酸包括有基因编码的 cDNA或mRNA。

术语“药物组合物”表示适合在哺乳动物对象(通常是人)中作为药物使用的组合物。药物组合物常常包括有效量的活性试剂(例如，本发明的免疫调节蛋白) 以及载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂分别是典型的药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并表示通过肽键连接的两个或多个氨基酸的分子链。该术语并不表示特定长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括可以使用已知蛋白质工程技术合成，或重组表达的含有一个或多个氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸的分子。此外，蛋白质可以通过已知的有机化学技术如本文所述衍生蛋白质。

本文所用术语“原代T细胞试验”表示测量干扰素-γ(“IFN-γ”)表达的体外试验。本领域已知多种这样的原代T细胞试验，如实施例6中所述。在优选的实施方式中，使用的试验是抗-CD3共固化试验。在该试验中，原代T细胞被用额外的重组蛋白质固化或未固化的抗-CD3刺激。培养物上清液在时间点收获，通常是24 至72小时。在另一个实施方式中，使用的试验是混合的淋巴细胞反应(MLR)。在该试验中，原代T细胞由同种异体的APC模拟。培养物上清液在时间点收获，通常是24至72小时。通过标准ELISA技术在培养物上清液中测量人IFN-γ水平。商用试剂盒来自供应商，并且根据生产商的推荐进行试验。

术语“纯化的”当适用于本发明的核酸或免疫调节蛋白时，通常表示通过本领域已知的分析技术确定的基本上不含任何其它组分的核酸或多肽(例如，在电泳凝胶、层析洗脱液、和/或经密度梯度离心的培养基中形成离散带的纯化的多肽或多核苷酸)。例如，在电泳凝胶中基本上产生一条条带的核酸和多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或免疫调节蛋白是至少50％纯度的，常常是至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更高的纯度(例如，以重量或摩尔量的百分比) 。

术语“重组”表明经人工干预被人工(即，非自然地)改变的物料(例如，核酸或多肽)。这一改变可以在处于其天然环境或状态内或从其天然环境或状态内分离的物料上进行。例如，“重组核酸”是通过在例如克隆、亲和力修饰、DNA改组或其它已知的分子生物学过程中将核酸重组制造的。“重组DNA分子”由通过分子生物学技术的方式连接在一起的DNA的区段组成。本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”表示使用重组DNA分子表达的蛋白质分子(例如，免疫调节蛋白)。“重组宿主细胞”是包含和/或表达重组核酸的细胞。真核生物内的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述DNA 序列与参与转录的细胞蛋白质特异性地相互作用。已经从多种真核生物来源，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因中分离了启动子和增强子元件(类似的控制元件，即启动子，也在原核生物中发现)。对于特定启动子和增强子的选择取决于使用何种细胞类型来表达感兴趣的蛋白质。本文所用术语“可操作组合”、“可操作的顺序”和“可操作地连接”表示核酸序列的连接，以此方式或方向核酸分子能够指导给定基因的转录和/或生成所需蛋白质分子的合成。该术语还表示氨基酸序列的连接，以此方式功能性蛋白生成和/或转运。

本文所述术语“重组表达载体”表示含有所需编码序列(例如，免疫调节的核酸)以及适当的核酸序列的DNA分子，所述适当的核酸序列是在特定宿主细胞内表达可操作地连接的编码序列所必须的。在原核生物内表达所必须的核酸序列包括启动子，任选地操纵子序列、核糖体结合位点和其它可能的序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、以及终止和聚腺苷酸化信号。分泌信号肽序列也可以，任选地，由重组表达载体编码，与本发明的重组融合蛋白的编码序列可操作地连接，从而使得表达的融合蛋白可以由重组宿主细胞分泌，以使得分离来自细胞的融合蛋白更加容易，如果需要。

本文所用术语“序列同一性”表示在核苷酸或氨基酸水平基因或蛋白质之间的序列同一性。“序列同一性”是在氨基酸水平蛋白质之间相同性的测量值和在核苷酸水平核酸之间相同性的测量值。蛋白质序列同一性可以在比对序列时通过对位于各条序列中给定位置的氨基酸序列进行比较确定。相似地，核酸序列同一性可以在比对序列时通过对位于各条序列中给定位置的核苷酸序列进行比较确定。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知，这样的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和TFASTA。BLAST算法计算序列同一性百分比，并对两个序列之间的相似性进行统计分析。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyIn形成)(NCBI)网站从公共渠道获得。

本文所用术语“可溶的”对于蛋白质指所述蛋白质不是膜蛋白。总的来说，可溶的蛋白质只包含IgSF家族成员受体的细胞外结构域，或其含有一个或多个IgSF 结构域或其特异性结合片段的部分。

本文所用术语“种类”在核酸序列或多肽序列上下文中表示这种序列的相同集合。在氨基末端或羧基末端与全长种类具有不超过1、2或3个氨基酸残基不同的稍微截短的序列(或编码差异)被认为是单一种类。这种微观异质性是人造蛋白质的共同特征。

本文所用术语“特异性结合”指在特定的结合条件下，蛋白质结合靶标蛋白的能力，因此其亲和力或亲合力比相同蛋白质对足够统计规模的随机肽或多肽的集合的亲和力或亲合力的平均值的大至少10倍，但是任选地是50、100、250或500 倍，或者甚至是至少1000倍。特异性结合蛋白质不需要仅与单个靶标分子(例如其关联结合伴侣)结合，由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间结构构象的相似性，其可以特异性地结合非靶标分子。本领域技术人员将认识到，与不同种类的动物中具有相同功能的分子(即，直向同源)或与具有与靶标分子基本相似的表位的非靶标分子(例如，横向同源)的特异性结合是可能的并且不会损害相对于统计学有效的独特非靶标(例如，随机的多肽)集合确定的结合特异性。因此，本发明的亲和力修饰的多肽由于交叉反应性，可以特异性地结合超过一种靶标分子的特殊种。通常，这样的脱靶(off-target)特异性结合通过降低对不需要靶标的亲和力和亲合力来减轻。可以使用固相ELISA免疫试验或Biacore测量对两种蛋白质之间的特异性结合进行确定。通常，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数(Kd)小于1x10

本文所用术语“特异性结合片段”或“片段”就成熟的(即，不存在信号肽)野生型IgSF结构域指这样的多肽，其短于全长成熟的IgSF结构域并且在体外和/或体内特异性地结合成熟的野生型IgSF结构域的天然关联结合伴侣。在一些实施方式中，特异性结合片段的序列是全长成熟的野生型序至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列长度。可以改变特异性结合片段的序列以形成本发明的亲和力修饰的IgSF 结构域。在一些实施方式中，特异性结合片段调整淋巴细胞的免疫活性。

本文所用术语“抑制”或“减弱”指统计上显著量的减少。在一些实施方式中，抑制可以是至少10％，并且上至20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的减弱。

本文所用术语“靶向部分”表示这样的组合物，其共价或非共价附着于或物理包封包含本发明的野生型和/或亲和力修饰的IgSF结构域的多肽。靶向部分对需要的关联结合伴侣具有特异性结合亲和力，例如对细胞表面受体或如肿瘤特异性抗原 (TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤抗原。典型地，所需的关联结合伴侣位于特定组织或细胞类型。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(Fab)、含有V

本文所用对于疾病或紊乱的术语“治疗”、“处理”或“疗法”指通过单独给予本发明的免疫调节蛋白或与本文所述的另一种化合物联合给予，通过临床或诊断症状减少、停止或消除证明，减缓、停止或逆转疾病或紊乱的发展。“治疗”、“处理”或“疗法”还指急性或慢性疾病或紊乱中的症状严重程度的降低或复发率的降低，例如在自身免疫疾病病程的复发或复原的情况下或在自身免疫疾病的炎症方面的情况下炎症的减少。在用于本文癌症上下文的情况下，术语癌症的“治疗”或“抑制”、“阻碍”或“遏制”表示通过标准方法，例如但不限于实体肿瘤的反应评估标准(RECIST) 测量的肿瘤生长速率在统计学上显著降低，肿瘤生长的中止，肿瘤大小、质量、代谢活性或体积的减少中的至少一种，或无进展生存期(PFS)或总生存期(OS)在统计学上显著增长。在本发明上下文中使用的对于疾病或紊乱的“预防”、“预防疗法”或“防止”表示将本发明的免疫调节蛋白以单独或与其它化合物组合的方式给予，以预防疾病或紊乱或疾病或紊乱的一些或所有症状的发生或开始，或减少疾病或紊乱发生的可能性。

本文所用术语“肿瘤特异性抗原”或“TSA”表示主要在哺乳动物对象的肿瘤细胞上存在，但其通常并不出现在哺乳动物对象的普通细胞的抗原。肿瘤特异性抗原并不是肿瘤细胞所特有的，但是当哺乳动物的特定细胞所具有的肿瘤特异性抗原的百分比足够高或肿瘤表面的肿瘤特异性抗原水平足够高，其可以被抗肿瘤治疗剂，例如本发明的免疫调节多肽靶向，并且为哺乳动物免受肿瘤的影响提供预防或治疗。在一些实施方式中，在对患有肿瘤的哺乳动物的细胞样品进行随机统计中，至少 50％表现出TSA的细胞是癌性的。在其他一些实施方式中，至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％表现出TSA的细胞是癌性的。

本文所用“筛选”表示根据分子或其部分的活性或属性从分子和/或其部分的集合或文库中鉴定或选择分子或其部分。筛选可以以各种方式进行，包括例如通过评估分子与其靶标蛋白的直接结合(例如，结合亲和力)的试验或通过评估靶标蛋白活性的调整的功能性试验。

本文所用术语“野生型”或“自然的”或“天然的”或“亲本的”与如氨基酸分子、蛋白质、IgSF成员、宿主细胞等生物物质联用表示这些生物物质是在自然中发现的并且未通过人为介入修饰。野生型IgSF结构域是非亲和力修饰的IgSF结构域的类型。在本发明的免疫调节蛋白的一些实施方式中，非亲和力修饰的IgSF是野生型 IgSF结构域。

II.亲和力修饰的免疫调节蛋白

本发明提供了具有治疗性用途的免疫调节蛋白，其调整患有疾病或紊乱的哺乳动物中的免疫活性，对免疫系统应答的调整有益于该疾病或紊乱。

包括在本发明的免疫调节蛋白的范围内的IgSF家族成员排除了抗体(即，免疫球蛋白)，例如那些是哺乳动物或可能是哺乳动物源的。因此，本发明涉及非免疫球蛋白(即，非抗体)IgSF结构域。不是免疫球蛋白(即，抗体)的野生型哺乳动物IgSF家族成员的核酸和氨基酸序列为本领域所熟知。所有非免疫球蛋白哺乳动物IgSF家族成员包括在本发明的范围内。

在一些实施方式中，非免疫球蛋IgSF家族成员，和本文所述对应的IgSF结构域是小鼠、大鼠、食蟹猴或人源的。在一些实施方式中，IgSF家族成员是来自下述至少或正好1、2、3、4、5或多种IgSF亚家族的成员：信号调节蛋白(SIRP) 家族、表达在骨髓细胞样上的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白(Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG)家族、V-集跨膜结构域(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC) 家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体 (LIR)、连接蛋白(Nec)家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)、或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。

在一些实施方式中，本发明的免疫调节蛋白的非免疫球蛋白IgSF家族成员和本文所述对应的IgSF结构域相较于哺乳动物IgSF成员是亲和力修饰的。在一些实施方式中，哺乳动物IgSF成员是IgSF成员之一，或含有表1所示的IgSF成员之一的IgSF结构域，所述表1包括其任何哺乳动物的直系同源物。直系同源物是不同物种中通过物种形成由共同的祖先基因进化而来的基因。通常地，直系同源物在进化的过程中保留了相同的功能。

表1的第一列提供了特定IgSF成员的名称和，任选地，名称的一些可能的同义词。第2列提供了UniProtKB数据库的蛋白质标识物，其是通过互联网在 uniprot.org上可及的公共数据库。通用蛋白质资源(UniProt)是蛋白质序列和注释数据的综合资源。UniProt数据库包括UniProt知识数据库(UniProtKB)。UniProt 是欧洲生物信息研究所(EMBL-EBI)、生物信息和蛋白质信息资源SIB瑞士研究所(PIR)之间的合作，并且主要受美国国家卫生研究院(NIH)资助。第3列提供了指示的IgSF所处于的区域。区域被指定为一范围，结构域包括定义范围的残留物。列3还表示特定IgSF区域的IgSF结构域种类。列4提供了指定的其它结构域所处于的区域(信号肽，S；细胞外结构域，E；跨膜结构域，T；细胞质结构域， C)。列5表示一些列出的IgSF成员的一些关联细胞表面结合伴侣。

典型地，提供的实施方式的亲和力修饰的IgSF结构域是人或鼠亲和力修饰的IgSF结构域。

在一些实施方式中，本发明的免疫调节蛋白包含至少一个亲和力修饰的哺乳动物IgSF结构域。亲和力修饰的IgSF结构域可以经亲和力修饰以特异性结合单个或多个(2、3、4、或更多)关联结合伴侣(也称为“相对结构配体”)。IgSF结构域可以经亲和力修饰，从而独立地增强或减弱对其结合的多个关联结合伴侣的特异性结合亲和力或亲合力。通过该机理，独立地调谐对多个关联结合伴侣各自的特异性结合至特定的亲和力或亲合力。

在一些实施方式中，IgSF结构域的关联结合伴侣是野生型IgSF结构域的关联结合伴侣，如表1中所列中的至少一个，并且有些时候是至少两个或三个。如哺乳动物IgSF结构域的IgSF结构域的序列是经亲和力修饰的，通过用至少一个取代、添加、或缺失改变其序列。序列的改变可以发生在关联结合伴侣的结合位置或在变构部位。在一些实施方式中，编码IgSF结构域(如哺乳动物IgSF结构域)的核酸通过对特定的和预先确定的核苷酸位点的取代、添加、缺失或其组合进行亲和力修饰，获得本发明的核酸。在一些对比实施方式中，编码IgSF结构域(如哺乳动物 IgSF结构域)的核酸通过在核酸内的随机位点取代、添加、缺失或其组合进行亲和力修饰。在一些实施方式中，利用两种方法(预先确定的和随结的)的组合。在一些实施方式中，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域的设计在计算机中进行。

在一些实施方式中，相对于含有免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，如IgV 结构域或IgC结构域或IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段的野生型或未修饰的多肽或其部分，亲和力修饰的IgSF结构域含有1个或多个氨基酸取代(或者，“突变”或“替换”)。在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有亲和力修饰的IgSF 结构域，其含有IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段，其中氨基酸取代中的至少一种在IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段内。在一些实施方式中，通过改变的结合活性或亲和力，IgV结构域或IgC结构域是亲和力修饰的IgSF 结构域。

在一些所述方法中，IgSF结构域(如哺乳动物IgSF结构域)经序列中至少1 个但不超过总共2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、添加、缺失或其组合的亲和力修饰。在一些所述方法中，IgSF结构域(如哺乳动物IgSF结构域) 经序列中至少1个但不超过10、9、8、7、6、5、4、3、或2个氨基酸取代、添加、缺失或其组合经亲和力修饰。在一些实施方式中，取代是保守取代。在一些实施方式中，所述取代是非保守取代。在一些实施方式中，取代是保守取代和非保守取代的组合。在一些实施方式中，序列中的修饰是在IgSF结构域对其关联结合伴侣的结合位点处。

在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域是哺乳动物IgSF结构域。在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域可以是包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠的IgSF结构域。在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域是人的。

在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域是IgSF结构域或其包含在SEQID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列的特异性结合片段或其缺少信号序列的成熟型，与SEQ ID NO:1-27或其成熟型至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，或含有IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段的部分。

在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域是或包含IgSF家族成员或其含有IgSF结构域的部分(例如，IgV结构域或IgC结构域)的细胞外结构域。在一些实施方式中，未修饰的或野生型IgSF结构域包含SEQ ID NO:28-54中任一项所示的氨基酸序列，或其直系统源物。例如，未修饰的或野生型IgSF结构域可以包含(i)SEQ ID NO:28-54中任一项所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:28-54中任一项所示至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列，或(iii) SEQ ID NO:28-54中任一项所示的氨基酸序列的特异性结合片段，或具有与含有 IgV结构域或IgC结构域的SEQ ID NO:28-54中任一项至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列的特异性结合片段。

在一些实施方式中，未修饰的或野生型IgSF结构域的细胞外结构域可以包含超过1个IgSF结构域，例如，IgV结构域和IgC结构域。然而，亲和力修饰的IgSF 结构域不需要包括IgV结构域和IgC结构域两者。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有或主要由IgV结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域包含或主要由IgC结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有IgV结构域或其特异性结合片段，以及IgC结构域或其特异性结合片段。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域的1个或多个氨基酸取代可以位于IgSF多肽结构域的任意1个或多个。例如，在一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代位于IgSF多肽的细胞外结构域。在一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代位于IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代位于IgC结构域或IgC结构域的特异性结合片段。

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白的至少1个IgSF结构域(如哺乳动物IgSF结构域)的序列独立地经亲和力修饰，使其与野生型或未修饰的IgSF 结构域或其特异性结合片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％或80％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在野生型或未修饰的IgSF结构域，例如但不限于在表1中以SEQ ID NO:1-27公开的那些。

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白的IgSF结构域是的野生型或未修饰的IgSF结构域的特异性结合片段，所述野生型或未修饰的IgSF结构域包含在野生型或未修饰的IgSF蛋白，例如但不限于表1中在SEQ ID NO:1-27中公开的那些。在一些实施方式中，特异性结合片段可以具有至少50个氨基酸的氨基酸长度，如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸。在一些实施方式中，IgV结构域的特异性结合片段包含氨基酸序列，其是野生型或未修饰的IgV结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方式中，IgC结构域的特异性结合片段包含氨基酸序列，其是野生型或未修饰的IgC结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方式中，特异性结合片段调整免疫活性。在更具体的实施方式中，IgSF结构域的特异性结合片段使免疫活性增强。在另外一些实施方式中，特异性结合片段使免疫活性减弱。

为了测定两个核酸序列或两个氨基酸序列的相同性百分数，以最优比较目的进行序列比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸的序列中映入间隙，用于与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方式中，这两个序列的长度相同。任何一人可以手动比对序列并且计算相同核酸或氨基酸的数量。或者，两个序列的比对可以使用数学算法实现同一性百分数的确定。这样的算法整合在NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，评分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得缺口算法以供比较目的，可以利用缺口BLAST。或者，可以使用PSI-Blast以进行迭代搜索，其检测分子之间的远近关系。当利用NBLAST、BLAST和缺口BLAST 程序时，可使用各程序在如NCBI网站上可得的默认参数。或者，序列的同一性可以在序列已经进行比对后进行计算，例如，通过NCBI数据库中的BLAST程序。通常，对于例如“评分矩阵”和“缺口罚分”的默认设置可以用于比对。在本发明的内容中，可以使用BLASTN和PSI BLAST NCBI的默认设置。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白包含至少一个亲和力修饰的IgSF结构域。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白还包含至少一个亲和力修饰的结构域并且还包含至少一个非亲和力修饰的IgSF结构域(例如，未修饰的或野生型IgSF结构域)。在一些实施方式中，免疫调节蛋白包含至少两个亲和力修饰的结构域。在一些实施方式中，免疫调节蛋白可以包含多个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF结构域，如1、2、3、4、5或6个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF结构域。

在一些实施方式中，存在于本文提供的免疫调节蛋白的至少一个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或一个亲和力修饰的IgSF特异性地结合至少一个表达在形成免疫突触(IS)的哺乳动物细胞的细胞表面分子。当然，在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白包含多个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF 结构域，如1、2、3、4、5或6个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的 IgSF结构域。这些非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF结构域中的一个或多个可以独立地特异性结合形成IS的哺乳动物细胞的之一或两者。

通常，亲和力修饰的IgSF结构域特异性结合的细胞表面分子将会是野生型 IgSF家族成员或亲和力已经被修饰的野生型IgSF结构域的关联结合伴侣。在一些实施方式中，细胞表面分子是哺乳动物IgSF成员。在一些实施方式中，细胞表面分子是人IgSF成员。在一些实施方式中，细胞表面分子将会是表1中所指示的细胞表面关联结合伴侣。在一些实施方式中，细胞表面分子将会是在如人细胞的哺乳动物细胞的细胞表面的病毒蛋白，如脊髓灰质炎病毒蛋白。

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白的至少一个非亲和力修饰的和/ 或亲和力修饰的IgSF结合存在于形成IS的哺乳动物细胞的至少两个或三个细胞表面分子。本发明的非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF结构域特异性结合的细胞表面分子可以只是形成IS的两个哺乳动物细胞中的一个或另一个 (即，以顺式构型)，或者该细胞表面分子可以是存在于两者。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域特异性地结合至少两个细胞表面分子，其中一个分子物质的存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个，另一个分子物质存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的第二个。在这些实施方式中，细胞表面分子并不需要只存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个或另一个(即，以反式构型)，尽管在一些实施方式中是这样的。因此，本文提供的实施方式包括那些其中各细胞表面分子只在形成IS的哺乳动物细胞中一个或另一个的(顺式构型)，以及存在于形成IS的哺乳动物细胞两者的那些与各亲和力修饰的IgSF结合的细胞表面分子(即，顺式和反式构型)。

本领域技术人员将意识到抗原呈递细胞(APC)和肿瘤细胞与淋巴细胞形成免疫突触。因此，在一些实施方式中，免疫调节蛋白的至少一个非亲和力修饰的 IgSF结构域和/或至少一个亲和力修饰的IgSF结构域仅特异性地结合存在于癌症细胞的细胞表面分子，其中癌症细胞与淋巴细胞联合形成IS。在其它实施方式中，免疫调节蛋白的至少一个非亲和力修饰的IgSF结构域和/或至少一个亲和力修饰的 IgSF结构域仅特异性地结合存在于淋巴细胞的细胞表面分子，其中淋巴细胞与 APC或肿瘤细胞联合形成IS。在一些实施方式中，非亲和力修饰的IgSF结构域和 /或亲和力修饰的IgSF结构域结合细胞表面分子，其存在于形成IS的靶细胞(或 APC)和淋巴细胞。

本发明的实施方式包括其中本文提供的免疫调节蛋白含有至少一个具有不同于野生型或未修饰的IgSF结构域的氨基酸序列的亲和力修饰的IgSF结构域(例如，哺乳动物IgSF结构域)的那些，因此，在特定结合条件下，其对其关联结合伴侣中的至少一个的结合亲和力(或亲合力，如果在多亚基或其它相关结构中)相对于未改变的野生型或未修饰的IgSF结构域对照是要么增强的或要么减弱的。在一些实施方式中，经例如固相ELISA免疫试验、流式细胞术或Biacore试验确定，亲和力修饰的IgSF结构域所具有的对关联结合伴侣的结合亲和力不同于野生型或未修饰的IgSF对照序列所具有的。在一些实施方式中，IgSF结构域对于一个或多个关联结合伴侣具有增强的结合亲和力。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域相对于野生型或未修饰的IgSF结构域对于一个或多个关联结合伴侣具有减弱的结合亲和力。在一些实施方式中，关联结合伴侣可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。

对各关联结合伴侣的结合亲和力是独立的，也就是在一些实施方式中，相较于野生型或未修饰的ICOSL多肽，亲和力修饰的IgSF结构域对于1、2或3个不同的关联结合伴侣具有增强的结合亲和力，然而对于1、2或3个不同的关联结合伴侣具有减弱的结合亲和力。

在本文提供的免疫调节蛋白的一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域的结合亲和力或亲合力相对于野生型或未修饰的对照IgSF结构域增长至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、5000％或10,000％。在一些实施方式中，结合亲和力的增长相对于野生型或未修饰的IgSF结构域是其1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。

在一些实施方式中，相对于野生型或未修饰的对照IgSF结构域，结合亲和力或亲合力减少至少10％，并且减少上至20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或减少上至90％。在一些实施方式中，亲和力的减少相对于野生型或未修饰的IgSF 结构域是其1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10 倍、20倍、30倍、40倍或50倍。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域对关联结合伴侣的特异性结合亲和力可以是至少1x10

在一些实施方式中，提供的免疫调节蛋白包含至少两个IgSF结构域，其中至少一个IgSF结构域是亲和力修饰的，而在一些实施方式中，两者都是亲和力修饰的，并且其中至少一个亲和力修饰的IgSF结构域对其关联结合伴侣具有增强的亲和力(或亲合力)并且至少一个亲和力修饰的IgSF结构域对其关联结合伴侣具有减弱的亲和力(或亲合力)。

在一些实施方式中，对原本结合多种细胞表面分子的IgSF结构域进行亲和力修饰，因此，其基本上不再特异性地结合其关联细胞表面分子中的一种。因此，在这些实施方式中，与其关联细胞表面分子中的一种的特异性结合被减弱至不超过野生型水平10％的特异性结合，并且常常不超过7％、5％、3％、1％或检测不到或无统计学上的显著特异性结合。

在这些实施方式中，在哺乳动物IgSF结构域上的特异性结合位点对于细胞表面分子的至少一种是失活的或基本上失活的。因此，例如，如果野生型IgSF结构域特异性地结合正好两个细胞表面分子，然后在一些实施方式中，其被亲和力修饰成特异性结合正好一个细胞表面分子(因此对亲和力修饰的IgSF结构域数量的确定忽略任何实质上免疫失活的部分序列)。并且，如果野生型IgSF结构域特异性地结合正好三个细胞表面分子，然后在一些实施方式中，其被亲和力修饰成特异性结合正好两个细胞表面分子。被亲和力修饰成基本上不再特异性结合其关联细胞表面分子中的一个的IgSF结构域可以是原本特异性地竞争性或非竞争性结合其细胞表面分子的IgSF结构域。本领域技术人员应理解，竞争性结合两个关联结合伴侣的野生型IgSF结构域仍然可以相对于它们中正好一个失活，如果，例如它们的结合位置不是精确地共延伸的，而是仅仅重叠，这样一个的特异性结合抑制另一个关联结合伴侣的结合，并且两者的竞争性结合位点是不同的。

提供的免疫调节蛋白的非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF 结构域，可以在一些实施方式中特异性地竞争性结合其关联细胞表面分子。在其他实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白的非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合其关联细胞表面分子。本文提供的免疫调节蛋白中存在的任何数量的非亲和力修饰的IgSF结构域和/或亲和力修饰的IgSF 结构域可以特异性地竞争性或非竞争性结合。

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白包含至少两个非亲和力修饰的IgSF结构域，或至少一个非亲和力修饰的IgSF结构域和至少一个亲和力修饰的 IgSF结构域，或至少两个亲和力修饰的IgSF结构域，其中一个IgSF结构域特异性地竞争性结合并且第二个IgSF结构域非竞争性结合其关联细胞表面分子。更普遍地，本文提供的免疫调节蛋白可包含1、2、3、4、5或6个竞争性或1、2、3、 4、5或6个非竞争性结合非亲和力修饰的IgSF和/或亲和力修饰的IgSF结构域或其任意组合。因此，本文提供的免疫调节蛋白可以分别具有如下数量的非竞争性和竞争性IgSF结构域：0和1、0和2、0和3、0和4、1和0、1和1、1和2、1和3、2和0、2和1、2和2、2和3、3和0、3和1、3和2、3和3、4和0、4和1，以及，4和2。

本文提供的免疫调节蛋白的多个非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域不需要直接共价地连接到另一个。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸残基的间隔跨度间接地将非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域之间共价连接。连接可以通过N-末端到C-末端残基。

在一些实施方式中，连接可以通过不位于非亲和力修饰的或亲和力修饰的 IgSF结构域的N-末端或C-末端的氨基酸残基的侧链实现。因此，连接可以通过末端或内部氨基酸残基或其组合实现。

连接非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的“肽接头”可以是单氨基酸残基或在长度上更长。在一些实施方式中，肽接头具有至少1个氨基酸残基，但是不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3 、2、或1个氨基酸长度。在一些实施方式中，该接头是(单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头重复。在另外一些任选的实施方式中，一系列的丙氨酸残基插入4GS接头和免疫调节蛋白共价连接的Fc之间。在一些实施方式中，各系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5 或6个丙氨酸。

A.示例性亲和力修饰的IgSF结构域

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有在野生型或未修饰的IgSF 蛋白的IgSF结构域(如上表1中所示)中的一个或多个氨基酸取代。1个或多个氨基酸取代可以在野生型或未修饰的IgSF结构域的胞外域中，如细胞外结构域。在一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代在IgV结构域或其特异性结合片段。在一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代在IgC结构域或其特异性结合片段。在亲和力修饰的IgSF结构域的一些实施方式中，1个或多个氨基酸取代中的一些是在 IgV结构域或其特异性结合片段中，并且1个或多个氨基酸取代中的一些是在IgC 结构域或其特异性结合片段中。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有上至1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。取代可以在IgV结构域或IgC结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19或20个在IgV结构域或其特异性结合片段的氨基酸取代。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20个在IgC结构域或其特异性结合片段的氨基酸取代。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有与野生型或未修饰的IgSF 结构域或其特异性结合片段至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，例如包含在SEQ ID NO:1-27中任一项所示的IgSF蛋白中的IgSF结构域。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有在B7 IgSF家族成员的野生型或未修饰的IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，B7 IgSF家族成员是CD80、CD86或ICOS配体(ICOSL)。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有与野生型或未修饰的IgSF结构域或其特异性结合片段至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，例如包含在SEQ IDNO:1、2或5中任一项所示的IgSF蛋白中的IgSF结构域。CD80的示例性亲和力修饰的IgSF结构域如表2 中所示。ICOSL的示例性亲和力修饰的IgSF结构域如表3中所示。CD86的示例性亲和力修饰的IgSF结构域如表4中所示。

在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有在NkP30家族成员的野生型或未修饰的IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域具有与野生型或未修饰的IgSF结构域或其特异性结合片段，例如包含在SEQ ID NOS:27中所示的IgSF蛋白的IgSF结构域至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。表5提供了示例性亲和力修饰的NkP30 IgSF结构域。

B.亲和力修饰的免疫调节蛋白的类型

1.双结合亲和力修饰的结构域

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白可以包含野生型哺乳动物非免疫球蛋白(即，非抗体)IgSF家族成员的至少一个IgSF结构域的序列，其中在那里的至少一个IgSF结构域是亲和力修饰的(“I型”免疫调节蛋白)。在一些实施方式中，至少一个修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白包含至少一个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其特异性地非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域相对于野生型或未修饰的IgSF结构域显示出对至少一个关联结合伴侣增强的结合。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域显示出对至少两个不同的关联接合伴侣增强的结合。

在本发明的I型免疫调节蛋白的一些实施方式中，未修饰或野生型IgSF成员 (如哺乳动物IgSF成员)是IgSF成员之一，或含有表1所示的IgSF成员之一的 IgSF结构域，所述表1包括其任何哺乳动物的直系同源物。

在一些实施方式中，存在于I型免疫调节蛋白内的其它IgSF结构域可以是非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的，如至少2、3、4或5个IgSF结构域，并且，在一些实施方式中，正好是2、3、4或5个IgSF结构域。

在一些实施方式中，本文的I型免疫调节蛋白含有至少一个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，所述免疫球蛋白超家族结构域含有在野生型或未修饰的IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代，其中所述亲和力修饰的 IgSF结构域具有1)相较于野生型或未修饰的IgSF结构域，对至少两个关联结合伴侣改变的(例如，增强的或减弱的)结合；和2)至少一个亲和力修饰的IgSF 结构域特异性地非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。在一些实施方式中，I型免疫调节蛋白的亲和力修饰的IgSF结构域具有对至少两个关联结合伴侣增强的结合。在一些实施方式中，I型免疫调节蛋白的亲和力修饰的IgSF结构域具有对至少两个关联结合伴侣减弱的结合。在一些实施方式中，I型免疫调节蛋白的亲和力修饰的IgSF结构域具有对至少一个关联结合伴侣增强的结合和对至少另一个不同关联结合伴侣减弱的结合。

在一些实施方式中，两个关联结合伴侣表达在至少两个不同的细胞，如两个不同的哺乳动物细胞的表面上。例如，在一些实施方式中，一个关联结合伴侣表达在淋巴细胞，而另一个关联结合伴侣表达在抗原呈递细胞。在一些实施方式中，两个关联结合伴侣表达在相同的细胞类型，如相同的免疫细胞。在一些实施方式中， I型免疫调节蛋白能够调整一种或多种免疫细胞的免疫活性，如例如T细胞的淋巴细胞的免疫活性。在一些实施方式中，免疫活性被增强。在一些实施方式中，免疫活性被减弱。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有或主要由仅一个亲和力修饰的IgSF结构域组成，其非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域是亲和力修饰的IgV结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域是亲和力修饰的IgC结构域。

在一些实施方式中，本文提供的I型免疫调节蛋白含有亲和力修饰的CD80 IgSF结构域，其特异性地非竞争性结合CD28和PDL1。在一些实施方式中，亲和力修饰的CD80 IgSF结构域是IgV结构域。在其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有其他的非亲和力修饰的IgSF结构域。

2.堆叠的或多结构域的免疫调节蛋白

在本发明的一些实施方式中，免疫调节蛋白含有不存在于野生型IgSF家族成员(“II型”免疫调节蛋白)的亲和力修饰的和/或非亲和力修饰的IgSF结构域序列的组合(“非野生型组合”)和/或排列(“非野生型排列”或“非野生型置换”)。非亲和力修饰的(例如，野生型)或经亲和力修饰的IgSF结构域的序列可以是哺乳动物的，如来自小鼠、大鼠、短尾猴、或人来源，或其组合。存在于II型免疫调节蛋白(非野生型组合或非野生型排列)的实施方式中的这些非亲和力修饰的或亲和力修饰的IgSF结构域的数量是至少2、3、4或5个，并且在一些实施方式中是正好2、3、4或5个IgSF结构域(因此对亲和力修饰的IgSF结构域数量的确定忽略任何其非特异性结合的部分序列和/或实质上免疫失活的部分序列)。

在一些实施方式中，本发明的II型免疫调节蛋白含有IgSF结构域的非野生型组合，其中IgSF结构域可以是表1所列的IgSF家族成员的IgSF结构域。因此，在一些实施方式中，免疫调节蛋白可以包含第一和第二IgSF结构域，其可以是相较于包含在表1所示IgSF家族成员中的IgSF结构域，各自包含一个或多个氨基酸取代的亲和力修饰的IgSF结构域。

在一些实施方式中，IgSF结构域各自独立地是包含在IgSF家族成员的亲和力或非亲和力修饰的IgSF结构域，所述IgSF家族成员选自家族：信号调节蛋白(SIRP) 家族、在骨髓细胞样上表达的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白 (Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG) 家族、V-集跨膜结构域家族(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR) 、连接蛋白(Nec)家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关 (PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白 (TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。在一些实施方式中，IgSF 结构域各自独立地衍生自IgSF蛋白，其选自包括如下的组：CD80(B7-1)、CD86 (B7-2)、CD274(PD-L1、B7-H1)、PDCD1LG2(PD-L2、CD273)、ICOSLG (B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2)、CD276(B7-H3)、VTCN1(B7-H4)、 CD28、CTLA4、PDCD1(PD-1)、ICOS、BTLA(CD272)、CD4、CD8A(CD8-α) 、CD8B(CD8-β)、LAG3、HAVCR2(TIM-3)、CEACAM1、TIGIT、PVR(CD155) 、PVRL2(CD112)、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1(CD200R)和 NC R3(NKp30)。

在一些实施方式中，相较于野生型或未修饰的IgSF结构域中的IgSF结构域，如表1中所示的IgSF家族成员的IgSF结构域，IgSF结构域独立地包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有与野生型或未修饰的IgSF结构域或其特异性结合片段至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述特异性结合片段包含在SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，野生型或未修饰的IgSF结构域是IgV结构域或IgC结构域，如IgC1或IgC2 结构域。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的IgV结构域或IgC结构域。

在本发明的II型免疫调节蛋白的一些实施方式中，IgSF结构域的数量是至少 2个，其中亲和力修饰的数量和非亲和力修饰的IgSF结构域的数量各自独立地是至少：0、1、2、3、4、5或6个。因此，亲和力修饰的IgSF结构域的数量和非亲和力修饰的IgSF结构域的数量分别(亲和力修饰的IgSF结构域：非亲和力修饰的 IgSF结构域)可以是正好或至少：2：0(亲和力修饰的：野生型)、0：2、2：1 、1：2、2：2、2：3、3：2、2：4、4：2、1：1、1：3、3：1、1：4、4：1、1：5 、或5：1。

在II型免疫调节蛋白的一些实施方式中，至少两个非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域是相同的IgSF结构域。

在一些实施方式中，本发明的II型免疫调节蛋白包含来自单一IgSF成员但以非野生型排列(或者，“置换”)的至少两个亲和力修饰的和/或非亲和力修饰的IgSF 结构域。非野生型排列或置换的一个说明性示例是本发明的免疫调节蛋白，其相对 IgSF结构域序列作为非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgS结构域来源的野生型哺乳动物IgSFS家族成员，含有亲和力修饰的和/或非亲和力修饰的IgSF结构域序列的非野生型顺序。在上述实施方式中的哺乳动物野生型IgSF成员具体包括表1 中列出的那些。因此，在一实施例中，如果野生型家族成员含有细胞表面蛋白的跨膜结构域近端的IgC1结构域和跨膜结构域远端的IgV结构域，那么即使在非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的形式中，本发明的免疫调节蛋白可以含有跨膜结构域近端的IgV和远端的IgC1。在本发明的免疫调节蛋白中，非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的非野生型组合和非野生型排列的同时存在也是在本发明的范围内。

在II型免疫调节蛋白的一些实施方式中，非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域是不相同的(即，不同的)IgSF结构域。不相同的亲和力修饰的IgSF 结构域在特定结合调节性下特异性地结合不同的关联结合伴侣，并且无论其工程改造的野生型IgSF结构域是否相同，它们都是“不相同的”。因此，例如，本发明的免疫调节蛋白中至少两个不相同的IgSF结构域的非野生型组合可以含有至少一个来源于IgSF家族成员且其独有的IgSF结构域序列，和至少一个来源于IgSF家族成员且其独有的第二IgSF的结构域序列，其中免疫调节蛋白的IgSF结构域是以非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的形式。然而，在替代性实施方式中，两个不相同的IgSF结构域来自同一IgSF结构域序列但至少一个经亲和力修饰，这样它们特异性地结合不同的关联结合伴侣。

在一些实施方式中，存在于本发明的免疫调节蛋白中的不相同的非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的数量是至少2、3、4或5个，并且在一些实施方式中，正好是2、3、4或5个不相同的非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF 结构域。在一些实施方式中，不相同的IgSF结构域是表1中所示的至少2个IgSF 成员形成的组合，并且在一些实施方式中，是表1的至少3或4个IgSF成员。

在一些特定的实施方式中，本发明的II型免疫调节蛋白含有亲和力修饰的 NKp30IgSF结构域和亲和力修饰的ICOSLG IgSF结构域，亲和力修饰的CD80 IgSF 结构域或亲和力修饰的CD86 IgSF结构域。在一些实施方式中，II型免疫调节蛋白包含来自至少2个B7家族成员的亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的结构域，其选自亲和力修饰的CD80 IgSF 结构域，亲和力修饰的ICOSLG IgSF结构域或亲和力修饰的CD86 IgSF结构域或其特异性结合片段。在一些实施方式中，亲和力修饰的结构域是通过至少或正好1 、2、3、4个G4S结构域连接。

堆叠的免疫调节蛋白多肽链的多个非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF 结构域不需要直接共价地连接到另一个。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸残基的间隔跨度间接地将非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域之间共价连接。连接可以通过N-末端到C-末端残基。

在一些实施方式中，连接可以通过不位于非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端或C-末端的氨基酸残基的侧链实现。因此，连接可以通过末端或内部氨基酸残基或其组合实现。

在一些实施方式中，连接非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的“肽接头”可以是单氨基酸残基或在长度上更长。在一些实施方式中，肽接头具有至少1个氨基酸残基，但是不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10 、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸长度。在一些实施方式中，该接头是(单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个 4GS接头的重复。在另外一些任选的实施方式中，一系列的丙氨酸残基插入肽接头 (如4GS接头或其多聚体)和免疫调节蛋白共价连接的Fc之间。在一些实施方式中，各系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5或6个丙氨酸。

在一些实施方式中，非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域通过插入在第一和/或第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端和/或C 末端的“野生型肽接头”连接。在一些实施方式中，存在插入在第一IgSF结构域N- 末端的前导肽接头和/或插入在第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域C-末端的第一尾随序列。在一些实施方式中，存在插入在第二IgSF结构域N- 末端的第二前导肽接头和/或插入在第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF 结构域C-末端的第二尾随序列。当第一和第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的 IgSF结构域是衍生自相同亲本蛋白质并且以相同的取向连接时，第一和第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域之间的野生型肽接头不是重复的。例如，当第一尾随野生型肽接头和第二前导野生型肽接头是相同的，II型免疫调节蛋白并不含有或者第一尾随野生型肽接头或第二前导野生型肽接头。

在一些实施方式中，II型免疫调节蛋白含有插入在第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端的第一前导野生型肽接头，其中第一主导野生型肽接头含有至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多) 连续氨基酸，其来自衍生第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间的间插序列。在一些实施方式中，第一前导野生型肽接头含有衍生第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间的全部的间插序列。

在一些实施方式中，II型免疫调节蛋白还含有插入在第一非亲和力修饰的和/ 或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端的第一尾随野生型肽接头，其中第一尾随野生型肽接头含有至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)连续氨基酸，其来自衍生第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间的间插序列。在一些实施方式中，第一尾随野生型肽接头含有衍生第一非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间的全部的间插序列。

在一些实施方式中，II型免疫调节蛋白还含有插入在第二非亲和力修饰的和/ 或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端的第二前导野生型肽接头，其中第二前导野生型肽接头含有至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)连续氨基酸，其来自衍生第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之前的结构域(如信号肽或IgSF结构域) 之间的间插序列。在一些实施方式中，第二前导野生型肽接头包含衍生第二非亲和力修饰的和亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间的全部的间插序列。

在一些实施方式中，II型免疫调节蛋白还含有插入在第二非亲和力修饰的和/ 或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端的第二尾随野生型肽接头，其中第二尾随野生型肽接头含有至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)连续氨基酸，其来自衍生第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间的间插序列。在一些实施方式中，第二尾随野生型肽接头含有衍生第二非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的IgSF结构域的野生型蛋白质中亲本IgSF结构域和紧接之后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间的全部的间插序列。

含有CD80 IgSF结构域的II型蛋白质的示例性前导序列(leading sequence) 和尾随序列(trailing sequence)在SEQ ID NO:231和SEQ ID NO:232中示出。含有ICOSLIgSF结构域的II型蛋白质的示例性前导序列和尾随序列在SEQ ID NO:233和234中示出。含有CD86 IgSF结构域的II型蛋白质的示例性前导序列和尾随序列在SEQ ID NO:236至238中示出。含有NKp30 IgSF结构域的II型蛋白质的示例性野生型接头序列在SEQ ID NO:235中示出。

C.亲和力修饰的免疫调节蛋白的形式

在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白是可溶形式。本领域的技术人员将意识到，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ECD)，并且这些蛋白质的可溶形式可以使用细胞外结构域或其后续免疫活性制成。因此，在一些实施方式中，含有亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或跨膜结构域的部分。在一些实施方式中，含有亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白缺少细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的部分。在一些实施方式中，免疫调节蛋白包含亲和力修饰的IgSF结构域，其只包含ECD结构域或其包含IgV 结构域和/或IgC结构域或其特异性结合片段的部分。

在一些实施方式中，本发明的免疫调节蛋白的可溶形式是与免疫球蛋白Fc直接或间接共价结合的。通常，FC共价地结合免疫调节蛋白的氨基末端。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc是哺乳动物IgG类免疫球蛋白，如IgG1或IgG2。在具体实施方式中，Fc将会是人IgG1或IgG2 Fc。本领域技术人员将会意识到，可以对Fc做出微小的改变，如1、2、3或4个氨基酸取代、缺失、添加或其组合，这将不会实质上改变其药代动力学性质。例如，可以进行这些改变，以有助于可制造性或增强、抑制或消除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。本文所用术语“Fc”意在包括这些分子。

在一些实施方式中，Fc是鼠或人Fc。在一些实施方式中，Fc衍生自IgG1，如人IgG1。在一些实施方式中，Fc含有示于SEQ ID NO:226的氨基酸序列，或显示出与SEQ ID NO:226至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，Fc衍生自IgG2，如人IgG2。在一些实施方式中，Fc含有SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列，或显示出与SEQ ID NO:227至少85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的IgSF-Fc 变体融合体的Fc区域，从而生成Fc区域变体。在一些实施方式中，Fc区域变体具有减弱的效应功能。现有许多对Fc序列的改变或突变的示例，其可以改变效应功能。例如，WO 00/42072、WO2006019447和Shields等.J Biol.Chem.9(2): 6591-6604(2001)描述了具有对FcR的改善的或减弱的结合的示例性Fc变体。这些出版物的内容特别通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，Fc区域具有一些但不是所有效应功能，这使其成为这样的应用的理想候选物，其中体内Fc融合体的半衰期是十分重要的而某些效应功能 (如CDC和ADCC)不是必须的或是有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性试验以确定CDC和/或ADCC活性的减少/清除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合试验以确保Fc-ICOSL变体融合体没有FcγR结合(因此可能没有ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞——NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-492(1991)第464页的表3总结了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外试验的非限制性的示例在美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见，M.等.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。或者，可以使用非放射性试验方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTI

具有减少的效应功能的Fc融合体包括根据EU编号具有Fc区域238、265、 269、270、297、327和329残基的一个或多个取代那些(美国专利号6,737,056) 。这样的Fc突变体包括根据EU编号在氨基酸位265、269、270、297和327的两个或多个取代的Fc突变体，包括被称为“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代成丙氨酸(美国专利号7,332,581)。

描述了具有改善的或减弱的对FcR的结合的某些Fc变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；WO2006019447和Shields等.,J.Biol.Chem. 9(2):6591-6604(2001).)。

在一些实施方式中，在Fc区域内进行了改变，这导致C1q结合和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)减弱，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642 和Idusogie等.,J.Immunol.164:4178-4184(2000).中所述。

在一些实施方式中，提供了含有变体Fc区域的ICOSL-Fc变体融合体，所述变体Fc区域含有1个或多个氨基酸取代,其增强半衰期和/或改善对新生Fc受体 (FcRn)的结合。具有增强的半衰期和对FcRn改善的结合的抗体在 US2005/0014934A1中描述(Hinton等)。这些抗体含有具有1个或多个改善Fc 区域对FcRn结合的取代的Fc区域。这样的Fc变体包括根据EU编号具有在以下 Fc区域残基的一个或多个取代那些：238、256、265、272、286、303、305、307 、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区域残基434的取代(美国专利号7,371,826)。

同样参见Duncan和Winter,自然(Nature)322:738-40(1988)；美国专利号 5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351就Fc区域变体的其它示例。

在一些实施方式中，Fc是包含至少一个氨基酸取代的IgG1变体，所述氨基酸取代根据SEQ ID NO:226的编号是N82G(对应于根据EU编号的N297G)。在一些实施方式中，变体Fc区域还包括C5S氨基酸修饰。例如，在一些实施方式中，变体Fc区域包括如下的氨基酸修饰：C5S和N82G。

在一些实施方式中，Fc与本发明的免疫调节蛋白的间接共价结合可以通过，例如通过单个氨基酸或通过肽(两个或多个氨基酸残基长度)接头实现。此外，这些Fc融合体分子的单个多肽链可以通过多种方式二聚化，包括通过多肽链间二硫键。本发明的免疫调节蛋白的二聚化形式可以包括两种相同的或基本相同种的本发明的多肽(同源二聚体)，或本发明的多肽链的不同种(异源二聚体)。应当理解的是，由于来自表达或蛋白水解中微小的差异所带来的氨基末端和羧基末端残基的微小差异，或者由于翻译后修饰所导致的差异，微观异质性可以存在于即使相同种的多肽链之间。尽管如此，这样基本上相同的链被认为是同源二聚体。衍生的免疫调节蛋白是在本发明的范围内的，并且常常是为了，例如提供改变的物理-化学或药代动力学性质而制作的。

在甚至更加具体的实施方式中，前述的具体实施方式是共价地连接Fc，如人 IgG1或IgG2结构域。在另一具体实施方式中，Fc通过1个或多个G4S结构域附着于免疫调节蛋白，其常具有至少或正好1、2、3、4或5个直接连接Fc和免疫调节蛋白的连续丙氨酸残基。

在其他的实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白连接脂质体膜。本领域已知多种将蛋白质共价地或非共价地附着于脂质体表面的方法，如通过酰胺偶联或二硫化物/硫醚偶联。

D.免疫调节蛋白的功能性活性

在一些实施方式中，本文提供的包含亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白(全长和/或特异性结合片段或其堆叠构建体或融合体)显示免疫调节活性，从而调整T细胞活化。功能上，无论结合其关联结合伴侣的特异性结合是否增强或是减弱，本文提供的免疫调节蛋白相对于在适当的试验对照下的淋巴细胞，如在 MLR试验中的，起着提高或抑制淋巴细胞的免疫活性的作用。在一些实施方式中，本文提供的免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的IgSF结构域，其中至少一个亲和力修饰的IgSF结构域起着提高免疫活性的作用，并且至少一个亲和力修饰的 IgSF结构域起着抑制免疫活性的作用。

在一些实施方式中，提供的免疫调节蛋白相对于野生型或未修饰的IgSF结构域对照，在原代T细胞试验中调整IFN-γ表达。在一些情况中，IFN-γ表达的调整相对于对照，可以增强或减弱IFN-γ表达。确定特异性结合和IFN-γ表达的试验为本领域所熟知，并且包括在培养物上清液测量干扰素-γ细胞因子水平的MRL(混合的淋巴细胞反应)试验(Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res).2014 九月:2(9):846-56)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激试验(Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res.)2014九月:2(9):846-56)和抗-CD3 T细胞刺激试验(Li和Kurlander,J Transl Med.2010:8:104)。2010:8:104).

在一些实施方式中，含有亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白在原代T细胞试验中相对于野生型IgSF结构域对照，可以在一些实施方式中增强，或者，可以在其它一些实施方式中减弱IFN-γ(干扰素-γ)表达。在提供的包含亲和力修饰的 IgSF结构域的多肽的一些实施方式中，多肽在原代T细胞试验中相对于野生型 ICOSL对照，可以增强IFN-γ表达，并且可以在其它一些实施方式中减弱IFN-γ表达。在提供的包含多亲和力修饰的IgSF结构域的多肽的一些实施方式中，多肽在原代T细胞试验中相对于野生型IgSF对照，可以增强IFN-γ表达，并且可以在其它一些实施方式中减弱IFN-γ表达。

本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达的增强的原代T细胞试验的形式可以不同于用于测试IFN-γ表达的减弱。在测试免疫调节蛋白在原代T细胞试验中减弱IFN-γ表达的能力中，可以使用如实施例6中所述混合的淋巴细胞反应 (MLR)试验。在一些情况中，免疫调节蛋白的可溶性形式可以用于确定亲和力修饰的IgSF结构域在MRL以及实施例6中所述的类似试验中拮抗并因此减弱 IFN-γ表达的能力。

或者，在测试免疫调节蛋白在原代T细胞试验中增强IFN-γ表达的能力中，可以使用如实施例6中所述共固化试验。在共固化试验中，在一些实施方式中由抗-CD3抗体提供的TCR信号与共固化的包含亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白联用，从而确定相对于IgSF结构域对照增强IFN-γ表达的能力。在一些情况中，多聚化至提供多价结合的程度的免疫调节蛋白的可溶性形式可以用于确定免疫调节蛋白在MRL以及实施例6中所述的类似试验中拮抗并因此增强IFN-γ表达的能力。

使用合适的对照是本领域技术人员所知的，然而，在前述一些实施方式中，对照通常涉及使用未修饰的IgSF结构域，如来自与衍生的或开发的IgSF结构域相同哺乳动物物种的天然IgSF同种型的野生型。无论对关联结合伴侣之一或两者的结合亲和力是否增强或减弱，具体的免疫调节蛋白在原代T细胞试验中相对于野生型IgSF结构域对照，在一些实施方式中将增强IFN-γ表达，在其它实施方式中可以减弱IFN-γ表达表达。

在一些实施方式中，免疫调节蛋白(例如，包含亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白)相对于野生型或未修饰的IgSF结构域对照增强IFN-γ表达(即，蛋白质表达)至少：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其它实施方式中，免疫调节蛋白(例如，包含亲和力修饰的IgSF结构域的免疫调节蛋白)相对于野生型或未修饰的IgSF结构域对照减弱IFN-γ表达(即，蛋白质表达)至少：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方式中，免疫活性的增强可以是比如在MLR试验中的非零对照值大至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增长。Wang等,癌症免疫研究(Cancer Immunol Res).2014九月: 2(9):846-56。在一些实施方式中，免疫活性的抑制可以是至少10％，并且上至20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的减弱。

III.核酸和制作蛋白质的方法

本发明提供了统称为“本发明的核酸”的分离或重组核酸，其编码本发明的免疫调节蛋白(I型和II型)各种实施方式的任意一个。本发明的核酸，包括如下所述的所有都可以用于本发明多肽的重组生成(例如，表达)。本发明的核酸可以以 RNA的形式或以DNA的形式，并且包括mRNA、cRNA、重组或合成RNA和DNA 、和cDNA。发明的核酸通常是DNA分子，并且常是双链DNA分子。然而，还提供了含有发明的任意核苷酸序列的单链DNA、单链RNA、双连RNA、和混合DNA/RNA核酸或其组合。

本发明还涉及表达载体和宿主细胞，其可用于生成本发明的免疫调节蛋。本发明的免疫调节蛋白可以使用重组DNA技术在转化的宿主细胞中制成。为此，制备了编码免疫调节蛋白的重组DNA分子。制备这样的DNA分子的方法为本领域所熟知。例如，使用合适的限制性内切酶，可以从DNA中提取出编码肽的序列。或者，可以使用化学合成技术，如亚磷酰胺方法合成DNA分子。或者，可以使用这些技术的组合。在一些情况中，重组或合成核酸可以通过聚合酶链反应(PCR) 生成。

发明还包括在适合免疫调节蛋白表达的条件下，能够在适当的宿主细胞中表达免疫调节蛋白的表达载体。重组表达载体包含DNA分子，其编码可操作性地连接适当的表达控制序列的免疫调节蛋白。在DNA分子插入载体之前或之后实现这一可操作性的连接的方法都是已知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、帽信号、聚腺苷酸化信号和其他涉及控制转录或翻译的信号。将其上具有DNA分子的所得重组表达载体用于转化适当的宿主。可以使用本领域所熟知的方法进行转化。在一些实施方式中，本发明的核酸还含有编码分泌或信号肽的核苷酸序列，其可操作地连接编码本发明的免疫调节蛋白的核酸，因此从培养基、宿主细胞、或宿主细胞周质回收免疫调节蛋白。

本发明的实践中可以使用大量的可得和已知的宿主细胞中的任一种。对合适的宿主的选择依赖于本领域所知的多个因素。这些因素包括，例如，与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化的速率、回收肽的容易程度、表达特性、生物安全性和成本。这些因素之间的平衡应当与并不是所有的宿主对特定DNA序列的表达具有相同效果的理解结合。宿主细胞可以是多种真核细胞，如在酵母细胞中的，或与哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。宿主细胞可以还是原核细胞，如大肠杆菌。转化的宿主在免疫调节蛋白表达条件下培养，并且随后进行纯化。重组宿主细胞可以在传统发酵条件下培养，从而表达所需免疫调节蛋白。这些发酵条件都是本领域所熟知的。最终，回收免疫调节蛋白并通过本领域所熟知的多种方法中的任意方法从重组细胞培养物纯化，所述多种方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析和亲和层析。根据需要，可以使用蛋白质重折叠步骤完成成熟蛋白质的构型。最终，可以在最终纯化步骤采用高效液相色谱(HPLC)。本发明的免疫调节蛋白还可以通过合成的方法制成。固相合成是制造单个肽的优选技术，因为它是制造小肽的成本最低的方法。例如，熟知的固相合成技术包括使用保护基团、接头和固相支持物，以及特异性保护和去保护反应条件，接头裂解条件，清除剂的使用，和固相肽合成的其它方面。其后可以将肽组装成本发明的免疫调节蛋白。

设计和产生免疫调节发明的亲和力修饰的IgSF结构域的手段并不限于特定的方法。然而，在一些实施方式中，野生型IgSF结构域是由野生型IgSF遗传材料诱变的(位点特异性、随机性、或其组合)并根据实施例中公开的方法对改变的结合进行筛选。诱变核酸的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是利用可以在任意数量的公共数据库中得到的蛋白质或核酸序列从头合成的，并且随后进行筛选。国家生物技术信息中心提供这些信息，并且其网站是通过互联网公众可及的，如之前所讨论的UniProtKB数据库。

IV.筛选或鉴定亲和力修饰的IgSF结构域的方法

本文提供了鉴定能够在相同时间或以非竞争的方式结合两个或多个关联结合伴侣的亲和力修饰的免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法包括：a)将含有至少一个非免疫球蛋白修饰免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域或其特异性结合片段修饰的蛋白质与至少两个关联结合伴侣在能够令蛋白质与至少两个关联结合伴侣结合的条件下接触，其中至少一个修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中的一个或氨基酸取代；b)b)鉴定相较于含有野生型IgSF结构域的蛋白质对两个关联结合伴侣中至少其一结合具有增强的含修饰的IgSF结构域的修饰蛋白质；并且 c)选择非竞争性地结合至少两个关联结合伴侣的含修饰IgSF结构域的修饰蛋白质，从而鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白。在一些实施方式中，选择的亲和力修饰的蛋白质能够在同时、共结合两个关联结合伴侣。评估或确定蛋白质对于两个以上不同的配体的非竞争性结合相互作用的存在是在本领域技术人员的水平之内。此类方法的示例在实施例7中描述。

在一些实施方式中，IgSF结构域是非免疫球蛋白IgSF结构域。在一些实施方式中，修饰的或变体蛋白质是在任意非免疫球蛋白IgSF家族成员(如表1中所示各项)的IgSF结构域中已进行了一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的一个。在一些实施方式中，修饰的或变体IgSF结构域或包含修饰的或变体IgSF结构域的修饰的蛋白质包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 、17、18、19、或20个氨基酸差异，例如氨基酸取代。

在一些实施方式中，修饰的和变体蛋白质的文库是通过使用本领域通常知晓的任何方法对已知包含非免疫球蛋白IgSF结构域的蛋白质的任意一个或多个氨基酸残基进行突变生成的。在本领域生成、工程改造或使结合分子多样化中所使用的任何方法都可以用于生成本文的修饰的IgSF结构域。这些用于生成、工程改造或使结合分子多样化的方法的示例包括但不限于以下内容中所述方法：美国专利号 5,223,409；5,571,698、5,750,373、5,821,047；5,837,500；5,733,743；5,871,907； 5,969,108；6,040,136；6,172,197；6,291,159；6,955,877；6,979,538；6,831,161； 7,063,943；7,118,879；7,208,293；7,332,571；7,385,028；7,696,312；7,638,299； 7,888,533；7,642,044；美国专利申请号US20080300163；US20090208454； US20090155843；US20080113412；US20100035812；US20100093608；US20110015345；例如，IgSF-contiain可以用于在生物分子的多样化和工程改造的方法中取代其它结合分子的方法中。

生成结合分子的文库以及在文库中产生多样性的方法为本领域所熟知，并且可以被用于生成蛋白质变体的文库。生成多样性的方法包括本领域所熟知的靶向和非靶向方法。例如，生成不同的核酸和多肽文库的已知方法包括但不限于：易错 PCR、盒式诱变；共同引物延伸(mutual primer extension)；模板辅助的连接和延伸；密码子盒式诱变；寡核苷酸定向诱变；使用简并寡核苷酸引物的扩增，包括重叠和两步PCR；和组合方法，如组合多重盒式诱变(CMCM)和相关技术。本领域技术人员对这些技术都十分熟悉。

对蛋白质进行突变从而生成候选的修饰的蛋白质分子文库的方法的示例包括在整个蛋白质序列上产生随机突变的方法，或产生蛋白质选定区域或结构域的突变的方法。突变可以使用产生蛋白质的机诱变的方法随机地引入，或者使用在靶向的位点特异性地产生单个或多个氨基酸改变的方法更加系统地引入。随机突变和系统性位点引导诱变两者都可用于将一个或多个突变引入蛋白质。变体蛋白质相较于用做生成文库的支架的野生型或未修饰的蛋白质，可以具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。取代或插入可以用任何天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。

在根据提供的方法鉴定或生成包含非免疫球蛋白IgSF结构域的变体或修饰的蛋白质的方法中，可以使用区域的随机突变对蛋白质的一个或多个区域，如IgSF 结构域或蛋白质的结构域进行修饰，从而生成一个或多个修饰的蛋白质分子。例如，可以生成包含多个修饰的分子的变体的文库，所述多个修饰的分子相较于对应的包含IgSF结构域的未修饰的或野生型蛋白质，各自具有在IgSF结构域的至少一个氨基酸替换(即，取代)、缺失或插入。氨基酸取代相较于未修饰的或野生型蛋白质，可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸的取代。通常，本文提供的文库包括含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、10

在一些实施方式中，先于选择含有与至少两个关联结合伴侣非竞争性结合的修饰的IgSF结构域的修饰的蛋白质，该方法包括将两个或多个修饰的IgSF结构域或其在步骤(b)中鉴定的特异性结合片段组合，从而生成包含多个不同修饰IgSF 结构域的堆叠分子构造体。

因此，在一些实施方式中，本文提供了鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白的方法，其包括：a)将含有至少一个非免疫球蛋白修饰免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域或其特异性结合片段修饰的蛋白质与至少两个关联结合伴侣在能够令蛋白质与至少两个关联结合伴侣结合的条件下接触，其中至少一个修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代；b)鉴定相较于含有野生型 IgSF结构域的蛋白质对两个关联结合伴侣中至少其一结合具有增强的含修饰的 IgSF结构域的修饰蛋白质；c)将存在于两个或多个鉴定的蛋白质中的两个或多个修饰的IgSF结构域组合，从而生成含有连接至第二IgSF结构域的第一修饰的IgSF 结构域的融合(堆叠的)蛋白；并且d)选择非竞争性地结合至少两个关联结合伴侣的含修饰IgSF结构域的修饰蛋白质，从而鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白。

在一些实施方式中，至少两个关联结合伴侣是表达在哺乳动物细胞表面的细胞表面分子。在一些实施方式中，细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中的一个，并且细胞表面分子各自表达在形成IS的两个哺乳动物细胞中的至少一个。在一些实施方式中，至少一个哺乳动物细胞是淋巴细胞，其可以是NK细胞或T细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是肿瘤细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是抗原呈递细胞。

在一些实施方式中，两个或多个关联结合伴侣独立地是IgSF成员的配体，所述IgSF成员选自：CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、 CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、 CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R或 Nkp30。在一些实施方式中，两个或多个关联结合伴侣独立地是B7家族成员的配体。在一些实施方式中，两个或多个关联结合伴侣是选自CD28、CTLA-4、ICOS或PD-L1中的两个或多个。

V.药物组合物和制剂

含有本发明治疗性组合物的药物组合物可以含有用于改变，维持或保持组合物的，例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂物质。药物组合物中的主要的载剂或运载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的载剂或运载体可以是注射用水或生理盐水，可能补充有肠胃外给药的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性的载剂。其它示例性药物组合物包括约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可能还包括山梨醇或因此合适的替代。在本发明的一个实施方式中，通过将选择的具有所需纯度的组合物与任选的制剂以冻干饼或水性溶液的形式混合，可以制备用于储存的结合剂组合物。此外，使用合适赋形剂(如蔗糖)可以将结合剂产物配制成冻干物。

制剂组合物以给药位点可接受的浓度存在。例如，使用缓冲液以将组合物维持在生理pH或稍微较低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。一个特别合适肠胃外给药的载剂是无菌蒸馏水，其中结合剂被配制成适当保存的无菌的等渗溶液。另一种制备可以涉及所需分子与为产品的受控或持续释放而提供的试剂，如与可注射微球体、生物可侵蚀(bio-erodible)颗粒、聚合化合物(聚乳酸，聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的配制，所述产品可以其后经积存注射进行递送。

在另一方面，适用于胃肠外给药的药物制剂可以可配制在水溶液中，优选生理相容性缓冲液，如汉克斯(Hank’s)溶液、林格(Ringer’s)溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬液可以包含增加悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖苷。其它的药物组合物对于本领域技术人员来说是显而易见的，包括涉及在缓释或受控递送制剂中结合剂分子的制剂。用于配制多种其他缓释或受控递送方法，如脂质体运载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和积存注射的技术也是为本领域技术人员所熟知的。用于体内给药的药物制剂通常必须是无菌的。这可以通过无菌滤膜过滤实现。当组合物是冻干时，使用这一方法的灭菌可以在冻干和重建之前或之后进行。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干的形式或溶液储存。此外，肠胃外组合物一般将被置于具有无菌进入端口的容器中，例如，具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液包或瓶中。

在一些实施方式中，药物组合物是无菌的。灭菌可以通过无菌滤膜过滤或辐射实现。当组合物是冻干时，使用这一方法的灭菌可以在冻干和重建之前或之后进行。用于胃肠外给药的组合物可以以冻干的形式或以溶液储存。此外，肠胃外组合物一般将被置于具有无菌进入端口的容器中，例如，具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液包或瓶中。

一旦配制了药物组合物，可以将其以溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体或脱水的或冻干的粉末储存在灭菌瓶中。这样的制剂可以以即用的形式或以需要在给药之前重建的形式(例如，冻干的)存在。用于治疗性应用的药物组合物的有效量将取决于，例如，治疗的内容和目的。本领域技术人员应当理解，(部分)取决于递送的分子、对于正在使用的结合剂分子的指示、给药途径、和患者的大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和总体健康状况)，对于治疗合适的剂量水平将会因此不同。相应地，临床医师可以改变药物剂量并调整给药路径从而获得最佳治疗效果。发明的治疗性组合物可以通过肠胃外、皮下、或静脉内、或如本文其他地方所述的方式给予。本发明的治疗性组合物可以以治疗有效量每月1、2、3或4次，每周2次、双周(每隔两周)、或双月(每隔两月)给予。给药可以持续1、2 、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长的周期(例如，1、2、3、4或更多年，包括对象的一生)。

通常，药物制剂给药的剂量和途径是根据对象的大小和状态根据标准药学实践确定的。例如，治疗有效剂量可在细胞培养实验或在如通常是小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴的动物模型进行最初地估算。可以使用动物模型以确定给药的适当浓度范围和途径。可以利用这些信息确定用于人体给药的有用剂量和途径。精确的剂量将会根据与需要治疗的对象有关的因素确定。调整剂量和给药以提供足够量的活性化合物或维持所需的效果。可能需要考虑的因素包括疾病状态的严重程度，对象的总体健康状况，对象的年龄、体重和性别，给药的时间和频率，药物组合，反应敏感性和对治疗的响应。

在一些实施方式中，药物制剂通过任何途径给予对象，包括口服、经皮地，通过吸入、静脉内注射、动脉内注射、肌内、直接应用于受伤位置、应用于手术位置、腹膜内给药，通过雾化、胸腔内、心室内、关节内、眼内或脊椎内。

在一些实施方式中，所述药物组合物的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方式中，以每天1次、每天2次、每天3次、或每天4次或更多次将剂量给予对象。在一些实施方式中，以一周内约1或更多个(如约2或更多个、约3或更多个、约4或更多个、约5或更多个、约6或更多个、或约7或更多个)剂量给予。在一些实施方式中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多个剂量。在一些实施方式中，治疗的过程是约1或多个剂量(如约2或多个剂量，约3或多剂量，约4 或多剂量，约5或多剂量，约7或多剂量，约10或多剂量，约15或多剂量，约 25或多剂量，约40或多剂量，约50或多剂量或约100或多剂量)。

在一些实施方式中，药物组合物的给予剂量是每kg对象体重约1μg蛋白质或更多(如每kg对象体重约2μg蛋白质或更多，每kg对象体重约5μg蛋白质或更多，每kg对象体重约10μg蛋白质或更多，每kg对象体重约25μg蛋白质或更多，每kg对象体重约50μg蛋白质或更多，每kg对象体重约100μg蛋白质或更多，每kg对象体重约250μg蛋白质或更多，每kg对象体重约500μg蛋白质或更多，每kg对象体重约1mg蛋白质或更多，每kg对象体重约2mg蛋白质或更多，或每kg对象体重约5mg蛋白质或更多)。

对于任何化合物，治疗有效量可在细胞培养实验或在如通常是小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴的动物模型进行最初地估算。可以使用动物模型以确定给药的适当浓度范围和途径。可以利用这些信息确定用于人体给药的有用剂量和途径。精确的剂量将会根据与需要治疗的对象有关的因素确定。调整剂量和给药以提供足够量的活性化合物或维持所需的效果。可能需要考虑的因素包括疾病状态的严重程度，对象的总体健康状况，对象的年龄、体重和性别，给药的时间和频率，药物组合，反应敏感性和对治疗的响应。取决于特定制剂的半衰期和清除速率，可以每3至4 天、每周、或每双周给予长效药物组合物。给药的频率将取决于所用制剂中分子的代谢动力学参数。通常，给予组合物直到剂量达到所需要的效果。组合物可以因此以单一剂量，或以随时间变化的多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)，或以连续输注的形式给予。合适剂量的进一步改进是常规进行的。合适的剂量可以通过使用合适的剂量响应数据确定。

在一些实施方式中，可以对治疗效果的一种或多种生物标志物或生理标志物进行监控，包括T细胞活化或增殖、细胞因子合成或生产(例如，TNF-α、IFN-γ、IL-2的生产)、各种活化标志物的诱导(例如，CD25、IL-2受体)、炎症、关节肿胀或压痛、C反应蛋白的血清水平、抗胶原抗体生产、和/或T细胞依赖性抗体应答。

含有合适的药学上可接受的赋形剂或运载体(例如，PBS)和有效量的本发明的治疗性组合物的可注射药物组合物可以胃肠外、肌内、腹腔内、静脉内、真皮下、经真皮、表皮下或表皮内给予哺乳动物患者。通过脂质体可以促进给药。对于通过任何合适的技术将本发明的治疗性组合物给予，皮肤和肌肉通常是用于的优选目标。因此，本发明的治疗性组合物递送到或通过哺乳动物对象(例如，人)的皮肤是本发明的特征。本发明的这些分子可以以药物学上接受的可注射溶液给予到或通过皮肤，例如，以肌内或腹腔内给予。给药还可以通过经皮装置实现，或者更典型地，将本发明的治疗性组合物以基因枪递送到或通过对象的皮肤，或到哺乳动物对象暴露的肌肉。

已知多种方法可以用于确定给予本发明的治疗性组合物是否充分地调整免疫活性，其中对免疫活性的调整是通过消除、隔绝、或灭活介导或能够介导不需要的免疫应答的免疫细胞；诱导、生成或启动介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能性质；或这些效果的组合。对免疫活性调整的测量的示例包括但不限于，检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应信号增殖或分裂的能力或抗性(例如在用抗-CD3抗体、抗-T细胞受体抗体，抗-CD28抗体、钙离子载体、PMA、载有肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞刺激后使用T细胞增殖试验和基于3H-胸苷掺入的Pepscan分析；B细胞增殖试验)；测量杀伤或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞试验)；测量细胞因子、趋化因子，细胞表面分子、抗体和细胞的其它产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、Western印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞的活化和免疫细胞的信号传导途径的生化标志物(例如，酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化，多肽裂解，和蛋白质复合物的形成或解离的Western印迹和免疫沉淀分析；蛋白质阵列分析；DNA转录，使用DNA阵列或减法杂交的概况)；测量通过凋亡、坏死或其他机制的细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色，TUNEL试验，凝胶电泳以测量DNA梯度，组织学；荧光胱冬酶试验，胱冬酶底物的Western 印迹分析)；测量免疫细胞产生的基因、蛋白质、和其它分子(例如，Northern印迹分析，聚合酶链式反应，DNA微阵列，蛋白质微阵列，二维凝胶电泳，Western 印迹分析，酶联免疫吸附试验，流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如自身免疫，神经变性和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病的改善(临床评分，使用其他疗法的要求，功能状态，成像研究)，例如，在多发性硬化的情况下通过测量复发率或疾病严重度(使用本领域普通技术人员已知的临床评分)，在I型糖尿病的情况下测量血糖，或在类风湿性关节炎的情况下的关节炎症。

本文还提供了在合适的包装中含有本文所述药物组合物的制品。对于本文所述的组合物(如眼药组合物)合适的包装是本领域所熟知的，并且包括，例如药瓶 (如密封的药瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。这些制品可以进一步的灭菌和/或密封。

还提供了含有本文所述的药物组合物(或制品)的试剂盒，其还可以含有使用该组合物的方法的说明书，如本文所述的用途。本文所述的试剂盒还可以包括从商业和使用者立场来看可能需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针头、注射器，和具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。

VI.治疗应用

本发明的免疫调节蛋白被认为具有在多种应用中的效用，包括但不限于，例如，治疗哺乳动物中多种免疫系统疾病或病症的预防性或治疗性方法(统称为“本发明的治疗性组合物”)，其中对免疫系统和免疫系统应答的调整和调节是有益于疾病或病症的治疗的。例如，免疫应答的抑制在阻止受体对来自供体的组织、细胞、或器官移植的排斥的预防性和/或治疗性方法中可以是有益的。在治疗性情况中，哺乳动物对象通常是患有免疫系统疾病或病症的对象，并且给药的实施是为了预防疾病或病症进一步发展。例如，将本发明的治疗性组合物给予患有免疫系统疾病(例如，自身免疫疾病)的对象可以产生对这种免疫系统攻击或与之相关生物相应的抑制或阻碍。通过抑制这种对健康身体组织的免疫系统攻击，可以减少或减轻由这些在健康组织上的攻击所引起或与之相关的由此产生的身体症状(例如，疼痛、关节炎症、关节肿胀或压痛)，并且可以减少、缓解或停止由免疫系统攻击所引起或与之相关的生物和身体损害。在预防性情况中，对象可以是存在、怀疑存在或认为存在免疫系统疾病、紊乱或病症的对象，并且给药的实施通常是为了预防疾病、紊乱或病症进一步发展，阻止或减轻与之相关的症状、体征或生物响应，预防可能由其所引起的身体损伤，和/或维持或改善对象的身体机能。

患者的免疫系统疾病或紊乱可以是或涉及，例如，但是不限于，阿狄森病、过敏、斑秃、阿尔茨海默氏病、抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(休斯综合征)、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、自身免疫疾病(例如，狼疮、RA、MS、Graves病等)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞氏病、伯杰氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、口炎性腹泻/腹腔疾病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘、多自由基神经病(CIPD)、慢性复发性多神经病(吉兰-巴雷综合征) 、Churg-Strauss综合征(CSS)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病(CAD)、COPD 、CREST综合征、克罗恩病、皮炎、疱疹样疾病(Herpetiformus)、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、基本混合冷球蛋白血症、伊文氏综合征、眼肌炎、纤维肌痛、古德帕斯丘氏综合征、移植相关的疾病或病症、格雷夫斯病、GVHD、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫增殖性疾病或紊乱(例如，牛皮癣)、炎性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、间质性肺病、幼年型糖尿病、幼年型关节炎、幼年特发性关节(JIA)、川崎病、肌无力综合征、扁平苔癣、狼疮、狼疮性肾炎、淋巴性脑囊炎(LymphoscyticLypophisitis)、梅尼埃病、米勒鱼综合症/急性播散性脑脊髓脊神经根病(acutedisseminated encephalomyeloradiculopathy)、混合性结蒂组织病、多发性硬化症(MS)、肌肉风湿症、肌痛性脑脊髓炎(ME)、重症肌无力、眼炎症、落叶型天疱疮、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多腺综合征(惠特克氏综合征)、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自身免疫性胆管病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺氏现象、赖特氏综合症/反应性关节炎、血管再狭窄、急性关节风湿病、风湿性疾病、类风湿性关节炎、肉状瘤病、施密特综合征、硬皮病、

本发明的治疗性组合物还也可以以单一疗法(即，作为单一药剂)，与至少一种化学治疗性药剂剂组合(即，组合疗法)，与癌症疫苗组合，与免疫检查点抑制剂组合和/或与放射疗法组合阻止哺乳动物的，特别是人的，癌细胞的生长。在本公开的一些方面，免疫检查点抑制剂是尼莫单抗(nivolumab)、特姆单抗 (tremelimumab)、彭美罗珠单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)或类似。给予有效量的治疗性组合物以阻碍、停止或逆转对于通过本发明的免疫调节蛋白的免疫活性调整敏感的癌症的发展。可以在体内或离体治疗人癌症细胞。在人患者的离体治疗中，含有癌细胞的组织或体液在身体外接受治疗，并在其后将组织或体液重新引入患者。在一些实施方式中，通过将治疗性组合物给予患者，在人患者体内治疗癌症。因此，本发明提供了离体和体内方法以阻碍、停止或逆转肿瘤的发展，或者以其他方式导致无无进展存活(即，治疗期间和之后患有癌症的患者的癌症没有恶化的生存时间长度)或总体存活(也称为“存活率”，即研究或治疗组中被诊断为癌症或治疗癌症后存活一段时间的人的百分比)相对于对照组的治疗产生统计学上显著地增长。可以通过本发明的方法治疗的癌症包括但不限于，黑色素瘤、膀胱癌、血液恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌(腺癌)、结直肠癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脾癌，胸腺癌或血细胞(即白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌或尤因氏肉瘤。

VII.示例性实施方式

提供的实施方式包括：

实施方式1。在一些实施方式中，提供了免疫调节蛋白，其含有至少一个非免疫球蛋白亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，所述免疫球蛋白超家族结构域含有在野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代，其中：至少一个亲和力修饰的IgSF结构域相较于野生型IgSF结构域具有对至少两个关联结合伴侣增强的结合；并且至少一个亲和力修饰的IgSF结构域特异性地非竞争性结合至少两个关联结合伴侣。

实施方式2。在实施方式1的其它一些实施方式中，至少两个关联结合伴侣是表达在哺乳动物细胞表面上的细胞表面分子。

实施方式3。在实施方式2的其它一些实施方式中，细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。

实施方式4。在实施方式2或实施方式3的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中的一个，并且细胞表面分子各自表达在形成IS的两个哺乳动物细胞中至少其一上。

实施方式5。在实施方式2至4中任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是淋巴细胞。

实施方式6。在实施方式5的其它一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T 细胞。

实施方式7。在实施方式5至6中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。

实施方式8。在实施方式7的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生增强的免疫活性。

实施方式9。在实施方式7的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生减弱的免疫活性。

实施方式10。在实施方式2至9中任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是肿瘤细胞。

实施方式11。在实施方式2至10中任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。

实施方式12。在实施方式4至11中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域能够特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

实施方式13。在实施方式1至12中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域来自IgSF家族成员，所述IgSF家族成员选自家族：信号调节蛋白(SIRP) 家族、表达在骨髓细胞样上的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白 (Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG) 家族、V-集跨膜结构域家族(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR) 、连接蛋白(Nec)家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关 (PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白 (TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。

实施方式14。在实施方式1至13中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域来自IgSF成员，其选自：CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOS配体、B7-H3 、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3 、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、 CD200R或Nkp30。

实施方式15。在实施方式1至14中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域是人IgSF成员。

实施方式16。在实施方式1至15中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域是IgV结构域、IgC1结构域、IgC2结构域或其特异性结合片段。

实施方式17。在实施方式1至16中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是亲和力修饰的IgV结构域、亲和力修饰的IgC1结构域或亲和力修饰的IgC2结构域或其含有一个或多个氨基酸取代的特异性结合片段。

实施方式18。在实施方式1至17中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域。

实施方式19。在实施方式18的其它一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自含有在相同野生型IgSF结构域中一个或多个不同的氨基酸取代。

实施方式20。在实施方式19的其它一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域各自含有在不同野生型IgSF结构域中一个或多个氨基酸取代。

实施方式21。在实施方式20的其它一些实施方式中，不同野生型IgSF结构域来自不同的IgSF家族成员。

实施方式22。在实施方式1至17中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白只含有一个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域。

实施方式23。在实施方式1至22中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。

实施方式24。在实施方式23的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二亲和力修饰的IgSF，其中第二亲和力修饰的IgSF含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含SEQ ID NO: 1-27中任一项所示的氨基酸序列。

实施方式25。在实施方式1至24中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域是B7家族的成员。

实施方式26。在实施方式1至25中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域是CD80、CD86或ICOSLG的结构域。

实施方式27。在实施方式1至26中任一项的其它一些实施方式中，野生型IgSF 结构域是CD80的结构域。

实施方式28。在一些实施方式中，提供了免疫调节蛋白，其含有至少一个亲和力修饰的CD80免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，所述CD80免疫球蛋白超家族结构域含有在野生型CD80 IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代，其中所述至少一个亲和力修饰的CD80IgSF结构域相较于野生型CD80 IgSF结构域具有对至少两个关联结合伴侣增强的结合。

实施方式29。在实施方式27或实施方式28的其它一些实施方式中，关联结合伴侣是CD28和PD-L1。

实施方式30。在实施方式27至29中任一项的其它一些实施方式中，野生型 IgSF结构域是IgV结构域和/或亲和力修饰的CD80结构域是亲和力修饰的IgV结构域。

实施方式31。在实施方式27至30中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的结构域含有与野生型CD80结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

实施方式32。在实施方式1至31中任一项的其它一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过20个氨基酸取代。

实施方式33。在实施方式1至32中任一项的其它一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过10个氨基酸取代。

实施方式34。在实施方式1至33中任一项的其它一些实施方式中，至少一个亲和力修饰的IgSF结构域含有在野生型IgSF结构域中至少1个且不超过5个氨基酸取代。

实施方式35。在实施方式1至34中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与至少两个关联结合伴侣各自的结合亲和力的至少120％。

实施方式36。在实施方式1至35中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有非亲和力修饰的IgSF结构域。

实施方式37。在实施方式1至36中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。

实施方式38。在实施方式1至37中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或细胞质结构域。

实施方式39。在实施方式1至38中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白只含有细胞外结构域(ECD)或其含有亲和力修饰的IgSF结构域的特异性结合片段。

实施方式40。在实施方式1至39中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

实施方式41。在实施方式1至40中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白连接多聚化结构域。

实施方式42。在实施方式1至41中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白连接Fc结构域或其效应功能降低的变体。

实施方式43。在实施方式42的其它一些实施方式中，Fc结构域是IgG1结构域、IgG2结构域或其效应功能降低的变体。

实施方式44。在实施方式39至41中任一项的其它一些实施方式中，Fc结构域是哺乳动物的、可以是人的；或变体Fc结构域相较于未修饰的哺乳动物的、可以是人的Fc结构域含有一个或多个氨基酸取代。

实施方式45。在实施方式42至44中任一项的其它一些实施方式中，Fc结构域或其变体含有SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:226或SEQID NO:227至少85％序列同一性的氨基酸序列。

实施方式46。在实施方式38至41中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白通过接头间接地连接。

实施方式47。在实施方式41至46中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是二聚体。

实施方式48。在实施方式1至47中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白附着于脂质体膜。

实施方式49。在一些实施方式中，提供了免疫调节蛋白，其含有至少两个非免疫球蛋白免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其中：非免疫球蛋白修饰的IgSF 结构域中至少其一是亲和力修饰的，以显示与其关联结合伴侣改变的结合；并且至少两个非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地特异性地结合至少一个不同的关联结合伴侣。

实施方式50。在实施方式49的其它一些实施方式中，至少两个非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自是亲和力修饰的IgSF结构域，其中第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域含有在第一野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代，并且第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域含有在第二野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代。

实施方式51。在实施方式50的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域相较于第一野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一显示出改变的结合；并且第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域相较于第二野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一显示出改变的结合。

实施方式52。在实施方式49至51中任一项的其它一些实施方式中，不同的关联结合伴侣是表达在哺乳动物细胞表面上的细胞表面分子。

实施方式53。在实施方式52的其它一些实施方式中，不同细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。

实施方式54。在实施方式52或实施方式53的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中的一个，并且不同细胞表面分子表达在形成IS的两个哺乳动物细胞中至少其一上。

实施方式55。在实施方式52至54的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是淋巴细胞。

实施方式56。在实施方式55的其它一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或 T细胞。

实施方式57。在实施方式55或实施方式56的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白与细胞的结合调整淋巴细胞的免疫活性。

实施方式58。在实施方式57的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生增强的免疫活性。

实施方式59。在实施方式57的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白相较于含有野生型IgSF结构域的野生型蛋白质能够产生减弱的免疫活性。

实施方式60。在实施方式52至59的任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物细胞中至少其一是肿瘤细胞。

实施方式61。在实施方式52至60中其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。

实施方式62。在实施方式54至61中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白能够特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

实施方式63。在实施方式49至62中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二修饰的IgSF结构域各自含有在不同野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代。

实施方式64。在实施方式63的其它一些实施方式中，不同野生型IgSF结构域来自不同的IgSF家族成员。

实施方式65。在实施方式49至64中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二修饰的IgSF结构域是非野生型组合。

实施方式66。在实施方式49至65中任一项的其它一些实施方式中，第一野生型IgSF结构域和第二野生型IgSF结构域各自独立地来自IgSF家族成员，所述IgSF家族成员选自家族：信号调节蛋白(SIRP)家族、表达在骨髓细胞样上的触发受体(TREML)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白(Butyrophilin)家族、B7家族、CD28家族、包含V-集和免疫球蛋白结构域(VSIG)家族、V-集跨膜结构域家族(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)、连接蛋白(Nec)家族、连接蛋白样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白(TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。

实施方式67。在实施方式49至66中任一项的其它一些实施方式中，第一野生型IgSF结构域和第二野生型IgSF结构域各自独立地来自IgSF成员，其选自： CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1 、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR 、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R或Nkp30。

实施方式68。在实施方式49至67中任一项的其它一些实施方式中，第一修饰的IgSF结构域和第二修饰的IgSF结构域各自独立地含有与野生型IgSF结构域或其特异性结合片段至少85％的序列同一性，所述特异性结合片段包含SEQ ID NO:1-27中任一项所示的氨基酸序列。

实施方式69。在实施方式49至68中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是B7家族的成员。

实施方式70。在实施方式69的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF 结构域各自独立地来自CD80、CD86或ICOSLG。

实施方式71。在实施方式49至68中任一项的其它一些实施方式中，第一或第二野生型IgSF结构域来自B7家族的成员，并且第一或第二野生型IgSF结构域的另一个来自另一个IgSF家族。

实施方式72。在实施方式49至68和71中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域来自ICOSLG和NKp30。

实施方式73。在实施方式49至68和71中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域来自CD80和NKp30。

实施方式74。在实施方式49至73中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是人IgSF成员。

实施方式75。在实施方式49至74中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二野生型IgSF结构域各自独立地是IgV结构域、IgC1结构域、IgC2结构域或其特异性结合。

实施方式76。在实施方式49至75中任一项的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的结构域和第二非免疫球蛋白修饰的结构域各自独立地是修饰的 IgV结构域、修饰的IgC1结构域或修饰的IgC2结构域或其含有一个或多个氨基酸取代的特异性结合片段。

实施方式77。在实施方式49至76中任一项的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的结构域或第二非免疫球蛋白修饰的结构域中至少其一是修饰的 IgV结构域。

实施方式78。在实施方式49至77中任一项的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过20个氨基酸取代。

实施方式79。在实施方式49至78中任一项的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过10个氨基酸取代。

实施方式80。在实施方式49至79中任一项的其它一些实施方式中，第一非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地含有1个并且不超过5个氨基酸取代。

实施方式81。在实施方式49至80中任一项的其它一些实施方式中，第一或第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域中至少其一具有的结合亲和力是野生型IgSF 结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的10％和90％。

实施方式82。在实施方式49至81中任一项的其它一些实施方式中，第一或第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域中至少其一所具有的结合亲和力是所述野生型IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的至少120％。

实施方式83。在实施方式49至80和82中任一项的其它一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域各自独立地所具有结合亲和力是野生型 IgSF结构域与其关联结合伴侣中至少其一的结合亲和力的至少120％。

实施方式84。在实施方式49至83中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。

实施方式85。在实施方式49至84中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

实施方式86。在实施方式49至85中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白连接多聚化结构域。

实施方式87。在实施方式49至86中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白连接Fc结构域或其效应功能降低的变体。

实施方式88。在实施方式87的其它一些实施方式中，Fc结构域是IgG1结构域、IgG2结构域或其效应功能降低的变体。

实施方式89。在实施方式87或实施方式88的其它一些实施方式中，Fc结构域是哺乳动物的、可以是人的；或变体Fc结构域相较于未修饰的哺乳动物的、可以是人的Fc结构域含有一个或多个氨基酸取代。

实施方式90。在实施方式87至89中任一项的其它一些实施方式中，Fc结构域或其变体含有SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:227所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:226或SEQID NO:227至少85％序列同一性的氨基酸序列。

实施方式91。在实施方式86至90中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白通过接头间接地连接。

实施方式92。在实施方式86至91中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是二聚体。

实施方式93。在实施方式49至92中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有一个或多个其它非免疫球蛋白IgSF结构域，其是与第一或第二非免疫球蛋白修饰的IgSF结构域相同的或不同的。

实施方式94。在实施方式93的其它一些实施方式中，一个或多个其它非免疫球蛋白IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。

实施方式95。在实施方式49至94中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白附着于脂质体膜。

实施方式96。在一些实施方式中，提供了核酸分子，其编码实施方式1至95 中任一项的免疫调节多肽。

实施方式97。在实施方式96的其它一些实施方式中，核酸是合成的核酸。

实施方式98。在实施方式96或实施方式97的其它一些实施方式中，核酸是cDNA。

实施方式99。在一些实施方式中，提供了载体，其含有实施方式96至98中任一项的核酸分子。

实施方式100。在实施方式99的其它一些实施方式中，载体是表达载体。

实施方式101。在一些实施方式中，提供了细胞，其含有实施方式99或实施方式100中任一项的载体。

实施方式102。在实施方式101的其它一些实施方式中，细胞是真核细胞或原核细胞。

实施方式103。在一些实施方式中，提供了生产免疫调节蛋白的方法，其包括将实施方式96至98中任一项的核酸分子或实施方式99或实施方式100中的载体在细胞内表达蛋白质的条件下引入宿主细胞。

实施方式104。在实施方式103的其它一些实施方式中，方法还包括从细胞分离或纯化免疫调节蛋白。

实施方式105。在一些实施方式中，提供了药物组合物，其含有实施方式1 至95中任一项的免疫调节蛋白。

实施方式106。在实施方式105的其它一些的实施方式中，药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。

实施方式107。在实施方式105或实施方式106的其它一些实施方式中，药物组合物是无菌的。

实施方式108。在一些实施方式中，提供了制品，其含有在药瓶中的实施方式 105至107中任一项的药物组合。

实施方式109。在实施方式108的其它一些实施方式中，药瓶是密封的。

实施方式110。在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括实施方式105至 107中任一项的药物组合物，以及使用说明

实施方式111。在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括实施方式108或实施方式109的制品，以及使用说明

实施方式112。在一些实施方式中，提供了在对象中调整免疫应答的方法，其包括给予对象治疗有效量的实施方式1至95中任一项的免疫调节蛋白。

实施方式113。在实施方式112的其它一些实施方式中，调整免疫应答在对象中治疗疾病或病症。

实施方式114。在实施方式112或实施方式113的其它一些实施方式中，免疫应答是增强的。

实施方式115。在实施方式114的其它一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤或癌症。

实施方式116。在实施方式114或实施方式115的其它一些实施方式中，疾病或病症选自：黑素瘤、肺癌、膀胱癌或恶性血液肿瘤。

实施方式117。在实施方式112或实施方式113的其它一些实施方式中，免疫应答是减弱的。

实施方式118。在实施方式117的其它一些实施方式中，疾病或病症是炎性疾病或病症。

实施方式119。在实施方式117或实施方式118的其它一些实施方式中，疾病和病症选自：克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，多发性硬化症，哮喘，类风湿性关节炎或牛皮癣。

实施方式120。在一些实施方式中，提供了鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白的方法，其包括：a)将含有至少一个非免疫球蛋白修饰免疫球蛋白超家族(IgSF) 结构域或其特异性结合片段修饰的蛋白质与至少两个关联结合伴侣在能够令蛋白质与至少两个关联结合伴侣结合的条件下接触，其中至少一个修饰IgSF 结构域含有在野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代；b)鉴定相较于含有野生型IgSF结构域的蛋白质对两个关联结合伴侣中至少其一结合具有增强的含修饰的IgSF结构域的修饰的蛋白质；并且c)选择非竞争性地结合至少两个关联结合伴侣的含修饰IgSF结构域的修饰蛋白质，从而鉴定亲和力修饰的免疫调节蛋白。

实施方式121。在实施方式120的其它一些实施方式中，步骤b)包括鉴定相较于含有野生型结构域的蛋白质，对至少两个关联结合伴侣结合都增强的含修饰 IgSF结构域修饰蛋白质。

实施方式122。在实施方式120或实施方式121的其它一些实施方式中，先于步骤a)，在野生型IgSF结构域中引入一个或多个氨基酸取代，从而生成含有修饰IgSF结构域修饰的蛋白质。

实施方式123。在实施方式120至122中任一项的其它一些实施方式中，修饰蛋白质含有至少两个修饰IgSF结构域或其特异性结合片段，其中第一IgSF结构域含有在第一野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代，并且第二非免疫球蛋白亲和力修饰IgSF结构域含有在第二野生型IgSF结构域中的一个或多个氨基酸取代。

实施方式124。在实施方式123的其它一些实施方式中，第一和第二非免疫球蛋白亲和力修饰IgSF结构域各自特异性地结合至少一个不同的关联结合伴侣。

实施方式125。在一些实施方式中，提供了免疫调节蛋白，其含有至少一个非免疫球蛋亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其中亲和力修饰的IgSF 结构域特异性地非竞争性结合至少两种细胞表面分子，其中分子物质各自表达在形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中至少其一上，其中哺乳动物细胞中的一个是淋巴细胞，并且其中亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。

实施方式126。在实施方式125的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF 结构域特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

实施方式127。在实施方式125或实施方式126的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个非免疫球蛋白亲和力修饰的IgSF结构域，并且免疫调节蛋白特异性地结合形成IS的两个哺乳动物细胞。

实施方式128。在实施方式125至127中任一项的其它一些实施方式中，IgSF 细胞表面分子是人IgSF成员。

实施方式129。在实施方式125至128中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域含有至少一个亲和力修饰的人CD80结构域。

实施方式130。在实施方式125至129中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白含有亲和力修饰的哺乳动物IgSF成员。

实施方式131。在实施方式125至130中任一项的其它一些实施方式中，亲和力的修饰哺乳动物IgSF成员是CD80、PVR、ICOSLG或HAVCR2中的至少一种。

实施方式132。在实施方式125至131中任一项的其它一些实施方式中，免疫活性被增强。

实施方式133。在实施方式125至132中任一项的其它一些实施方式中，免疫活性被抑制。

实施方式134。在实施方式125至133的任一项的其它一些实施方式中，两个哺乳动物细胞中的一个是肿瘤细胞。

实施方式135。在实施方式125至134的任一项的其它一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。

实施方式136。在实施方式125至135中其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、食蟹猴或人细胞。

实施方式137。在实施方式125至136中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域具有野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的10％和90％之间。

实施方式138。在实施方式125至137中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域特异性地非竞争性结合正好一个IgSF成员。

实施方式139。在实施方式125至138中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的至少120％

实施方式140。在实施方式125至139中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域是亲和力修饰的IgV、IgC1或IgC2结构域。

实施方式141。在实施方式125至140中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域与其野生型IgSF结构域的区别在至少1个并且不超过10个氨基酸取代。

实施方式142。在实施方式125至141中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域与其野生型IgSF结构域的区别在至少1个并且不超过5个氨基酸取代。

实施方式143。在实施方式125至142中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是人CD80 IgSF结构域。

实施方式144。在实施方式125至143中其它一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的IgSF结构域，其中亲和力修饰的IgSF结构域与IgSF 结构域不是同种的。

实施方式145。在实施方式125至144中其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是与抗体可结晶片段(Fc)直接或间接共价结合的。

实施方式146。在实施方式125至145中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是药物学上可接受的运载体。

实施方式147。在实施方式125至146中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

实施方式148。在实施方式125至147中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。

实施方式149。在实施方式125至148中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白附着于脂质体膜。

实施方式150。在实施方式125至149中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白通过分子间二硫键二聚化。

实施方式151。在实施方式125至150中任一项的其它一些实施方式中，细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。

实施方式152。在一些实施方式中，提供了免疫调节蛋白，其含有至少两个非免疫球蛋亲和力修饰的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其中亲和力修饰的IgSF 结构域各自特异性地结合不同细胞表面分子，其中各分子物质各自表达在形成免疫突触(IS)的两个哺乳动物细胞中至少其一上，其中哺乳动物细胞中的一个是淋巴细胞，并且其中亲和力修饰的IgSF结构域的结合调整淋巴细胞的免疫活性。

实施方式153。在实施方式125至152中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个竞争性地结合。

实施方式154。在实施方式125至153中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域与IgSF结构域不是同种的。

实施方式155。在实施方式125至154中任一项的其它一些实施方式中，亲和力修饰的IgSF结构域是非野生型组合。

实施方式156。在实施方式125至155中任一项的其它一些实施方式中，细胞表面分子是人IgSF成员。

实施方式157。在实施方式125至156中任一项的其它一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的IgSF结构域是来自如下至少一种：CD80、CD86、CD274、 PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA 、CD4、CD8A、CD8B、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2 、CD226、CD2、CD160、CD200、NKp30或CD200R1。

实施方式158。在实施方式125至157中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白含有至少两个亲和力修饰的哺乳动物IgSF成员。

实施方式159。在实施方式125至158中任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物IgSF成员是人IgSF成员。

实施方式160。在实施方式125至159中任一项的其它一些实施方式中，哺乳动物IgSF成员是如下至少两种：CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B 、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160 、CD200、NKp30或CD200R1。

实施方式161。在实施方式125至160中任一项的其它一些实施方式中，免疫活性被增强。

实施方式38。在实施方式125至1中任一项的其它一些实施方式中，免疫活性被抑制。

实施方式162。在实施方式125至161的任一项的其它一些实施方式中，两个哺乳动物细胞中的一个是肿瘤细胞。

实施方式163。在实施方式125至162的任一项的其它一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞或T细胞。

实施方式164。在实施方式125至163中其它一些实施方式中，哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、食蟹猴或人细胞。

实施方式165。在实施方式125至164中任一项的其它一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中至少其一具有的结合亲和力是野生型IgSF结构域与细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的10％和90％。

实施方式166。在实施方式125至165中任一项的其它一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个特异性地结合正好一个细胞表面分子。

实施方式167。在实施方式125至166中任一项的其它一些实施方式中，两个亲和力修饰的IgSF结构域中的至少一个所具有的结合亲和力是其野生型IgSF结构域与两种细胞表面分子中的至少一种的结合亲和力的至少120％。

实施方式168。在实施方式125至167中其它一些实施方式中，亲和力修饰的 IgSF结构域是IgV、IgC1或IgC2结构域中的至少一种。

实施方式169。在实施方式125至168中任一项的其它一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的IgSF结构域的每一个与其野生型IgSF结构域的区别在至少1个并且不超过10个氨基酸取代。

实施方式170。在实施方式125至169中任一项的其它一些实施方式中，至少两个亲和力修饰的IgSF结构域的每一个与其野生型IgSF结构域的区别在至少1个并且不超过5个氨基酸取代。

实施方式171。在实施方式125至170中其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是与抗体可结晶片段(Fc)直接或间接共价结合的。

实施方式172。在实施方式125至171中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是药物学上可接受的运载体。

实施方式173。在实施方式125至172中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是糖基化的或PEG化的。

实施方式174。在实施方式125至173中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白是可溶的。

实施方式175。在实施方式125至174中任一项的其它一些实施方式中，蛋白质附着于脂质体膜。

实施方式176。在实施方式125至175中任一项的其它一些实施方式中，蛋白质通过分子间二硫键二聚化。

实施方式177。在实施方式125至176中任一项的其它一些实施方式中，细胞表面分子以顺式构型或反式构型表达。

实施方式178。在实施方式125至177中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列、组合或其片段至少85％的序列同一性。

实施方式179。在实施方式125至178中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列、组合或其片段至少90％的序列同一性。

实施方式180。在实施方式125至179中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列、组合或其片段至少95％的序列同一性。

实施方式181。在实施方式125至180中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列、组合或其片段至少99％的序列同一性。

实施方式182。在实施方式125至181中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二免疫调节蛋白，其中第二免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO: 1-26的氨基酸序列或其片段至少85％的序列同一性。

实施方式183。在实施方式125至182中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二免疫调节蛋白，其中第二免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO: 1-26的氨基酸序列或其片段至少90％的序列同一性。

实施方式184。在实施方式125至183中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二免疫调节蛋白，其中第二免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO: 1-26的氨基酸序列或其片段至少95％的序列同一性。

实施方式185。在实施方式125至184中任一项的其它一些实施方式中，免疫调节蛋白还含有第二免疫调节蛋白，其中第二免疫调节蛋白具有与选自SEQ ID NO: 1-26的氨基酸序列或其片段至少99％的序列同一性。

实施方式186。在一些实施方式中，提供了重组核酸，其编码实施方式125 至185中任一项的免疫调节蛋白。

实施方式187。在一些实施方式中，提供了重组表达载体，其含有实施方式 186的核酸。

实施方式188。在一些实施方式中，提供了重组宿主细胞，其含有实施方式 187的表达杂体。

实施方式189。在一些实施方式中，提供了制造实施方式125至185中任一项的免疫调节蛋白的方法，其包括在免疫调节蛋白表达条件下培养重组宿主细胞，表达由本文所述重组表达载体编码的免疫调节蛋白，和纯化因此表达的重组免疫调节蛋白。

实施方式190。在一些实施方式中，提供了治疗需要增强的或抑制的免疫应答的哺乳动物患者的方法，通过给予治疗有效量的实施方式125至185中任一项的免疫调节蛋白。

实施方式191。在实施方式190的其它一些实施方式中，增强的免疫应答治疗患者的黑素瘤、肺癌、膀胱癌或恶性血液肿瘤。

实施方式192。在实施方式190的其它一些实施方式中，抑制的免疫应答治疗患者的克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，多发性硬化症，哮喘，类风湿性关节炎或牛皮癣。

VIII.实施例

下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。

实施例1至8描述了亲和力修饰的CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、ICOSL和NKp30 免疫调节蛋白的设计、产生和筛选，其是在免疫活化和抑制中表现出双重作用的免疫突触(IS)的成分。这些实施例表明，IgSF结构域的亲和力修饰产出可以增加和减少免疫活动的蛋白质。该工作还描述了为了实现免疫调节活性，这些成对融合 (即，堆叠的)形成II型免疫调节蛋白的结构域的各种组合。

实施例1

IgSF结构域的突变DNA构建体的生成

实施例1描述了用于在酵母表面翻译和表达的人CD80、CD86、ICOSL和 NKp30 IgSF结构域的突变DNA构建体作为酵母展示文库的生成。

A.简并文库

对于靶向靶标蛋白的特定残基以简并密码子完全或部分随机化的文库，人 CD80(SEQ ID NO:28)、ICOSL(SEQ ID NO:32)和NKp30(SEQ ID NO:54)细胞外结构域(ECD)的编码DNA以上至80个碱基对(bp)长度的重叠寡核苷酸的集合定购自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(美国爱荷华州克拉威尔)。为了生成各ECD的多种变体的文库，寡核苷酸在需要的氨基酸位置包含所需的简并密码子。简并密码子是使用位于URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/的算法生成的。

通常，突变的位置和简并密码子按如下选择：使用感兴趣的靶标-配体对的结晶结构(CD80、NKp30)或同源建模(ICOSL)鉴定配体接触残基以及在蛋白质相互作用界面的残基。该分析使用在URL:spdbv.vital-it.ch)可得的结构观察器 (structure viewer)进行。例如，CD80结合CTLA4的结晶结构在 URL：www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1I8L)为公众所得的，并且根据CD80::CTLA4界面设计靶向文库，用于选择对CTLA4改善的结合物。然而，与配体CD28和PDL1的CD80结构并不可得，所以也使用相同的文库进行CD28 (在CD80上结合与CTLA4相同的区域)和PDL1(并不知PDL1是否结合与CTLA4 相同的位点)的结合物的选择。

文库设计中的下一步是人、小鼠、大鼠和猴CD80、ICOSL或NKp序列的比对，从而鉴定保守残基。根据这一分析，用仅指定保守氨基酸变化加野生型残基的简并密码子突变保守的靶标残基。不是保守的残基被更加多的突变，但也包括野生型残基。部署同样编码野生型残基的简并密码子以避免靶标蛋白的过度突变。由于同样的理由，一次仅对上至20个位置靶向突变。这些残基是接触残基和非接触界面残基的组合。

将寡核苷酸在无菌水中溶解，以等摩尔比混合，加热至95℃，5分钟，然后缓慢的冷却至室温以退火。分别退火至ECD起始和终末的ECD特异性寡核苷酸引物被用于生成PCR产物。然后用与超过和包括BamH1和Kpn1克隆位点 pBYDS03克隆载体的修饰型(生命技术公司(Life Technologies)美国)有40至 50bp重叠的ECD特异性寡核苷酸扩增之前步骤生成的100ng PCR产物，产生总计 5g的DNA。使用OneTaq 2x PCR主混合物(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，美国)通过聚合酶链式反应(PCR)进行两个PCR。第二PCR产物使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，德国)进行纯化并在无菌去离子水中重悬。

为了准备文库插入，用BamH1和Kpn1限制性内切酶(新英格兰生物实验室，美国)对载体pBYDS03的修饰的酵母展示型进行消化，并且将大的载体片段凝胶纯化并溶解在无菌的去离子水中。通过在总体积为50μl的去离子的和无菌的水中混合12μg的文库DNA与4μg的线性化载体，生成用于下一步的电穿孔即用型(Electroporation-ready)DNA。生成靶向文库的另一种方式是用含有简并密码子的寡核苷酸进行靶标ECD的定点诱变(多位点试剂盒，安捷伦公司(Agilent)，美国)。这种方法被用来生成只靶向靶标蛋白的特定拉伸进行诱变的亚文库。在这些情况下，在进行选择步骤之前，亚文库是混合的。通常，文库大小在10E7到10E8 克隆的范围内，除了亚文库仅在10E4到10E5的范围内。为CD80、ICOSL、CD86 和NKp30生成大文库。为CD80、ICOSL和NKp30生成亚文库。

B.随机文库

同样构建随机文库以鉴定CD80(SEQ ID NO:28)、CD86(SEQ ID NO:29) 、ICOSL(SEQ ID NO:32)和NKp30(SEQ ID NO:54)的ECD的变体。将编码野生型ECD的DNA克隆到修饰的酵母展示载体pBYDS03的BamH1和Kpn1位点之间，并且其后使用相同的限制性内切酶释放。然后使用Genemorph II试剂盒(安捷伦，美国)对释放的DNA进行诱变，从而生成每个文库变体平均3到5个氨基酸变化。然后，通过两步PCR扩增诱变的DNA，并如上所述对靶向的文库进行进一步处理。

实施例2

DNA文库引入酵母

实施例2描述了将CD80、CD86、ICOSL、和NKp30 DNA文库引入酵母。

为了将简并和随机文库DNA引入酵母，制备了酵母菌株BJ5464(ATCC.org； ATCC号208288)的电穿孔感受态细胞，并且在Gene Pulser II(伯乐公司 (BioRad)，美国)上基本如所述使用来自上述步骤的电穿孔即用型DNA进行电穿孔(Colby,D.W.等，2004MethodsEnzymology 388,348-358)。唯一的例外是转化的细胞是在非诱导最小选择性SCD-Leu培养基中生长，以适应由修饰的质粒 pBYDS03携带的LEU2选择性标志物。

文库大小的确定是通过将新鲜回收的细胞的稀释物在SCD-Leu琼脂平板上铺板，然后从来自每板生成至少50个菌落的铺板的单个菌落的数量推断文库大小。电穿孔培养物的剩余部分生长至饱和，然后将来自该培养物的细胞继代培养到相同的培养基中，再次使未转化的细胞的部分最小化。为了保持文库多样性，使用含有比计算的文库大小多至少10倍的细胞的接种物进行该继代培养。将来自第二饱和培养物的细胞在含有25％(重量/体积)无菌甘油的新鲜培养基中重悬至10E10/ml 的密度，并将其冷冻并保存在-80℃(冷冻的文库原液)。

1升的SCD-Leu培养基由14.7克的柠檬酸钠、4.29克的柠檬酸一水合物、20 克的葡萄糖、6.7克Difco牌酵母氮基和1.6克不含亮氨酸的酵母合成出料(drop-out) 培养基补充物组成。在培养基使用前使用0.2M真空过滤装置进行灭菌过滤。

文库大小的确定是通过将新鲜回收的细胞的稀释物在SCD-Leu琼脂平板上铺板，然后从来自每板生成至少50个菌落的铺板的单个菌落的数量推断文库大小。

为了从含有两个或多个不同的文库克隆的细胞分离质粒，将对应于文库大小 10倍数量的细胞从过夜SCD-Leu培养物中取出，并将1/100继代培养到新鲜的 SCD-Leu，然后过夜培养。将来自该过夜培养物的细胞在25％(重量/体积)无菌甘油中重悬至10E10/ml的密度，并将其冷冻并保存在-80℃(冷冻的文库原液) 。

实施例3

酵母选择

实施例3描述了表达CD80、CD86、ICOSL和NKp30的亲和力修饰的变体的酵母的选择。

将等于至少文库大小10倍数量的细胞从独立的文库原液中解冻，在非诱导 SCD-Leu培养基中重悬至0.1x 10E6细胞/ml，然后过夜生长。第二天，等于文库大小10倍数量的细胞以2000RPM进行2分钟的离心，然后在诱导SCDG-Leu培养基中重悬至0.5x 10E6细胞/ml。1升SCDG-Leu诱导培养基由溶解在水中的 5.4克的Na

用磁珠处理细胞以减少非结合物，并且富集所有具有结合其外源性重组反结构(counter-structure)蛋白能力的CD80、CD86、ICOSL或NKp30变体。例如，针对CD28、CTL-4、PD-L1、ICOS和B7-H6各自分别选择表现出靶向或随机CD80 文库的酵母。这其后使用外源性反接头蛋白染色进行2至3轮流式细胞术分选以富集酵母细胞表现出改善的结合体的部分。磁珠富集和通过流式细胞术的筛选本质上如Keith D.Miller,1Noah B.Pefaur,2和CherylL.Baird1细胞计数实验指南 (Current Protocols in Cytometry)4.7.1-4.7.30,七月2008中所述。

拥有了CD80、CD86、ICOSL和NKp30文库，靶标配体蛋白来源于R&D系统公司(R&DSystems)(美国)，其如下：人rCD28.Fc(即，重组CD28-Fc融合蛋白)、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc、rICOS.Fc和rB7H6.Fc。链霉亲和素磁珠获得自美国新英格兰生物实验室公司。对于反结构蛋白的生物素化，使用美国生命技术公司目录号21955的生物素化试剂盒。对于双色、流式细胞术分选，使用BD公司 (Becton Dickinson)的FACS Aria II分选器。CD80、CD86、ICOSL或NKp30表现水平使用用Alexafluor 488(生命技术公司，美国)标记的抗血球凝集素进行监测。配体结合Fc融合蛋白rCD28.Fc、rCTLA4.Fc、rPDL1.Fc、rICOS.Fc或rB7-H6.Fc 使用与人Ig特异性山羊Fab(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，美国)偶联的PE进行检测。使用正向散射(FSC)/侧向散(SSC)参数分选出双峰酵母，并且分选门控是基于在FL4中检测到的更高的配体结合，其在FL1中具有更有限的标签表达结合。

对由流式细胞术分选中输出的酵母进行较高特异性结合亲和力的分析。对分选输出的酵母进行扩增和再诱导以表达其编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。其后可以通过流式细胞术将该群与亲本、野生型酵母菌株或任何其它选择的输出(如，珠粒输出酵母群)进行比较。

对于ICOSL，通过用抗-HA(血球凝集素)标签表达和抗-人Fc二级对各群进行双染色，比较第二分选输出(F2)与亲本ICOSL酵母对于rICOS.Fc、rCD28.Fc 和rCTLA4.Fc各自的结合，以检测配体结合。

在为结合ICOS选择的ICOSL酵母变体的情况中，F2分选输出的平均荧光强度(MFI)值当用5.6nM rICOS.Fc染色时是997，然而当用同样浓度的rICOS.Fc 染色时，亲本ICOSL菌株MFI经测量是397。这表示在这个F2选择的克隆集中对平均结合大约三倍的改善，并且预测来自该集中的单个克隆当在单独测试时，将具有好得多的改善的MFI/亲和力。

在为结合CD28选择的ICOSL酵母变体的情况中，F2分选输出的MFI值当用 100nMrCD28.Fc染色时是640，然而当用同样浓度的rCD28.Fc染色时，亲本ICOSL 菌株MFI经测量是29(22倍的改善)。在为结合CTLA4选择的ICOSL酵母变体的情况中，F2分选输出的MFI值当用100nM rCTLA4.Fc染色时是949，然而当用同样浓度的rCTLA4.Fc染色时，亲本ICOSL菌株MFI经测量是29(32倍的改善) 。

在为结合B7-H6选择的NKp30酵母变体的情况中，F2分选输出的MFI值当用16.6nMrB7H6.Fc染色时是533，然而当用同样浓度的rB7H6.Fc染色时，亲本 NKp30菌株MFI经测量是90(6倍的改善)。

重要地是，上述所有F2输出的MFI相较于野生型菌株，当用抗-HA抗体在 FL1测量时并没有升高并且有些时候是下降的，这表明增加的结合不是酵母表面上所选变体表达增加的功能，并且验证了仅选择具有高配体结合的中至低表达子的门选策略。

实施例4

在多种免疫调节蛋白类型中将选择输出重建为Fc-融合体

实施例4描述了将选择输出重建为融合Fc分子(变体ECD-Fc融合体分子) 的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有CD80或ICOSL的亲和力修饰的(变体) 细胞外结构域(ECD)。

来自最终流式细胞术CD80和ICOSL分选的输出细胞在SCD-Leu培养基中生长至末端浓度。各输出的质粒DNA使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymoresearch 公司，美国)分离。对于Fc融合体，使用具有添加的适合克隆到所选Fc融合体的载体限制性位点的PCR引物由质粒DNA制备物批量扩增突变的靶标ECD的编码DNA。限制性消化后，将PCR产物连接到适当的Fc融合体载体，其后根据供应商指导化学转化至菌株XL1蓝大肠杆菌(安捷伦公司，美国)或NEB5α(新英格兰生物实验室公司)。示例性的Fc融合体载体是pFUSE-hIgG1-Fc2(英杰公司(Invivogen))。

将转化反应的稀释物接种在含有100μg/ml羧苄青霉素(天惠华公司 (Teknova)，美国)的LB-琼脂的平板以生成单一集落。然后来自各转化的上至 96个集落在96孔板中在LB肉汤(Teknova，目录号L8112)中以37C过夜生长至饱和，并且为了鉴定所有克隆中的突变，将各孔的小等份进行ECD插入的DNA 测序。DNA测序的样品准备使用服务提供商(Genewiz；南普莱恩菲尔德，美国新泽西州)提供的方案进行。在将用于DNA测序的样品移出之后，向剩余的培养物中添加甘油至25％的最终甘油含量，并且将平板在-20℃储存用于日后以主平板使用(见下文)。或者，使用一次性96孔复制器(VWR公司，美国)通过从生长的液体培养物复制板面至固体琼脂板生成DNA测序的样品。将这些平板过夜孵育以生成生长斑，并按照Genewiz的规定将斑点提交Genewiz。

在从Genewiz生成的DNA测序数据的分析中鉴定出感兴趣的克隆之后，从主平板回收感兴趣的克隆并独立地在含有100μg/ml羧苄青霉素(天惠华公司，美国) 的5ml液体LB-肉汤中生长至密度，并且然后使用2ml的各孔培养物，使用标准试剂盒(如Pureyield试剂盒(普洛麦格公司(Promega))制备各克隆约10g 小规模质粒DNA。感兴趣的克隆的鉴定通常涉及以下步骤。首先，DNA序列数据文件下载自Genewiz网址。然后对所有序列进行手动标记，这样它们在ECD编码区的开头开始。然后使用在URL：

然后使用如下标准对感兴趣的克隆进行鉴定：1)相同的克隆在比对中至少出现两次，并且2)突变在比对中至少出现两次，并且优选在不同克隆中。将满足这些标准中至少一个标准的克隆是由于改善的结合通过我们的分选步骤已经被富集的克隆。

为了生成含有CD80或ICOSL的ECD并且具有至少一个亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白，生成编码核酸分子以编码设计成如下的蛋白质：信号肽，其后是变体(突变体)ECD，其后是3个丙氨酸(AAA)的接头，其后是含有突变N82G 的人IgG1 Fc，其参照在SEQ IDNO:226中所示的野生型人IgG1 Fc。由于构建体不包括可以与半胱氨酸形成共价键的任何抗体轻链，人IgG1 Fc相对于SEQ ID NO: 226中所示的野生型或未修饰的Fc还包含半胱氨酸残基在位置5(C5S)对丝氨酸残基的取代。

此外，下述实施例8描述了其它以堆叠结构生成的含有至少两个不同的亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白，所述亲和力修饰的结构域来自经鉴定连接在一起并与Fc融合的变体CD80、CD86、ICOSL和NKp30分子。

实施例5

Fc-融合体的表达和纯化

实施例5描述了包含ECD CD80、CD86、ICOSL和NKp30的Fc融合体的高通量表达和纯化。

重组变体Fc融合蛋白使用Expi293表达系统(英杰公司(Invitrogen)，美国) 生产。将来自之前步骤的4μg的各质粒DNA加入200μl的Opti-MEM(英杰公司，美国)，同时将10.8μl的ExpiFectamine单独地加入另一200μl的Opti-MEM。5 分钟后，将200μl的质粒DNA与200μl的ExpiFectamine混合并在将该混合物加入细胞之前进一步孵育额外的20分钟。将1000万个Expi293细胞分散到无菌的、10ml 、锥形底、深24孔生长板的单独的孔中(汤姆森仪器公司(Thomson Instrument Company)，美国)，于3.4ml的Expi293培养基容量(英杰公司，美国)。平板在设置为95％湿度和8％CO

使用高通量96孔蛋白质A纯化试剂盒按照生产商方案从上清液纯化蛋白质 (目录号45202，生命技术公司，美国)。使用Zeba 96孔自旋脱盐板(目录号89807，生命技术公司，美国)按照生产商方案将获得的洗脱分级分离物缓冲液交换到PBS 中。通过Nanodrop仪器(热科学公司(Thermo Fisher Scientific)，美国)测量，使用280nm吸光度对纯化的蛋白质进行定量，并且通过在变性和还原条件下在 NUPAGE预制聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司，美国)上加载5g的蛋白质，然后进行凝胶电泳来评估蛋白质纯度。使用标准考玛斯染色在凝胶中显示蛋白质。

实施例6

亲和力成熟的含有IgSF结构域的分子结合和活性的评估

A.结合表达细胞的相对结构

本实施例描述了Fc融合体结合的研究，以显示CD80和ICOSL结构域变体免疫调节蛋白对于关联结合伴侣的特异性和亲和力。

为了生产表达关联结合伴侣的细胞，在pcDNA3.1表达载体(生命技术公司) 中设计针对人CD28、CTLA4、PD-L1、ICOS和B7-H6各自的全长哺乳动物表面表达构建体，并且其来源于美国金斯瑞公司(Genscript)。使用上述Expi293F瞬时转染系统(生命技术公司，美国)进行结合研究。使用制造商建议的方案，确定实验所需的细胞数量并且进行适当的30ml规模的转染。对于每个CD28、CTLA4 、PD-L1、ICOS、B7-H6或空白的30ml转染，7500万个Expi293F细胞与30μg 表达构建体DNA和1.5ml稀释的ExpiFectamine 293试剂孵育48小时，此时收获细胞进行染色。

对于通过流式细胞术染色，将200,000个细胞的适当的瞬时转染或阴性对照上样至96空圆底平板。将细胞离心并在染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％ BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)内进行20分钟的重悬以封闭非特异性结合。其后，对细胞再次进行离心，并在含有100nM至1nM变体免疫调节蛋白的染色缓冲液中重悬，取决于在50l中候选物CD80变体Fc、ICOSL变体Fc或堆叠的IgSF变体Fc融合蛋白的实验。在用染色缓冲洗涤细胞两次之前，在冰上进行 45分钟的初代染色(Primary staining)。将PE-偶联的抗-人Fc(杰克逊免疫研究公司，美国)在50μl染色缓冲液中1：150稀释，并且将其加入细胞，然后在冰上在进行另外30分钟的孵育。洗出二抗两次，将细胞固定在4％甲醛/PBS中，在 FACScan流式细胞仪(BD公司，美国)上分析样品。

用细胞搜索软件(Cell Quest Pro Software)(BD公司，美国)计算各转染子和阴性亲本系的平均荧光强度(MFI)。

B.生物活性表征

本实施例进一步描述了在人原代T细胞体外试验中Fc融合变体蛋白生物活性表征。

1.混合的淋巴细胞反应(MLR)

可溶性rICOSL.Fc或rCD80.Fc的生物活性在人混合的淋巴细胞反应(MLR) 中进行测试。通过用500U/ml的rIL-4(R&D系统公司，USA)和250U/ml的rGM-CSF (R&D系统公司，USA)在Ex-Vivo 15培养基(隆萨公司(Lonza)，瑞士)中对从PBMC(BenTech Bio公司，美国)分离的单核细胞进行7天的体外培养，生产人原代树突状细胞(DC)。将10,000个成熟的DC和100,000个纯化的同种异体CD4+ T细胞(BenTech Bio公司，美国)与ICOSL或CD80变体Fc融合蛋白和对照在96孔圆底平板上在200μl最终体积的Ex-Vivo 15培养基中共培养。在第 5天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D系统公司，美国)分析培养物上清液中的IFN-γ分泌。通过Vmax ELISA微孔板检测仪(分子设备公司 (Molecular Devices)，美国)测量光密度，并且针对包含在IFN-γDuo-set试剂盒(R&D系统公司，美国)中的滴定的rIFN-γ标准进行定量。

2.抗-CD3共固化试验

在抗-CD3共固化试验中确定ICOSL和CD80 Fc融合体变体的共刺激生物活性。1nM或4nM小鼠抗-人CD3(OKT3，拜来及公司(Biolegend)，美国)在含1nM至80nM的rICOSL.Fc或rCD80.Fc变体蛋白的PBS中进行稀释。将该混合物加入组织培养液处理的平底96孔(康宁公司(Corning)，美国)过夜以促进刺激性蛋白质粘附到平板的孔中。次日，从平板洗脱未结合的蛋白质，并将100,000个纯化的人全T细胞(BenTech Bio公司，美国)和人T细胞克隆BC3(Astarte生物制剂公司(Astarte Biologics)，美国)加入各孔以200μl最终容积的Ex-Vivo15 培养基(隆萨公司，瑞士)。在收获培养物上清液以及如上所述使用Duoset ELISA 试剂盒(R&D系统公司，美国)测量人IFN-γ水平之前培养细胞3天

C.结论

示例性测试的变体的结合和活性研究结论在表6至8中示出。具体地，表6 表示在CD80的ECD中的示例性IgSF结构域氨基酸取代(替换)，其选自对各自关联结构CD28的亲和力成熟的筛选中。表7表示在CD80的ECD中的示例性IgSF 结构域氨基酸取代(替换)，其选自对各自关联结构PD-L1的亲和力成熟的筛选中。表8表示在ICOSL的ECD中的示例性IgSF结构域氨基酸取代(替换)，其选自对各自关联结构ICOS和CD28的亲和力成熟的筛选中。对于各表格，示例性的氨基酸取代通过对应于如下各自参考未修饰的ECD序列的氨基酸位置编号进行命名。例如，在表6和7中的参考未修饰的ECD序列是SEQ ID NO:28中所示的未修饰的CD80 ECD序列，而表8中的参考未修饰的ECD序列是未修饰的ICOSL ECD序列(SEQ ID NO:32)。氨基酸位置在中间表示，对应的未修饰(例如，野生型)氨基酸在编号之前列出，鉴定的变体氨基酸取代在编号之后列出。列2示出针对各变体ECD-Fc融合体分子的变体ECD的SEQID NO标识。

同样显示的是通过各变体Fc融合体分子与细胞结合的平均荧光强度(MFI) 值测量的结合活性，其中所述细胞经工程改造以表达关联相对结构配体，以及MFI 与结合比较的比值，所述结合是对应的未包含氨基酸取代的未修饰的ECD-Fc融合体分子与相同细胞表达的相对结构配体的结合。根据在培养物上清液中通过i)用所示变体ECD-Fc融合体分子与抗-CD3共固化，或ii)用所示变体ECD-Fc融合体分子在MLR试验中生成的IFN-γ的计算水平(pg/ml)，显示了变体Fc融合体分子对于调整T细胞活性的功能性活性。该表格还描述了在两个功能性试验中，由各变体ECD-Fc产生IFN-γ相较于对应的未修饰的ECD-Fc的比值。

如所示，选择导致亲和力修饰以表现出对至少一个，以及在一些情况下超过一个关联对应结构配体的增加的结合的许多CD80或ICOSL IgSF结构域变体的鉴定。此外，该结果显示变体分子的亲和力修饰还表现出改善的活性，取决于分子的形式，增强或减弱免疫活性。例如，相较于不包含氨基酸替换的未修饰的(例如，野生型)ECD-Fc分子，配体的共固化可能提供与细胞多价的相互作用以聚集或增强亲合力，从而促进激动剂活性并增强T细胞活化。然而，当分子在溶液中以二价Fc分子提供时，相较于不包含氨基酸替换的未修饰的(例如，野生型)ECD-Fv 分子，相同的IgSF结构域变体表现出拮抗活性以减弱T细胞活化。

*:亲本比例使用对WT ICOSL 346pg/ml的IFN-γ计算。

实施例7

配体结合竞争实验

如实施例6所示，多个CD80变体分子表现出对CD28和PD-L1中的一个或两者改善的结合。为了进一步评估CD80对配体CD28和PD-L1的结合活性，本实施例描述了评估示例性CD80变体结合CD28和PD-L1两者的非竞争性属性的配件竞争试验。

建立包括板结合的CD80变体A91G ECD-Fc的基于ELISA的结合试验以评估 CD80同时结合CD28和PD-L1的能力。用100nM人重组CD80变体A91G ECD-Fc 融合蛋白在PBS中过夜包被Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc公司，美国)。次日，洗去未结合的蛋白质，并且用1％牛血清白蛋白(密理博(Millipore)，美国)/PBS 在室温下封闭平板1小时。使用PBS/0.05％吐温洗去该封闭试剂3次，其中包括对于每次洗涤在振荡平台上进行2分钟孵育。

在竞争试验的一个方面，CD80与CD28孵育，然后在其它已知CD80配体相对结构PD-L1或CTLA-4或阴性对照配体PD-L2存在下进行结合CD28的CD80 的竞争性结合的评估。具体地，将生物素化的重组人CD28 Fc融合蛋白(rCD28.Fc； R&D系统公司)以10nM起始滴定到孔中，以25μl体积的1:2稀释液稀释8个点。在加入生物素化的rCD28.Fc后，立即将未标记的竞争性结合物、重组人PD-L1 单体his标签的蛋白、重组人类CTLA-4单体his标签的蛋白或阴性对照人重组 PD-L2 Fc融合蛋白(R&D系统公司)在25μl体积中分别以2000/1000/500nM加入到孔中，终体积为50μl。重复上述三次洗涤步骤之前，将这些蛋白质一起孵育1 小时。

洗涤后，2.5ng每孔的HRP偶联的链霉亲和素(杰克逊免疫研究公司，美国) 稀释在1％BSA/PBS，并且加入孔中以检测接合的生物素化的rCD28.Fc。1小时孵育后，如上所述再次洗涤孔3次。为了检测信号，在加入50ul 2M硫酸停止溶液之前，将50μl的TMB底物(皮尔斯公司(Pierce))加入孔中，其后洗涤并孵育7 分钟。光密度在Emax+酶标仪(分子设备公司，美国)上确定。光密度值在Prism (Graphpad公司，美国)中作图。

结果示于图1A。结果显示使用rCD28.Fc的滴定时，生物素化的rCD28.Fc对 CD80变体A91G ECD-Fc融合蛋白的结合减弱。当rCD28.Fc结合是在非竞争性对照蛋白——rPDL2存在下进行时，CD28对CD80的结合并没有减弱(实心三角形) 。相反，当竞争性对照蛋白——rCTLA-4与CD28.Fc孵育时，的确导致了CD28 对CD80的结合如预期的减弱(x线)。当重组PD-L与CD28.Fc孵育时，并未观察到CD28对CD80结合的减弱，这证明了CD28和PD-L1针对CD80的表位是非竞争性的。用于CD28竞争实验的重组PD-L1蛋白对CD80的结合通过将生物素化的PD-L1在非生物素化的rCD28.Fc存在下孵育证实(方块)。

同样建立反向竞争，其中CD80与PD-L1孵育，然后在其它已知CD80配体相对结构CD28或CTLA-4或阴性对照配体PD-L2存在下进行结合PD-L1的CD80 的竞争性结合的评估。具体地，该实验通过将生物素化的重组人PD-L1-his单体蛋白滴定到含有重组CD80变体的孔内进行。因为与该配体的结合较弱，以5000nM 开始对以相似的1：2稀释8个25μL点进行滴定。当使用rPD-L1-his检测结合时，将竞争性配体人rCD28.Fc、人rCTLA-4.Fc或人rPD-L2.Fc对照以在25μl中2.5nM 的最终浓度加入50μl的总体积。后续的洗涤、检测和OD测量如上所述。

结果示于图1B。滴定的PD-L1-his结合单独证实了结合至CD80变体A91G ECD-Fc融合体分子的PD-L1固化在平板上(方块)。当PD-L1-his结合是在非竞争性对照蛋白——rPDL2存在下进行时，PD-L1对CD80的结合并没有减弱(三角形)。当CD28竞争性对照蛋白——rCTLA-4与PD-L1-his孵育时，并未导致PD-L1 对CD80结合的减弱(x线)，即使CTLA-4对CD28具有竞争性。该结果进一步显示了CD28和PD-L1之间对于CD80结合缺少竞争。最终，当PD-L1-his与CD28.Fc 孵育时，并未观察到PD-L1对CD80结合的减弱，这证明了CD28和PD-L1针对 CD80的表位是非竞争性的。

因此，该结果表明CTLA-4，而非PD-L1或阴性对照PD-L2竞争CD28与CD80 的结合(图1A)，并且CD28、CTLA-4和PD-L2并不竞争PD-L1与CD80的结合(1B)。因此，这些结果表明CD28和PD-L1是CD80的非竞争性结合物，并且可以证明这一非竞争性结合与ELISA中正在检测哪种配体无关。

实施例8

包含不同亲和力修饰的结构域的堆叠的分子的生成和评估

经亲合力修饰一个或多个相对结构配体的上述选择的变体分子被用于生产包含两个或多个亲合力修饰的IgSF结构域的“堆叠”分子(即，II型免疫调节蛋白) 。堆叠结构以基因块(geneblock(爱荷华州克拉尔维尔的集成DNA技术公司)) 获得，其将堆叠编码成使其通过标准Bibason组装使用Bibson组装试剂盒(新英格兰生物实验室公司)融合到Fc的形式。

生成所有堆叠的编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：信号肽，紧随其后是感兴趣的第一变体IgV，紧随其后是15个氨基酸的接头，其由GGGGS(G4S)基序(SEQ ID NO:228)组成，紧随其后是感兴趣的第二IgV，紧随其后的是两个 GGGGS接头(SEQ ID NO:229)，紧随其后的是三个丙氨酸(AAA)，紧随其后的是如上所述人IgG1 Fc。为了使各堆叠中的IgV结构域正确折叠的机会最大化，第一IgV前是该IgV和信号肽(前导序列)之间一般出现在野生型蛋白质中的所有残基。相似地，第一IgV之后所跟随的是，通常在野生型蛋白质中将其连接到另一个Ig结构域(典型地是IgC结构域)或如果这样的第二IgV结构域缺失，将其连接到跨膜结构域(尾随序列)的所有残基。将同样的设计原则应用于第二IgV 结构域，除了当两个IgV结构域都是衍生自相同的亲本蛋白(例如，CD80 IgV与另一个CD80 IgV堆叠的)，两者之间的接头不是重复的。

表9列出示例性堆叠构建物的设计。表9中所示示例性堆叠分子包含如上所示的IgV结构域，以及其它如上所述的前导或尾随序列。在表中，如下成分以这样的顺序存在：信号肽(SP；SEQ ID NO:225)、IgV结构域1(IgV1)、尾随序列1(TS1)、接头1(LR1；SEQ ID NO:228)、IgV结构域2(IgV2)、尾随序列2(TS2)、接头2(LR2；EQ ID NO:230)和Fc结构域(包含C5S/N82G氨基酸取代的SEQ ID NO:226)。在一些情况中，前导序列1(LS1)存在于信号肽和IgV1之间，并且在一些情况中，前导序列2(LS2)存在于接头和IgV2之间。

如实施例5中所述，生成变体IgV堆叠的Fc融合体分子(variant IgV-stacked-Fcfusion molecule)的高通量表达和纯化，所述变体IgV堆叠的Fc融合体分子包含来自包含至少一个亲和力修饰的IgV结构域的CD80、CD86、ICOSL或Nkp30的变体IgV结构域的各种组合。如实施例6所述通过抗-CD3共固化试验评估变体IgV 堆叠的Fc融合体分子与各自的相对结构的结合和功能性活性，。例如，堆叠的IgSF Fc融合体蛋白的共刺激生物活性在与上述相似的固化的抗-CD3试验中确定。在该情况中，4nM的抗-CD3(OKT3，拜来及公司，美国)与4nM至120nM的人rB7-H6.Fc (R&D系统公司，美国)或人rPD-L1.Fc(R&D系统公司，美国)在组织培养处理的96孔板(康宁公司，美国)中共固化。次日，使用PBS洗脱未结合的蛋白质，并将100,000个纯化的全T细胞加入各孔于100μl的Ex-Vivo 15培养基(隆萨公司，瑞士)。随后将堆叠的IgSF结构域以8nM至40nM范围的浓度以100ul的容积加入200ul总容积。在收获培养物上清液以及如上所述使用Duoset ELISA试剂盒(R&D系统公司，美国)测量人IFN-γ水平之前培养细胞3天

结果示于表10至14中。具体的，表10列出包含NKp30 IgV结构域和ICOSL IgV结构域的变体IgV堆叠的Fc融合体分子的结合和功能性活性结果。表11列出包含NKp30 IgV结构域和CD80或CD86 IgV结构域的变体IgV堆叠的Fc融合体分子的结合和功能性活性结果。表12列出包含变体CD80 IgV结构域和CD80、 CD86或ICOSL IgV结构域的变体IgV堆叠的Fc融合体分子的结合和功能性活性结果。表13列出包含两个变体CD80 IgV结构域的变体IgV堆叠的Fc融合体分子的结合和功能性活性结果。表14列出包含变体CD80或CD86 IgV结构域和变体 ICOSL IgV结构域的变体IgV堆叠的Fc融合体分子的结果。

对于表11至14的中各表，列1表示堆叠的、亲和力修饰的或野生型(WT) 结构域的结构组织和取向，其以氨基酸(N端)结构域开始，其后是处于C末端人IgG1 Fc结构域之前的中间WT或亲和力修饰的结构域。列2列出包含在各自“堆叠”分子中的各IgV结构域序列的SEQ ID NO标识。列3显示列1中所表示的亲和力修饰的堆叠的结构域所选择针对的结合伴侣。

同样显示的是通过各堆叠分子与细胞结合的平均荧光强度(MFI)值测量的结合活性，其中所述细胞经工程改造以表达各种相对结构配体，以及MFI与结合比较的比值，所述结合是对应的含有未包含氨基酸取代的未修饰的堆叠分子与相同细胞表达的相对结构配体的结合。变体堆叠分子对于调整T细胞活性的功能性活性同样是基于在培养物上清液中IFN-γ的计算水平(pg/ml)显示的，其是通过用所示溶液中的变体堆叠分子以及与抗-CD3共固化的适当配体生成的，如实施例6中所述。该表格还描述了，在共固化试验中，由各变体堆叠分子产生的IFN-γ相较于对应的未修饰的堆叠分子的比值。

如所示，该结果表示可能生成包含至少一个变体IgSF结构域的堆叠分子，其相较于包含各自未修饰的(例如，野生型)IgV结构域的对应的堆叠分子，展现出对至少一个关联相对结构配体增强的结合的亲和力修饰的活性。在一些情况中，无论是来自分子中两种变体IgSF结构域的一个或组合的堆叠分子，其展现出对于超过一个关联相对结构配的增加的结合。该结果同样显示IgV结构域在堆叠分子中的顺序可以，在一些情况中，改变改善的结合活性的程度。在一些情况中，当在靶向的共固化试验中评估时，功能性T细胞活性同样改变。

虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和取代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。下列权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。

序列表

<110> 高山免疫科学股份有限公司(Alpine Immune Sciences, Inc.)

<120> 具有可调的亲和力的免疫调节蛋白

<130> 761612000140

<140> 未分配

<141> 同时附上

<150> 62/149,437

<151> 2015-04-17

<150> 62/218,534

<151> 2015-09-14

<160> 240

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD80(B7-1)

<400> 1

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86(B7-2)

<400> 2

Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe

20 25 30

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

35 40 45

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val

50 55 60

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

65 70 75 80

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

85 90 95

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

100 105 110

His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser

115 120 125

Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile

130 135 140

Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile

145 150 155 160

His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys

165 170 175

Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn

180 185 190

Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro

195 200 205

Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys

210 215 220

Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln

225 230 235 240

Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val

245 250 255

Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys

260 265 270

Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu

275 280 285

Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro

290 295 300

Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser

305 310 315 320

Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe

325

<210> 3

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD274 (PD-L1, B7-H1)

<400> 3

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 4

<211> 273

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> PDCD1LG2(PD-L2, CD273)

<400> 4

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile

20 25 30

Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser

35 40 45

His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp

85 90 95

Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr

100 105 110

Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr

115 120 125

His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln

130 135 140

Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val

145 150 155 160

Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

165 170 175

Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys

180 185 190

Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp

195 200 205

Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His

210 215 220

Ile Phe Ile Pro Phe Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val

225 230 235 240

Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

245 250 255

Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

260 265 270

Ile

<210> 5

<211> 302

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2)

<400> 5

Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp

20 25 30

Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn

35 40 45

Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr

50 55 60

Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr

65 70 75 80

Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe

85 90 95

Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His

100 105 110

Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val

115 120 125

Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser

130 135 140

Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser

145 150 155 160

Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp

165 170 175

Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn

180 185 190

Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr

195 200 205

Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln

210 215 220

Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp

225 230 235 240

Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

245 250 255

Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala

260 265 270

Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly

275 280 285

Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val

290 295 300

<210> 6

<211> 534

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD276(B7-H3)

<400> 6

Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln

20 25 30

Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu

35 40 45

Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn

50 55 60

Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala

65 70 75 80

Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe

85 90 95

Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val

100 105 110

Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp

115 120 125

Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys

130 135 140

Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val

165 170 175

Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr

180 185 190

Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu

195 200 205

Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn

210 215 220

Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln

225 230 235 240

Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val

245 250 255

Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro

260 265 270

Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr

275 280 285

Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly

290 295 300

Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln

305 310 315 320

Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly

325 330 335

Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val

340 345 350

Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu

355 360 365

Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser

370 375 380

Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu

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Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala

420 425 430

Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp

435 440 445

Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro

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Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu

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Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys

485 490 495

Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly

500 505 510

Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp

515 520 525

Asp Gly Gln Glu Ile Ala

530

<210> 7

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> VTCN1(B7-H4)

<400> 7

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser

20 25 30

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

50 55 60

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val

65 70 75 80

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met

85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

115 120 125

Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

180 185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met

195 200 205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val

225 230 235 240

Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu

260 265 270

Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys

275 280

<210> 8

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD28

<400> 8

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr

20 25 30

Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser

35 40 45

Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu

50 55 60

Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr

85 90 95

Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys

100 105 110

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

130 135 140

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

165 170 175

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

180 185 190

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

210 215 220

<210> 9

<211> 223

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CTLA4

<400> 9

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1 5 10 15

Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro

20 25 30

Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

115 120 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

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Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe

165 170 175

Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

<210> 10

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> PDCD1(PD-1)

<400> 10

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

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225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 11

<211> 199

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> ICOS

<400> 11

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys

1 5 10 15

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20 25 30

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65 70 75 80

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100 105 110

Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu

115 120 125

His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro

130 135 140

Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu

145 150 155 160

Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro

165 170 175

Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser

180 185 190

Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu

195

<210> 12

<211> 289

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> BTLA(CD272)

<400> 12

Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val

1 5 10 15

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Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile

35 40 45

Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala

50 55 60

Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val

65 70 75 80

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85 90 95

Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser

100 105 110

Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser

115 120 125

Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser

130 135 140

Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Pro

145 150 155 160

Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys

165 170 175

Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala

180 185 190

Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr

195 200 205

Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly

210 215 220

Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser

225 230 235 240

Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val

245 250 255

Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala

260 265 270

Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg

275 280 285

Ser

<210> 13

<211> 458

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD4

<400> 13

Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys

20 25 30

Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser

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Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn

50 55 60

Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala

65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile

85 90 95

Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu

100 105 110

Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn

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Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu

130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly

145 150 155 160

Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu

165 170 175

Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys

180 185 190

Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser

195 200 205

Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro

210 215 220

Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp

225 230 235 240

Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu

245 250 255

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu

260 265 270

Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu

275 280 285

Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys

290 295 300

Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr

305 310 315 320

Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro

325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser

340 345 350

Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp

355 360 365

Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile

370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile

385 390 395 400

Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile

405 410 415

Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met

420 425 430

Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro

435 440 445

His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile

450 455

<210> 14

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD8A(CD8-α)

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr

20 25 30

Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp

85 90 95

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100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe

115 120 125

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

195 200 205

Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser

210 215 220

Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

225 230 235

<210> 15

<211> 210

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD8B(CD8-β)

<400> 15

Met Arg Pro Arg Leu Trp Leu Leu Leu Ala Ala Gln Leu Thr Val Leu

1 5 10 15

His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln

20 25 30

Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser

35 40 45

Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp

50 55 60

Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile

65 70 75 80

His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala

85 90 95

Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly

100 105 110

Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys

115 120 125

Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro

130 135 140

Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro

145 150 155 160

Glu Thr Gln Lys Gly Pro Leu Cys Ser Pro Ile Thr Leu Gly Leu Leu

165 170 175

Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Val Ala Ile His

180 185 190

Leu Cys Cys Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Phe

195 200 205

Tyr Lys

210

<210> 16

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> LAG3

<400> 16

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520 525

<210> 17

<211> 301

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> HAVCR2(TIM-3)

<400> 17

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe

210 215 220

Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile

225 230 235 240

Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu

245 250 255

Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr

260 265 270

Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln

275 280 285

Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro

290 295 300

<210> 18

<211> 526

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CEACAM1

<400> 18

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515 520 525

<210> 19

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> TIGIT

<400> 19

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<210> 20

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> PVR(CD155)

<400> 20

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65 70 75 80

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195 200 205

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<210> 21

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> PVRL2(CD112)

<400> 21

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Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln

370 375 380

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<210> 22

<211> 336

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD226

<400> 22

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1 5 10 15

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

<210> 23

<211> 351

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD2

<400> 23

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1 5 10 15

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275 280 285

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<210> 24

<211> 180

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD160

<400> 24

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Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val

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180

<210> 25

<211> 278

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD200

<400> 25

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Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu

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275

<210> 26

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD200R1(CD200R)

<400> 26

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Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

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165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

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210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr

245 250 255

Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr

260 265 270

Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro Val Val Glu Glu Asp Glu Met

275 280 285

Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Asn Asn Pro Leu Tyr Asp Thr

290 295 300

Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Glu Ala Leu Gln Ser Glu Val Asp Thr

305 310 315 320

Asp Leu His Thr Leu

325

<210> 27

<211> 201

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> NC R3 (NKp30)

<400> 27

Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val His Pro Gly Ser

1 5 10 15

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Ser Ser Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu

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Glu Val Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu

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Asp Val Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val

100 105 110

Leu Gly Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu

115 120 125

Lys Glu His Pro Gln Leu Gly Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala

130 135 140

Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Ser Thr Val

145 150 155 160

Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg Gln Leu

165 170 175

Pro Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser Ser Ala

180 185 190

His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Gly

195 200

<210> 28

<211> 208

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD80(B7-1) ECD

<400> 28

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

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Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 29

<211> 224

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86(B7-2) ECD

<400> 29

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

20 25 30

Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser

50 55 60

Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys

65 70 75 80

Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly

85 90 95

Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

100 105 110

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val

115 120 125

Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys

130 135 140

Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp

145 150 155 160

Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

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Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile Pro

210 215 220

<210> 30

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD274 (PD-L1, B7-H1) ECD

<400> 30

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

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20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg

210 215 220

<210> 31

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> PDCD1LG2(PD-L2, CD273) ECD

<400> 31

Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly

1 5 10 15

Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn

20 25 30

Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser

35 40 45

Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly

50 55 60

Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln

65 70 75 80

Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu

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100 105 110

Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly

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Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn

130 135 140

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Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp

165 170 175

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180 185 190

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<211> 238

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 32

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Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

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65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

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Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

180 185 190

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu

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Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

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<211> 438

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD276(B7-H3) ECD

<400> 33

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20 25 30

Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val

35 40 45

His Ser Phe Ala Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg

50 55 60

Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg

65 70 75 80

Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val

85 90 95

Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala

100 105 110

Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg

115 120 125

Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro

130 135 140

Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly

145 150 155 160

Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val

165 170 175

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180 185 190

Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr

195 200 205

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210 215 220

Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys

225 230 235 240

Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile

245 250 255

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260 265 270

Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp

275 280 285

Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val

290 295 300

Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly

305 310 315 320

Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser

325 330 335

Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr

340 345 350

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Thr Phe Pro Pro Glu Ala

435

<210> 34

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 34

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65 70 75 80

Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val

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Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys

100 105 110

Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met

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Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys

130 135 140

Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln

145 150 155 160

Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu

165 170 175

Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn

180 185 190

Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala

195 200 205

Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg

210 215 220

Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser

225 230 235

<210> 35

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 35

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1 5 10 15

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Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

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50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

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Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro

130

<210> 36

<211> 126

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CTLA4 ECD

<400> 36

Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr

20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu

35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp

115 120 125

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<211> 150

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 37

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

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Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 38

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> ICOS ECD

<400> 38

Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile Phe His Asn Gly

1 5 10 15

Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe Lys

20 25 30

Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr

35 40 45

Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu Lys Phe Cys His

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Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp

65 70 75 80

His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser Ile Phe Asp Pro

85 90 95

Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile Tyr Glu

100 105 110

Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys

115 120

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<211> 127

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 39

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1 5 10 15

Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr

20 25 30

Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr

35 40 45

Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn

50 55 60

Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn

65 70 75 80

Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser

85 90 95

His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg

100 105 110

Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg

115 120 125

<210> 40

<211> 371

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD4 ECD

<400> 40

Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys

1 5 10 15

Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn

20 25 30

Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro

35 40 45

Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln

50 55 60

Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp

65 70 75 80

Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu

85 90 95

Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln

100 105 110

Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val

115 120 125

Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu

130 135 140

Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr

145 150 155 160

Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val

165 170 175

Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu

180 185 190

Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr

195 200 205

Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys

210 215 220

Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg

225 230 235 240

Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His

245 250 255

Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu

260 265 270

Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn

275 280 285

Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu

290 295 300

Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu

305 310 315 320

Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu

325 330 335

Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln

340 345 350

Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro

355 360 365

Val Gln Pro

370

<210> 41

<211> 161

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD8A(CD8-α) ECD

<400> 41

Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly

20 25 30

Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe

35 40 45

Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp

50 55 60

Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr

65 70 75 80

Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala

85 90 95

Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu

100 105 110

Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

115 120 125

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

130 135 140

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

145 150 155 160

Asp

<210> 42

<211> 149

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD8B(CD8-β) ECD

<400> 42

Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln Thr Asn Lys Met Val

1 5 10 15

Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser Asn Met Arg Ile Tyr

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp Ser His His Glu Phe

35 40 45

Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile His Gly Glu Glu Val

50 55 60

Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala Ser Arg Phe Ile Leu

65 70 75 80

Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Phe Cys Met

85 90 95

Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ser

100 105 110

Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro Thr Lys Lys Ser Thr

115 120 125

Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro Glu Thr Gln Lys Gly

130 135 140

Pro Leu Cys Ser Pro

145

<210> 43

<211> 422

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> LAG3 ECD

<400> 43

Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly

20 25 30

Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro

35 40 45

Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp

50 55 60

Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly

65 70 75 80

Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu

85 90 95

Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg

115 120 125

Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr

130 135 140

Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn

145 150 155 160

Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg

165 170 175

Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His

180 185 190

Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser

195 200 205

Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser

210 215 220

Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu

245 250 255

Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro

260 265 270

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe

275 280 285

Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr

290 295 300

Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu

305 310 315 320

Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu

325 330 335

Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe

340 345 350

Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro

355 360 365

Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys

370 375 380

Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr

385 390 395 400

Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala

405 410 415

Leu Pro Ala Gly His Leu

420

<210> 44

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> HAVCR2(TIM-3) ECD

<400> 44

Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp

20 25 30

Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg

35 40 45

Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn

50 55 60

Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr

65 70 75 80

Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile

85 90 95

Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys

100 105 110

Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro

115 120 125

Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu

130 135 140

Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn

145 150 155 160

Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala

165 170 175

Thr Ile Arg Ile Gly

180

<210> 45

<211> 394

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CEACAM1 ECD

<400> 45

Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser

20 25 30

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr

35 40 45

Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg

50 55 60

Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln

65 70 75 80

Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val

85 90 95

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100 105 110

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Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr

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<213> 智人（Homo sapiens）

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275 280 285

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

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<213> 智人（Homo sapiens）

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 59

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

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Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

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<210> 60

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v6 ECD

<400> 60

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

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Gly His Asn Leu Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

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<212> PRT

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<210> 94

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

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<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 208

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<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v50 ECD

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Thr Thr Leu Ser Cys

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<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v53 ECD

<400> 107

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Val Ile Phe Trp

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Gln Lys Glu Gly Lys Leu Val Leu Thr Met Gln Ser Gly Asp Met Asn

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Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

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165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 108

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v54 ECD

<400> 108

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

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Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

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195 200 205

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<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v1 ECD

<400> 109

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<210> 110

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v2 ECD

<400> 110

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

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225 230 235

<210> 111

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v3 ECD

<400> 111

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

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180 185 190

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Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

225 230 235

<210> 112

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v4 ECD

<400> 112

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

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Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val

100 105 110

Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro

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<211> 238

<212> PRT

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<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<210> 138

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v30 ECD

<400> 138

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<210> 139

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v31 ECD

<400> 139

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<210> 140

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v32 ECD

<400> 140

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225 230 235

<210> 141

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v33 ECD

<400> 141

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<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v34 ECD

<400> 142

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Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg

165 170 175

Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

180 185 190

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu

195 200 205

Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

225 230 235

<210> 143

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v1 ECD

<400> 143

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Val Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Val Pro Leu Ala Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu Lys Glu

100 105 110

His Pro Gln Leu Gly

115

<210> 144

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v2 ECD

<400> 144

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Val Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu Lys Glu

100 105 110

His Pro Gln Leu Gly

115

<210> 145

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v3 ECD

<400> 145

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Val Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu Lys Glu

100 105 110

His Pro Gln Leu Gly

115

<210> 146

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v4 ECD

<400> 146

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu Lys Glu

100 105 110

His Pro Gln Leu Gly

115

<210> 147

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> NKp30 v5 ECD

<400> 147

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu Lys Glu

100 105 110

His Pro Gln Leu Gly

115

<210> 148

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 v1 ECD

<400> 148

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

20 25 30

Phe Trp His Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser

50 55 60

Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys

65 70 75 80

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85 90 95

Met Ile Arg Ile His His Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

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Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys

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Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp

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Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

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<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 v2 ECD

<400> 149

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

20 25 30

Phe Trp His Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly

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Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

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Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

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Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile Pro

210 215 220

<210> 150

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 v3 ECD

<400> 150

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

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Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile Pro

210 215 220

<210> 151

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 v4 ECD

<400> 151

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

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Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

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130 135 140

Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp

145 150 155 160

Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile Pro

210 215 220

<210> 152

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 WT IgV

<400> 152

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100

<210> 153

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v1 IgV

<400> 153

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 154

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v4 IgV

<400> 154

Val Ile His Met Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

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Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 155

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v6 IgV

<400> 155

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Leu Ala Glu Val Thr

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<210> 156

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v7 IgV

<400> 156

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<210> 157

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v9 IgV

<400> 157

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Leu Ala Glu Val Thr

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v11 IgV

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Leu Ala Glu Val Thr

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v12 IgV

<400> 160

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

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Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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100

<210> 161

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v13 IgV

<400> 161

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Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Ser Arg Ile Tyr Trp

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

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Leu Ala Glu Val Thr

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<210> 162

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v14 IgV

<400> 162

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65 70 75 80

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Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 163

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v15 IgV

<400> 163

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

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Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Glu Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 164

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v16 IgV

<400> 164

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

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100

<210> 165

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v17 IgV

<400> 165

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

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Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Glu Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 166

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v19 IgV

<400> 166

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

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100

<210> 167

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v21 IgV

<400> 167

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

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20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 168

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v22 IgV

<400> 168

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 169

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v23 IgV

<400> 169

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Thr Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Gly Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 170

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v24 IgV

<400> 170

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr His Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Gly Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Arg Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Gly Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 171

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v25 IgV

<400> 171

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile His Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Gly Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 172

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v26 IgV

<400> 172

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Ala Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 173

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v27 IgV

<400> 173

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu His Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Gly Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 174

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v28 IgV

<400> 174

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

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20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 175

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v30 IgV

<400> 175

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 176

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v32 IgV

<400> 176

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Val Val Leu Asp Met Ile Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Gly Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 177

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v33 IgV

<400> 177

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Ala Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 178

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v34 IgV

<400> 178

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Val Thr Leu Phe Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile His Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Gly Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 179

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v35 IgV

<400> 179

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Phe Val Ile Arg Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 180

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v36 IgV

<400> 180

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Gly Pro Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 181

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v37 IgV

<400> 181

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Leu Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 182

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v38 IgV

<400> 182

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Asp Ile Leu Trp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 183

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v40 IgV

<400> 183

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Asp Ile Leu Trp

20 25 30

His Lys Glu Gly Lys Ile Val Leu Ala Thr Arg Ser Gly Asp Thr Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 184

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v41 IgV

<400> 184

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Gly Leu Ala Gln Thr Asp Ile Leu Trp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu Arg

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 185

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v43 IgV

<400> 185

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Val Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Gln Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Cys Val Val Ile Lys Tyr Glu Arg Leu Glu Asn Gln Gly Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 186

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v44 IgV

<400> 186

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Ile Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 187

<211> 101

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD80 v45 IgV

<400> 187

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 188

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v47 IgV

<400> 188

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Gly Gln Ile Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Leu Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His

85 90 95

Leu Ala Gly Val Thr

100

<210> 189

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v48 IgV

<400> 189

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 190

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v49 IgV

<400> 190

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Gly Gln Ile Val Met Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 191

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v50 IgV

<400> 191

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Gly Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 192

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v51 IgV

<400> 192

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr His Ile His Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Gly Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Asn Gly Glu Asn Gly Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 193

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v52 IgV

<400> 193

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Thr Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly Leu Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Val Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Leu Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Lys Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 194

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v53 IgV

<400> 194

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Val Ile Phe Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Gly Lys Leu Val Leu Thr Met Gln Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Cys Ile Val Ile Lys Tyr Glu Arg Leu Glu Asn Gln Gly Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 195

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 v54 IgV

<400> 195

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Met Ile Pro Ala Pro Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Glu Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

<210> 196

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL WT IgV

<400> 196

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 197

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v1 IgV

<400> 197

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 198

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v2 IgV

<400> 198

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 199

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v3 IgV

<400> 199

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asp Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 200

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v4 IgV

<400> 200

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Tyr Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 201

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v5 IgV

<400> 201

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Pro Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 202

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v10 IgV

<400> 202

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Arg Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 203

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v11 IgV

<400> 203

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Gly Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 204

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> ICOSL v12 IgV

<400> 204

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Tyr Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 205

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v13 IgV

<400> 205

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 206

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v14 IgV

<400> 206

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Pro Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 207

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v22 IgV

<400> 207

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asn Ser Ala Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 208

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v23 IgV

<400> 208

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Asp Ser Pro Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 209

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v24 IgV

<400> 209

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 210

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> ICOSL v28 IgV

<400> 210

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Pro

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 211

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v30 IgV

<400> 211

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Gln Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 212

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v33 IgV

<400> 212

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe Asp Cys Phe

85 90 95

Val Phe Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 213

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v34 IgV

<400> 213

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe Asp Cys Phe

85 90 95

Val Phe Ser Arg Ser Leu Glu Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110

<210> 214

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 WT IgC-样

<400> 214

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 215

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> NKp30 v1 IgC-样

<400> 215

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Val Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Val Pro Leu Ala Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 216

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> NKp30 v2 IgC-样

<400> 216

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Val Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 217

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> NKp30 v3 IgC-样

<400> 217

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Val Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 218

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v4 IgC-样

<400> 218

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 219

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 v5 IgC-样

<400> 219

Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys Glu Val

35 40 45

Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg Asp Val

65 70 75 80

Arg Gly His Asp Ala Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val Leu Gly

85 90 95

Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val

100 105

<210> 220

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 WT IgV

<400> 220

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val

20 25 30

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

35 40 45

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

50 55 60

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

65 70 75 80

His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser

85 90 95

Glu Leu Ser

<210> 221

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86 v1 IgV

<400> 221

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp His Asp Gln Glu Asn Leu Val

20 25 30

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

35 40 45

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

50 55 60

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

65 70 75 80

Leu His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His His Met Asn Ser

85 90 95

Glu Leu Ser

<210> 222

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86 v2 IgV

<400> 222

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp His Asp Gln Glu Asn Leu Val

20 25 30

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

35 40 45

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

50 55 60

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

65 70 75 80

His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser

85 90 95

Glu Leu Ser

<210> 223

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86 v3 IgV

<400> 223

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val

20 25 30

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

35 40 45

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

50 55 60

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

65 70 75 80

Leu His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser

85 90 95

Glu Leu Ser

<210> 224

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD86 v4 IgV

<400> 224

Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val

20 25 30

Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser

35 40 45

Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg

50 55 60

Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile

65 70 75 80

His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His His Met Asn Ser

85 90 95

Glu Leu Ser

<210> 225

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> VH信号肽

<400> 225

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly

1 5 10 15

Val Ser Ala

<210> 226

<211> 232

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> IgG1 Fc

<400> 226

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 227

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> IgG2 Fc

<400> 227

Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

20 25 30

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

35 40 45

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

50 55 60

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

65 70 75 80

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

85 90 95

Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

100 105 110

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

115 120 125

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

130 135 140

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

165 170 175

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

180 185 190

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

195 200 205

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

210 215 220

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 228

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> IgV-IgV 接头

<400> 228

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 229

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgV-Fc 接头 1

<400> 229

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 230

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgV-Fc 接头 2

<400> 230

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 231

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 WT 接头 1

<400> 231

Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

1 5 10 15

<210> 232

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80 WT 接头 2

<400> 232

Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

1 5 10

<210> 233

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL WT 接头 1

<400> 233

Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val

1 5 10

<210> 234

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL WT 接头 2

<400> 234

Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile Thr

1 5 10 15

Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

20 25

<210> 235

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp30 WT 接头 1

<400> 235

Val Glu Lys Glu His Pro Gln Leu Gly

1 5

<210> 236

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 WT 接头 1

<400> 236

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe

1 5

<210> 237

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 WT 接头 2

<400> 237

Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile

1 5 10 15

Thr Glu

<210> 238

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86 WT 接头 3

<400> 238

Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro

1 5 10 15

Pro Pro Asp His Ile Pro

20

<210> 239

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v35 ECD

<400> 239

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Glu Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val

100 105 110

Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro

115 120 125

His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn

130 135 140

Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser

145 150 155 160

Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg

165 170 175

Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

180 185 190

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu

195 200 205

Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr

225 230 235

<210> 240

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL v35 IgV

<400> 240

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

35 40 45

Ile Pro Gln Ser Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

50 55 60

Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu

85 90 95

Val Leu Ser Gln Ser Leu Glu Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu

100 105 110