检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 16:08:01

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒。

背景技术

甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia，MMA)是有机酸代谢异常中最常见的疾病，是多种原因所致体内甲基丙二酸蓄积的总称，属于常染色体隐性遗传，分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症两种类型。国内MMA主要以甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症为主，包括cb1C、cb1D及cb1F三种亚型，其中约有90％以上为cb1C型，致病基因为MMACHC，存在热点突变位点。

甲基丙二酸血症发病年龄各异，临床表现常无特异性，常常被误诊为一般围生期脑损害、败血症、急慢性脑病或脑变性病，常见喂养困难、呕吐、呼吸急促、惊厥、肌张力异常、嗜睡、智力、运动落后或倒退。目前临床主要依靠串联质谱和气相色谱-质谱检测代谢标记物进行新生儿筛查和临床诊断，质谱检测容易收到干扰，假阳性率高，发现异常进行召回复查耽误治疗时间，基因突变检测是确诊和基因分型的可靠措施，特别是通过新生儿干血斑进行快速MMACHC热点筛查，避免进行复查采样，提高患者确诊时间和效率。

目前对于MMCHC基因进行检测方法主要有Sanger测序、高通量测序技术、基因芯片、飞行时间质谱技术，这些方法由于检测步骤繁琐、仪器昂贵、检测通量限制等原因，临床应用推广受到极大限制，特别是现有方法需要较多抗凝血血液样本进行纯化DNA后进行基因检测，在新生儿筛查中心难以从收集的有限的干血斑样本进行快速基因检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的需要较多抗凝血血液样本、前处理和检测操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供可以检测微量血液样本、快速处理、简便快捷、灵敏度高、可靠性强且成本较低的基于多色探针熔解曲线而设计的用于检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒。

本发明构思如下：利用相邻淬灭双探针进行熔解曲线分析，相邻双探针检测系统由两条探针配合使用，一条突变检测探针标记荧光基团，配套的锚定探针标记淬灭基团，突变检测探针和锚定探针与靶标DNA结合位置相邻。在通过PCR扩增产生靶标产物DNA，熔解曲线过程中，两条探针退火杂交在目标DNA序列上，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光基团的荧光被淬灭，荧光信号低，随着温度升高，杂交双链慢慢解链，荧光标记的突变检测探针与锚定探针分离，荧光基团与淬灭基团距离变大，淬灭效果逐渐减弱，荧光信号变强，荧光信号变化速率最快的温度就是探针检测的熔点(Tm)值。突变检测探针覆盖待测的突变位点，因为突变位点的存在，突变检测探针与靶标中的突变型位点不能完全结合，造成双链结构稳定性降低，因此熔解曲线分析中Tm下降，从而实现检测遗传基因突变位点的功能。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种检测MMACHC基因突变位点的引物组，所述引物组包括检测c.1A>G和c.81+1G>A位点的引物对I，检测c.217C>T位点的引物对II，检测c.315C>G、c.365A>T和c.394C>T位点的引物对III，检测c.445_446delTG和c.481C>T、c.482G>A位点的引物对IV，检测c.565C>A、c.567dupT、c.609G>A、c.626_627delTG和c.658_660delAAG位点的引物对V；

引物对I包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；

引物对II包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；

引物对III包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物；

引物对IV包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物和如SEQ ID NO:8所示的下游引物；

引物对V包括如SEQ ID NO:9所示的上游引物和如SEQ ID NO:10所示的下游引物。

第二方面，本发明提供与所述引物组配套使用的探针，包括突变检测探针和锚定探针；其中，突变检测探针5’端标记荧光基团，且3’端进行C3 Spacer修饰，同时锚定探针3’端标记荧光淬灭基团；或者，突变检测探针3’端标记荧光基团，同时锚定探针5’端标记荧光淬灭基团，且3’进行C3 Spacer修饰。

c.1A>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和12所示；

c.81+1G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和14所示；

c.217C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和16所示；

c.315C>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和18所示；

c.365A>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和18所示；

c.394C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20和21所示；

c.481C>T、c.445_446delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22和23所示；

c.482G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24和23所示；

c.565C>A和c.567dupT位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25和26所示；

c.609G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和26所示；

c.626_627delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:28和29所示；

c.658_660delAAG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:30和31所示。

所述荧光基团选自FAM、HEX、CY5、ROX等中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3等中的至少一种。

第三方面，本发明提供一种MMACHC基因突变位点检测试剂盒，包括前处理液、扩增反应液和突变检测液，所述突变检测液选自突变检测液A、突变检测液B、突变检测液C中的至少一种。

所述前处理液为：5％Chelex-100+0.2M NaOH。

所述扩增反应液(6.55ul)为：0.5-2U热启动Taq酶、0.05-0.2U UNG酶、1-10nmoldNTP、1-10nmol dUTP和5ul 5×PCR缓冲液；其中，所述5×PCR缓冲液由pH 8.8的150-350mMTris-HCl、10-20mM MgCl

所述突变检测液A为：如SEQ ID NO:1所示的引物1.5pmol、如SEQ ID NO:2所示的引物20pmol、如SEQ ID NO:7所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:8所示的引物10pmol、如SEQID NO:11所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:13所示的探针7.5pmol、如SEQ ID NO:22所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:24所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:12所示的探针5pmol、如SEQID NO:14所示的探针7.5pmol和如SEQ ID NO:23所示的探针5pmol，以水配制。

所述突变检测液B为：如SEQ ID NO:5所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:6所示的引物10pmol、如SEQ ID NO:9所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:10所示的引物0.4μM、如SEQ IDNO:17所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:19所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:20所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:28所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:18所示的探针5pmol、如SEQ IDNO:21所示的探针5pmol和如SEQ ID NO:29所示的探针5pmol，以水配制。

所述突变检测液C为：如SEQ ID NO:3所示的引物1.5pmol、如SEQ ID NO:4所示的引物15pmol、如SEQ ID NO:9所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:10所示的引物10pmol、如SEQID NO:15所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:25所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:27所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:30所示的探针5pmol、如SEQ ID NO:16所示的探针5pmol、如SEQ IDNO:26所示的探针5pmol和如SEQ ID NO:31所示的探针5pmol，以水配制。

第四方面，本发明提供所述试剂盒在MMACHC基因突变位点检测中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)高效便捷，检测位点多。一次检测通过3个扩增反应体系检测14个常见MMACHC基因突变位点。

(二)通过相邻双探针系统增强检测信号，灵敏度达2ng，实现微量血样(干血斑3mm，全血3ul)样本检测多个MMACHC基因突变位点，不额外增加采血样本的情况下，有利于新生儿筛查检测。

(三)通过含扩增稳定剂和优化剂的反应体系，实现微量血样免纯化基因组DNA进行PCR扩增，15分钟完成前处理，整个检测约2.5小时完成，耗时短，提供临床快速检测方案。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中反应体系A检测效果图。其中，1为FAM荧光信号，检测c.445_446delTG位点；2为HEX荧光信号，检测c.81+1G>A位点；3为ROX荧光信号，检测c.481C>T和c.482G>A位点；4为CY5荧光信号，检测c.1A>G位点。

图2为本发明较佳实施例中反应体系B检测效果图。其中，1为FAM荧光信号，检测c.394C>T位点；2为HEX荧光信号，检测c.626_627delTG位点；3为ROX荧光信号，检测c.365A>T位点；4为CY5荧光信号，检测c.315C>G位点。

图3为本发明较佳实施例中反应体系C检测效果图。其中，1为FAM荧光信号，检测c.565C>A、c.567dupT位点；2为HEX荧光信号，检测c.217C>T位点；3为ROX荧光信号，检测c.609G>A位点；4为CY5荧光信号，检测c.658_660delAAG位点。

图4为本发明较佳实施例中反应体系A各位点纯合突变和野生型检测。其中，A为c.445_446delTG位点野生型和纯合突变型检测；B为c.81+1G>A位点野生型和纯合突变型检测；C为c.1A>G位点野生型和纯合突变型检测；D为c.481C>T和c.482G>A位点野生型和纯合突变型检测。

图5为本发明较佳实施例中反应体系B各位点纯合突变和野生型检测。其中，A为c.394C>T位点野生型和纯合突变型检测；B为c.626_627delTG位点野生型和纯合突变型检测；C为c.315C>G位点野生型和纯合突变型检测；D为c.365A>T位点野生型和纯合突变型检测。

图6为本发明较佳实施例中反应体系C各位点纯合突变和野生型检测。其中，A为c.565C>A、c.567dupT位点野生型和纯合突变型检测；B为c.217C>T位点野生型和纯合突变型检测；C为c.609G>A位点野生型和纯合突变型检测；D为c.658_660delAAG位点野生型和纯合突变型检测。

图7为本发明较佳实施例中临床样本检测c.1A>G位点突变。

图8为本发明较佳实施例中临床样本检测c.81+1G>A位点突变。

图9为本发明较佳实施例中临床样本检测c.315C>G位点突变。

图10为本发明较佳实施例中临床样本检测c.365A>T位点突变。

图11为本发明较佳实施例中临床样本检测c.394C>T位点突变。

图12为本发明较佳实施例中临床样本检测c.445_446delTG位点突变。

图13为本发明较佳实施例中临床样本检测c.481C>T位点突变。

图14为本发明较佳实施例中临床样本检测c.482G>A位点突变。

图15为本发明较佳实施例中临床样本检测c.565C>A位点突变。

图16为本发明较佳实施例中临床样本检测c.567dupT位点突变。

图17为本发明较佳实施例中临床样本检测c.609G>A位点突变。

图18为本发明较佳实施例中临床样本检测c.658_660delAAG位点突变。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中，正常人基因组DNA中的MMACHC基因的核苷酸序列可以参考Genbank登录号为NC_000001.11的第45500229～45513382位碱基。

热启动Taq酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110003-2500。

UNG酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110042-0200。

实施例1 MMACHC基因突变检测试剂的制备及使用方法

本实施例提供的MMACHC基因突变检测试剂可同时检测MMACHC基因的14个位点的突变，包括c.1A>G、c.81+1G>A、c.217C>T、c.315C>G、c.365A>T、c.394C>T、c.445_446delTG、c.481C>T、c.482G>A、c.565C>A、c.567dupT、c.609G>A、c.626_627delTG和c.658_660delAAG。

1、引物的制备

针对14个突变位点的序列设计多对引物，通过筛选和组合，最终选择一批特异性和效果好的引物，各突变位点的扩增引物和优选组合序列见表1，根据表1中的引物序列合成引物。

表1引物相关信息

2、探针的制备

根据表2信息制备探针。其中，FP1-FP11为突变检测探针，Q1-Q9为锚定探针。

荧光基团为FAM、HEX、CY5、ROX中的一种，荧光淬灭基团为能与荧光基团配套的BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种，C3 Spacer为封闭基团，在探针DNA序列3端防止探针作为引物延伸。所述的突变检测探针和锚定探针配套使用，突变检测探针5’标记荧光基团同时3’进行C3 Spacer修饰处理，配套锚定探针3’标记荧光淬灭基团；或者突变检测探针3’标记荧光基团，配套锚定探针5’标记荧光淬灭基团同时3’进行C3 Spacer修饰处理。

其中因为有的突变位点位置接近，c.315C>G和c.365A>T位点共用一个淬灭探针Q4，c.445_446delTG和c.481C>T、c.482G>A共用一个淬灭探针Q6，c.565C>A、c.567dupT和c.609G>A共用一个淬灭探针Q7。

表2探针的相关信息

3、MMACHC基因突变检测试剂的制备

前处理液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：5％Chelex-100、0.2MNaOH，Chelex-100购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，NaOH购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

每个扩增反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.305U/ul热启动Taq酶、0.038U/ul UNG酶、0.4mM dNTP、0.4mM dUTP、5×PCR缓冲液和水组成，其中，5×PCR缓冲液含有扩增优化剂，由75mM Tris-HCl(pH 8.8)、4mM MgCl

扩增反应液(1人份)用量如表3所示。

表3扩增反应液用量

突变检测液A由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表4和表5所示。

表4突变检测液A溶质、浓度及其用量

表5突变检测液B溶质、浓度及其用量

突变检测液C由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表6所示。

表6突变检测液C溶质、浓度及其用量

4、MMACHC基因突变检测方法

(1)待测样本前处理

在待测样本(3mm干血斑或3ul全血)中加入100ul前处理液，95℃加热处理10min获得混合液，对混合液进行5000rpm，5min的离心，获得提取液。

(2)配置检测反应体系

将扩增反应液6.55ul、检测基因组模板(待测样本提取液、质粒或纯化基因组DNA)2ul分别与6ul突变检测液A、B、C混合，用去离子水补齐到25ul，离心去除气泡，获得检测反应体系A、检测反应体系B、检测反应体系C。

(3)检测

采用荧光定量PCR仪(上海宏石SLAN-96S)对上述检测反应体系进行PCR扩增和熔解曲线分析。

PCR扩增程序：

50℃2min,95℃10min；

95℃10s；62℃10s；72℃20s；15个循环；

95℃10s；56℃15s；72℃20s；50个循环；

熔解曲线分析程序：

95℃1min，37℃3min，40℃～80℃以0.04℃/s的速度升温进行熔解曲线分析，并同时收集FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号。

(4)结果分析

由荧光定量PCR仪配置软件根据上述荧光信号获得上述反应检测体系各通道的Tm值。

Tm值以仪器自动判读值为准，但出现仪器无法给出Tm值时，可通过调整基线或人工判读获得Tm值。

标准对照检测，在反应体系A/B/C中的FAM/HEX/CY5/ROX通道均有Tm在参考值范围内的熔解峰(表7)，阴性对照无明确熔解峰，则本次检测扩增系统有效。

检测样本，在反应体系A/B/C中的FAM/HEX/CY5/ROX通道如缺失熔解峰，则说明对应的位点扩增失败，检测结果无效，需重新提取样本进行检测。

检测样本，在反应体系A/B/C中的FAM/HEX/CY5/ROX通道中出现的熔解峰，与野生型熔解峰对比，根据Tm差异判断是否发生突变。

只有野生型峰，则为对应基因位点野生型；

如果只有突变型峰，则为对应基因位点纯合突变型；

如果同时出现野生型峰和突变型峰，则为对应基因位点纯合突变型。

阴性对照检测反应体系的各通道无熔解峰，如阴性对照有荧光通道出现熔解峰，则说明此次实验结果无效，建议重复实验。

标准对照检测反应体系的各通道无熔解峰，表示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。

表7标准对照熔解峰Tm的参考值范围

将检测反应体系的各通道Tm值记为Tm，标准对照检测反应体系的各通道Tm值记为Tm

表8

表9

表10

反应体系A、B、C检测效果分别见图1～图3。

实施例2检测灵敏度测试

按照实施例1配制反应体系，用基因组纯化试剂盒(天根生化科技(北京)北京有限公司)纯化血液DNA，梯度稀释，每个反应体系分别加入10ng、5ng、2.5ng、1.25ng、0.625ng、0.312ng、0.156ng、0.078ng的基因组DNA，检测方法同实施例1中“MMACHC基因突变检测方法”。

c.626_627delTG位点在0.156ng、0.078ng时无信号，在0.312ng浓度以上信号良好，其他位点在检测的浓度范围内信号良好，因此检测灵敏度设置1ng/25ul反应体系，确保检测信号质量。

实施例3MMACHC基因突变位点检测

本实施例的样本为质粒(相关信息如表11所示)，包含待测MMACH基因位点野生型或突变型基因序列(委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成制备，采用基因合成方式合成各基因位点序列，克隆到PUC-57质粒上)。

表11基因合成包含各MMACHC基因位点序列质粒

将质粒Z1-Z8稀释成0.1pg/ul，取2ul作为纯合突变模板和正常人基因组DNA一起进行扩增检测，采用实施例1制备的MMACHC基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。

检测结果如图4～图6所示，本试剂盒能有效检测出待测基因位点野生型和纯合突变型。

实施例4临床样本验证

本实施例中待测样本为15例明确MMACHC基因突变的临床干血斑样本和20例正常干血斑样本。采用实施例1制备的MMACHC基因突变检测试剂对待测样本进行检测，检测方法与实施例1相同。采用Sanger测序验证作为对照。

突变位点检测结果见图7～图18，本发明试剂盒对临床阳性样本检测成功率和正确率100％，与Sanger测序验证结果一致(表12)。

表12

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 苏州淦江生物技术有限公司

<120> 检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试剂盒

<130> KHP221112596.9

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA