一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于PCR扩增技术领域，具体地说，是关于一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用。

背景技术

强直性肌营养不良1型(Myotonic Dystrophy Type 1,DM1)是一种遗传性疾病，其主要以肌无力、肌强直、肌萎缩为特征，同时还伴有内分泌、心脏、眼部晶状体等其他系统损害。目前已知DM1是由DMPK基因3’-UTR区域CTG三碱基重复扩张所引起的，且DMPK基因中CTG重复次数从5次到5000次不等。

用于DMPK基因中CTG重复次数的测定的PCR扩增方法众多，如三重引物PCR(TP-PCR)、热脉冲PCR(HPE-PCR)、Small-pool-PCR(SP-PCR)以及Flash-small-pool PCR(FSP-PCR)。这些方法相对非扩增的southern-blot和三代测序来说，具有样本用量少、耗时短、成本可控等优点。但是PCR扩增的方法本身受引物本身的结构、与模板的结合牢固程度、目的基因片段大小等因素的影响，使得结果产生明显差异。而绝大部分情况下DM1患者的DMPK两个等位基因中CTG重复次数为一大一小，目前已知的引物绝大多数都具有偏好性，即倾向于扩增小片段，导致大片段的检测困难。

目前比较成熟的技术TP-PCR，但是，其只能检测出240次以内的CTG重复次数明确值，对于重复次数较大的情况(>240次重复)还不能准确的给出重复次数(如中国专利文献201410211499.0公开的一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒)。此外，近年来有文献报道(Musova Z,Mazanec R,Krepelova A,et al.Highly unstable sequenceinterruptions of the CTG repeat in the myotonic dystrophy gene[J].2009,149A(7):1365-1374.)，TP-PCR方法虽然灵敏度和特异度均较高，但是约5％的假阴性样本，可能原因包括：1)重复序列中存在CCG/CTC和GGC等干扰序列；2)TP-PCR特异性引物与某些样本的结合区域存在突变；3)扩增过程中的某些偶发因素。

发明内容

本发明针对现有的DM1基因诊断技术的不足，提供了一种基于常规PCR技术的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，该PCR检测试剂盒对于DMPK基因中CTG重复次数检测有明显优势，弥补了TP-PCR的不足，可实现重复次数大于240次的样本的扩增，并可通过测算给出这些样本DMPK基因中CTG的重复次数。同时该方法具有检测所需样本量较少、检测成本相对较低、检测结果直观、针对性强、灵敏度高、准确性高、可以检测出更多次数的重复变异等优点。为此，本发明的第一个目的是提供一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒。本发明的第二个目的是提供一种所述的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒的应用。本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，包括特异性引物，所述特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，所述PCR检测试剂盒，还包括反应体系，所述反应体系为25μL，包括2×GC BufferⅡ5μL，2.5mM dNTP 3μL，10ng DNA样本1μL，TaKaRa La Taq DNA聚合酶0.5μL，10μM的特异性引物对各1μL，余量为水。

根据本发明，所述PCR检测试剂盒还包括扩增程序：94℃变性60s；进入循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保持温度不变。

作为本发明的第二个目的，一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒的应用，所述PCR检测试剂盒用于检测萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的CTG三碱基重复次数。

作为本发明的第三个目的，一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的扩增方法，包括如下步骤：

第一步，以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

第二步，观察扩增产物的电泳结果，若电泳图中存在双条带，则表明所述PCR方法可以同时扩增大片段和小片段；

其中，扩增用的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，还包括第三步、计算待测样品中的CTG的重复次数。

根据本发明，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×GC BufferⅡ5μL，2.5mMdNTP 3μL，10ng DNA样本1μL，TaKaRa La Taq DNA聚合酶0.5μL，10μM的特异性引物对各1μL，余量为水。

根据本发明，所述PCR扩增的扩增程序为：94℃变性60s；进入循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保持温度不变。

本发明的有益效果：该方法具有扩增特异性强、扩增偏好性小、操作简便、成本较低，同时克服了现有方法对部分样本检测显示假阴性的技术难点，实现了超过1000次重复变异的检测，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的实施例1的不同引物的扩增特异性比较。

图2为实施例2的样本P1的TP-PCR结果。

图3为实施例2的样本P2的TP-PCR结果。

图4和图5为实施例2的样本P1采用实施例1中引物对1进行PCR的扩增结果。

图6和图7为实施例2的样本P2采用实施例1中引物对1进行PCR的扩增结果。

图8为PCR产物长度图。

图9为样本P1的一代测序反向结果。

图10为样本P2的一代测序正向结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。例如，以下实施例的TP-PCR方法参见文献：Warner J P,Barron L H,Goudie D,et al.A general method for the detection of large CAGrepeat expansions by fluorescent PCR.[J].Journal of Medical Genetics,1997,33(12):1022-1026.

实施例1特异性引物对的设计及扩增效率比较

本实施例的目的是优选特异性引物对用于DMPK基因3’-UTR的CTG重复区域扩增，为此申请人根据通用引物设计原则，在目的基因两侧设计了2组特异性引物对，并设置了最适的PCR扩增反应条件，两组反应扩增得到的目的基因片段大小不同，发现采用特异性引物对1对疑似DM1的患者的血液样本进行扩增，效果更好。

(1)特异性引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，该引物对的扩增的目的基因片段大小约为660bp。反应体系和反应条件分别如表1和表2所示。

TYB-DMKf4：TCGCGAATGCATCTAGATCAGTTTGCCCATCCACGTCAG，SEQ ID NO:1；

TYB-DMKr4：ACGGGCCCGGGATCCGATCGTGCGAGTGGACTAACAACAG，SEQ ID NO:2。

表1反应体系

表2反应程序

(2)特异性引物对2，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，该引物对的扩增的目的基因片段大小约为300bp。反应体系和反应条件分别如表3和表4所示。

DMKf：5’-GCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTGGGTC-3’，SEQ ID NO:3；

DMKr：5’-ACGCTCCCCAGAGCAGGGCGTCATGC-3’，SEQ ID NO:4。

表3反应体系

表4反应程序

3、PCR扩增结果。

利用上述的两组引物对分别对9个样本，编号1至9，进行PCR扩增实验。本实施例的样本均来自临床诊断为疑似DM1的患者的血液样本，样本DNA抽提采用血液基因组柱式小量提取试剂盒(Blood Genomic DNA Mini Kit，品牌方康为世纪，型号CW2087M)。采用琼脂糖电泳对上述PCR结果进行检测，结果见图1。

结果显示，用引物对1进行PCR时，所有样本的PCR结果中均为2条带且阴性参照无条带；用引物对2进行PCR时，阴性参照无条带，但是只有样本6、7、9的PCR结果隐约显示有2条带，其余样本均为1条带。通过比较这两对引物的PCR结果可以看出引物对1较引物对2的扩增结果要好一些。

实施例2部分TP-PCR假阴性样本进行扩增及对扩增结果进行一代测序验证

(1)TP-PCR假阴性样本进行扩增

本实施例选择了2个临床诊断显示DM1患者的样本(样本P1/P2)，用TP-PCR方法检测阴性的样本，用引物对1及表1的反应体系和表2的扩增程序进行扩增，检测萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域。样本均为DM1患者血液DNA样本。扩增结果见图2-5。

图2结果显示，其中一个等位基因为CTG 13次重复，另一个等位基因峰值过低，未检测出。

图3结果显示，其中一个等位基因为CTG 5次重复，另一个等位基因峰值过低，未检测出。

图4和图5的结果显示：用引物序列1的反应程序进行PCR时，样本P1凝胶电泳图上有2条明亮的条带，阳性样本也是2条明亮的条带，阴性样本只有一条带，空白样本无条带。使用毛细管电泳技术测得样本P1中较大的等位基因CTG重复次数为458±153次；

同样的，图6、图7的结果显示：对于样本P2凝胶电泳图上有2条明亮的条带，阳性样本也是2条明亮的条带，阴性样本只有一条带，空白样本无条带。使用毛细管电泳技术测得样本P2中较大的等位基因CTG重复次数为1542±407次。

其中，CTG重复次数的计算原理为：根据较大片段的迁移距离计算其片段大小L1，进一步算出其CTG重复次数(如图8所示：重复次数N＝L3/3，L3＝L1-[L2+L4]，L2+L4＝626)。特别注意，由于毛细管电泳图中，较大片段是有面积范围的，即峰图最左侧有一个迁移距离a，右侧有一个迁移距离b，根据迁移距离实际上可得出两个片段大小L1.1和L1.2，最终片段大小为(L1.1+L1.2)/2±(L1.1-L1.2)/2。

(2)一代测序验证

为了进一步确证实施例2中的方法扩增得到的样本P1、样本P2中较大条带为目的条带，对其进行一代测序。

样本P1的一代测序反向结果如图9所示。

样本P2的一代测序正向结果如图10所示。

图9和图10结果显示，正向测序结果中有CTG重复序列，同时5’端的特异性序列也是符合的，因此我们的方法获得的较大片段为目的条带。

鉴于以上实验我们得出以下结果:

(1)对于样本P1和P2，TP-PCR方法存在假阴性，对于部分样本中较大的重复片段其扩增效率极低，仅能检测出较小的重复片段；使用本实施例的方法，其扩增效率更佳，琼脂糖凝胶电泳结果可以显示大片段和小片段，且通过CTG重复次数的测定，可以检测出样本P1的大片段重复次数为458±153次，样本P2的大片段重复次数为1542±407次。

(2)对于样本P2，使用本发明的方法，其偏好性小；琼脂糖凝胶电泳结果可以显示大片段和小片段，且通过CTG重复次数的测定，可以检测出大片段重复次数为1542±407次，这表明本发明的PCR方法测定萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG重复次数的已经突破1000次。

结论：按实施例1的特异性引物对1及表2和表3的PCR扩增条件进行PCR扩增，该扩增方法克服了现有方法对部分样本检测显示假阴性的情况，同时保有扩增偏好性小、操作简便、成本较低的特点，而且可以检测出超过1000次重复的变异，应用范围更广。

综上所述，本发明设计的反应体系和扩增条件，用于PCR检测，可以同时检测萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的大片段和小片段，其扩增偏好性、检测成本相对较低、检测结果直观、针对性强、灵敏度高、准确性高。同时克服了现有方法对部分样本检测显示假阴性的技术难点，实现了超过1000次重复变异的检测。因此本发明的PCR扩增方法在强直性肌营养不良1型(DM1)的萎缩性肌强直蛋白激酶基因(DMPK)中CTG三碱基重复次数的检测上具有良好的应用前景。所述特异性引物对和反应条件可采用本领域中已知的方法，进一步制成PCR检测试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海昂朴生物科技有限公司

<120> 一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgcgaatgc atctagatca gtttgcccat ccacgtcag 39

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgggcccgg gatccgatcg tgcgagtgga ctaacaacag 40

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<212> DNA

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<400> 3

gccagttcac aaccgctccg agcgtgggtc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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