一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒。

背景技术

流感病毒的血凝素是刺激机体引起免疫保护作用的主要抗原，是评价流感疫苗效力高低的唯一标志。目前流感病毒疫苗血凝素测定通常采用的是单向免疫扩散（SRID）法，该方法至今已沿用30余年。该方法将抗原参考品和供试品分别加至含有抗体参考品的琼脂糖凝胶板上，于20～25℃放置至少18个小时后进行浸泡、干燥、染色、脱色、干燥、测量。以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到供试品的血凝素含量。从理论上和实践上分析，SRID法存在以下缺点：（1）检测灵敏度低：定量限为微克级，根据文献《四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量检测方法的验证》提示，A1、A3、BV、BY四个亚型中定量限最低值为2.89μg/mL；（2）检测通量低：供试品做复孔的前提下，小板（6×6cm）检测通量为4样次、大板（9×10cm）检测通量为17样次；（3）检测步骤繁琐：整个检测过程包括以下必备步骤：清洗玻璃板，制胶装置调平衡、配胶、倒板、打孔、挑孔、上样、浸泡、滤纸干燥、染色、脱色、烘箱干燥、测量；（4）耗时长：整个过程耗时约24h；（5）标准抗血清消耗量大：抗血清消耗量约200-350μL/小板（6×6cm），500-875μL/大板（9×10cm），一支标准抗血清（规格：2mL/瓶）仅能支持2-10次试验。除了常用的SRID法，血凝素含量测定方法还有总蛋白测定结合SDS-PAGE扫描法、酶联免疫法。

现有技术中公开的总蛋白测定结合SDS-PAGE扫描法以还原性SDS-PAGE分离样品，以灰度扫描法确定HA蛋白百分比，结合样品总蛋白数值，计算样品中HA含量。从理论上分析，该方法干扰因素多，灰度扫描法的准确度低，检测误差较大，检测灵敏度低；此外还有双抗夹心法试剂盒：系由包被单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的兔多克隆抗体、H7N9血凝素蛋白标准品、样品稀释液等试剂组成。但该试剂盒需要自行制备这两种抗体和血凝素蛋白标准品，仅仅适用于检测H7N9流感病毒血凝素蛋白，不利推广使用。另外，还有公开采用夹层免疫测定法，用与血凝素结合而不与抗体结合的凝集素和与该血凝素进行抗原抗体反应的抗血凝素抗体夹持该血凝素。具体是将经过预实验筛选得到的凝集素包被在固相上，加入经裂解后的含血凝素的样品进行反应，再与经过标记的抗血凝素抗体反应。该方法耗时在8.3小时以上，检测范围为1.95-125ngHA/mL，对于新突变株的流感病毒，需要重新摸索适合的凝集素。因此目前亟需一种高灵敏度、高检测通量、耗时短、检测步骤简单、抗原血清消耗少的流感病毒疫苗血凝素含量测定方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒，着力解决SRID法的低灵敏度，低检测通量，耗时过长，检测步骤繁琐，抗原抗血清消耗大的缺点；解决总蛋白测定结合SDS-PAGE扫描法的干扰因素多，检测误差大的缺点；解决现有酶联免疫法检测时间长、需要进行预实验筛选凝集素的缺点。

本发明提供一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法，包括如下步骤：

S1：包被流感病毒的标准抗原/供试品，用包被液稀释标准抗原/供试品至适合血凝素浓度；使供试品血凝素浓度落在标准曲线血凝素浓度范围内，分别加入空白酶标板中；设置阴性对照和空白对照，所述阴性对照加入包被液；一起放置于37℃水浴；空白对照不加任何试液，仅在显色和终止步骤加入显色液和终止液。优选0.85%w/v氯化钠作为包被液，其次为磷酸盐缓冲液（pH7.4），相比碳酸盐缓冲液（pH9.6）的缓冲体系，更能给流感病毒血凝素（对pH值敏感）提供更理想的环境，保持其生理结构，可以避免碳酸盐缓冲液的高pH环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续抗原抗体结合。

S2：洗板，用PBST（含0.1%v/v吐温20的磷酸盐缓冲液，pH=7.4）洗涤，弃液，拍干残留的PBST；

S3：封闭，用PBS（pH7.4）配制5%w/v脱脂奶粉；加入酶标板中，37℃水浴；

S4：洗板，用PBST洗涤，弃液，拍干残留的PBST；

S5：孵育标准抗血清，用抗体稀释液稀释标准抗血清，加入酶标板中，空白对照除外；酶标板固定在37℃恒温摇床中，孵育；

S6：洗板，用PBST洗涤，弃液，拍干残留的PBST；

S7：孵育酶标抗体，用抗体稀释液稀释酶标抗体，加入酶标板中，空白对照除外；酶标板固定在37℃恒温摇床中，孵育；

S8：洗板，用PBST洗涤，弃液，拍干残留的PBST；

S9：显色反应，酶标板每孔加入显色液，37℃避光水浴；

S10：终止反应，酶标板每孔加入终止液，轻轻震荡均匀。在30min内测定结果（设定酶标板双波长450 nm/630 nm测定）；

S11：计算，以标准抗原血凝素浓度的对数值和对应吸光度450/630nm的对数值作直线回归，得双对数回归方程：y=ax+b；则供试品的血凝素含量=n×10

其中，所述PBST为含0.1%v/v吐温20的磷酸盐缓冲液（pH7.4）。

采用恒温摇床对酶标板在抗血清和酶标抗体孵育过程中进行慢摇，可以使抗原抗体充分接触，并加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合率，缩短反应时间。

抗体稀释液加入吐温20和海藻糖，在吐温20的参与下减少非特异性结合，降低了实验误差，协同海藻糖提高抗原和抗体的特异性结合效率，从而降低检测结果的变异率。除了吐温20，其他具备温和去污作用、亲水性强的非离子型表面活性剂均可使用。

市面上的抗体稀释液主要内容物是脱脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、血清类等，很少使用人血白蛋白（ALB）制备抗体稀释液。在本方法建立过程中发现ALB作为抗体稀释液成分更有利于某些亚型血凝素含量测定，比BSA的效果好，结果显示BSA可能干扰抗原和抗体的特异性结合。

进一步的，所述S1中所述标准抗原血凝素浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 ng/mL。

进一步的，所述S5中标准抗血清的稀释倍数为500-5000倍，优选3000倍，S7中酶标抗体的稀释倍数为30000倍。本发明用棋盘滴定法摸索出抗血清和酶标抗体的最佳稀释度配比：不同亚型的抗血清均为3000倍稀释，酶标抗体30000倍稀释，避免使用浓度过高导致的非特异性吸附，避免浓度过低导致未完全结合供试品的血凝素。

进一步的，所述海藻糖可以替换为甘露醇、尿素、盐酸胍。

进一步的，所述流感病毒的亚型为IVR-215（H1N1）、IVR-224（H3N2）、IVR-228（H3N2）、BVR-26 (B Victoria lineage)、BVR-11 (B Victoria lineage)、B Yamagatalineage中的任意一种，其他亚型流感病毒若有配套的标准抗原和标准抗血清也适用。

本发明还提供一种流感病毒疫苗血凝素含量测定试剂盒，包括如下组分：包被液、PBST、封闭液、通用酶标抗体、抗体稀释液、显色液、终止液；其中，所述包被液为0.85w/v%氯化钠溶液；所述PBST为含0.1%v/v吐温20的PBS（pH7.4）；所述抗体稀释液选自以下任意一种：①含0.5w/v% ALB和0.5%w/v海藻糖的PBST，②含5%w/v脱脂奶粉和0.5%w/v海藻糖的PBST。

进一步的，所述封闭液为含5%脱脂奶粉的PBS（pH7.4）。

进一步的，所述通用酶标抗体为HRP偶联的兔抗绵羊IgG H&L抗体或HRP偶联的驴抗绵羊IgG H&L的酶标抗体，以及均能特异性结合各亚型血凝素的标准抗血清。

进一步的，所述试剂盒还包括流感病毒不同亚型的标准抗原和标准抗血清。

进一步的，所述流感病毒亚型为IVR-215（H1N1）、IVR-224（H3N2）、IVR-228（H3N2）、BVR-26 (B Victoria lineage)、BVR-11 (B Victoria lineage)、B Yamagata lineage中的任意一种，其他亚型流感病毒若有配套的标准抗原和标准抗血清均适用。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

（1）本发明采用0.85% w/v氯化钠对标准抗原和供试品进行包被，相比碳酸盐缓冲液（pH9.6），更能给血凝素（对pH值敏感）提供更理想的环境，保持其生理结构，可以避免碳酸盐缓冲液的高pH环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续实验中抗原和抗体的结合。

（2）本发明采用恒温摇床对酶标板在抗血清和酶标抗体孵育过程中进行慢摇，可以使抗原抗体充分接触，加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合效率，从而实现缩短反应时间的效果；

（3）本发明的抗体稀释液使用吐温20和海藻糖，在吐温20的参与下减少非特异性结合，降低了实验误差，协同海藻糖提高抗原和抗体的特异性结合效率，从而降低检测结果的变异率，可控制在5%以内。

（4）本发明使用ALB制备抗体稀释液。ALB作为抗体稀释液成分更有利于某些亚型血凝素含量测定，比BSA的效果好，BSA可能干扰抗原抗体的特异性结合。

（5）本发明选择了标准抗血清和酶标抗体的最佳稀释倍数。避免使用浓度过高导致非特异性吸附，避免浓度过低导致未完全结合供试品的血凝素。

（6）本发明的测定方法检测灵敏度高，可达1.562 ng/mL。

（7）本发明的测定方法检测通量大，样品重复两孔的前提下，一块酶标板的检测通量为42样次，与SRID法（4-17样次）相比，大大提高了检测通量。

（8）本发明的测定方法步骤少，操作简单。

（9）本发明的测定方法耗时短，约5小时就能得出结果。

（10）本发明的测定方法标准抗血清消耗量少，每块酶标板仅需2μL原倍抗血清。

（11）当样品量较少时，本发明方法可以实现多个亚型的单价样品在同一块酶标板上检测。

（12）本发明的测定方法也可对未裂解的流感病毒颗粒进行检测。

（13）本发明的测定方法中用到的试剂均可从市面上购买获得，并且只要有相应的标准抗原和标准抗血清，该方法可以检测任何亚型的血凝素，易推广，适用范围大。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中BVR-26（B Victoria lineage）（不裂解）的标准曲线图。

图2为本发明实施例1中BVR-26（B Victoria lineage）（裂解）的标准曲线图。

图3本发明实施例1中IVR-215（H1N1）（不裂解）的标准曲线图。

图4本发明实施例1中IVR-215（H1N1）（裂解）的标准曲线图。

图5本发明实施例1中Elisa法和SRID法检测IVR-215（H1N1）血凝素的相关性图。

图6本发明实施例1中Elisa法和SRID法检测BVR-26（B Victoria lineage）血凝素的相关性图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

一、本发明的测定方法用到的试剂耗材如下：

（1）标准品

（2）试剂

包被液（0.85% w/v氯化钠），自制，氯化钠来源于广州化学试剂厂，级别为分析纯）；

PBST（含0.1%v/v吐温20的PBS，pH7.4）；

封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS，pH7.4，脱脂奶粉来源于生工生物）；

通用酶标抗体（HRP偶联的兔抗绵羊IgG H&L抗体，来源于Abcam公司）；

抗体稀释液（其中任意一种：①含0.5%w/v ALB和0.5%w/v海藻糖的PBST，②含5%w/v脱脂奶粉和0.5%w/v海藻糖的PBST；自制）；

显色液（四甲基联苯胺，简称TMB，来源于四正柏生物）；

终止液（0.4M硫酸，自制，浓硫酸来源于四川金山制药有限公司）；

（3）耗材

聚苯乙烯空白微量酶标板（96孔/板，来源于Corning公司）。

本发明的测定方法步骤如下：分别包被裂解后（或不裂解）的标准抗原/对应亚型的供试品到空白酶标板上，经过封闭后再加入相应亚型的标准抗血清进行反应，去掉未结合的标准抗血清后再加入通用酶标抗体进行反应，去掉未结合的通用酶标抗体后通过显色、终止，设定酶标仪双波长450 nm/630 nm测定。以标准抗原的血凝素浓度的对数值和对应吸光度450/630nm的对数值作直线回归，得双对数回归方程为y=ax+b；将供试品吸光度450/630nm的对数值代入方程，则供试品的血凝素含量=n×10

实施例1

本发明的流感病毒疫苗原液血凝素含量测定方法，实验步骤具体如下：

步骤1：包被标准抗原/供试品，用0.85%w/v氯化钠适当稀释标准抗原/供试品。标准抗原剂量曲线的浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562ng/mL；供试品选择适合的稀释度，使其血凝素含浓度落在标准曲线的范围内。分别加入空白酶标板中，每孔50 μL，每个稀释度重复2孔。设置阴性对照和空白对照，阴性对照按50μL/孔加入0.85%w/v氯化钠。于37℃水浴120分钟。

步骤2：洗板，用PBST洗涤4次，30s/次，弃液，拍干。每次于吸水纸上拍干残留的PBST。

步骤3：封闭，用PBS（pH7.4）配制5%脱脂奶粉，现配现用。酶标板每孔加200μL。于37℃水浴60分钟。

步骤4：洗板，用PBST洗涤3次，30s/次，弃液，拍干。每次于吸水纸上拍干残留的PBST。

步骤5：孵育抗血清，用抗体稀释液稀释相应亚型的标准抗血清3000倍，按50μL/孔的量加入酶标板中，空白对照除外。酶标板固定在37℃恒温摇床中，转速为100 rpm，孵育30分钟。

步骤6：同步骤2操作。

步骤7：孵育通用酶标抗体，用抗体稀释液稀释酶标抗体30000倍，按100μL/孔的量加入酶标板中，空白对照除外。酶标板固定在37℃恒温摇床中，转速为100rpm，孵育30分钟。

步骤8：同步骤2操作。

步骤9：显色反应，显色液按100μL/孔的量加入酶标板中，于37℃水浴10-15分钟。

步骤10：终止反应，终止液按100μL/孔的量加入酶标板中，在30min内测定结果（设定酶标仪双波长450 nm/630 nm测定）。

步骤11：以标准抗原血凝素浓度的对数值和对应吸光值450/630nm的对数值作直线回归，得双对数回归曲线为y=ax+b；代入供试品吸光值的对数值，则供试品血凝素含量=n×10

对4个亚型的流感病毒标准抗原均按以下方法制备标准曲线，再采用上述测定方法进行测定：

1、直接制备标准曲线（无裂解处理）：用0.85%w/v氯化钠对复溶后的标准抗原（40μg/mL）进行系列稀释至血凝素浓度为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562ng/mL。

2、裂解后制备标准曲线（裂解处理）：用裂解剂对复溶后的标准抗原（40μg/mL）进行裂解：取一管90μL的标准抗原加入10μL裂解剂（按9:1比例），常温下裂解30min。裂解后用0.85%w/v氯化钠进行系列稀释至血凝素浓度为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562ng/mL。

在1.562-100ng/mL的血凝素浓度范围内，4个亚型的标准抗原在裂解前后制备的标准曲线的相关系数r均可达0.9900以上。以IVR-215（H1N1）和BVR-26（B Victorialineage）的检测数据进行举例佐证，如表1至表4、图1至图4所示。

以BVR-26（B Victoria lineage）亚型为例，对无裂解处理的标准抗原和裂解后的标准抗原分别制备标准曲线，检测数据如表1、表2、图1、图2所示：

表1—无裂解处理的BVR-26（B Victoria lineage）双对数标准曲线参数

表2—裂解处理的BVR-26（B Victoria lineage）双对数标准曲线参数

以IVR-215（H1N1）亚型为例，对无裂解处理的标准抗原和裂解后的标准抗原分别制备标准曲线，检测数据如表3、表4、图3、图4所示：

表3—无裂解处理的IVR-215（H1N1）双对数标准曲线参数

表4—裂解处理的IVR-215（H1N1）双对数标准曲线参数

从上述结果可以看到，甲型（例如IVR-215（H1N1））和乙型（例如BVR-26（BVictoria lineage））的标准抗原在裂解处理前后分别制备的标准曲线的线性关系良好，相关系数r均在0.9900以上。因此本发明方法无论对未裂解还是裂解后的流感病毒疫苗都可以进行血凝素含量检测，线性关系好，灵敏度高，可达1.562ng/mL。

以本发明方法对流感病毒裂解疫苗生产工艺中间样品进行测定，中间样品涵盖尿囊收获液、超滤浓缩液、超离液、除糖液、层析纯化液、裂解液、灭活液，疫苗原液等，均为新鲜无菌的样品。各亚型流感裂解疫苗中间样品运用该法的检测结果与SRID法的检测结果的相关性良好。以IVR-215 (H1N1)型和BVR-26（B Victoria lineage）型流感裂解疫苗中间样品的检测结果举例，本发明Elisa法测定结果和SRID法测定结果的相关系数r分别为0.9930、0.9934，如表5-1、表5-2、图5、图6所示：

表5-1—IVR-215(H1N1)型流感裂解疫苗中间样品血凝素含量

/>

表5-2—BVR-26（B Victoria lineage）型流感裂解疫苗中间样品血凝素含量

对比例1

标准抗血清和酶标抗体稀释度的优化：以棋盘滴定法分别对各亚型流感病毒标准抗原包被血凝素浓度（标准曲线：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562ng/mL）；各亚型标准抗血清稀释度（1:500、1:1000、1:3000、1:5000）；酶标抗体稀释度（1:30000、1:50000、1:70000）；重复实施例1的实验步骤，测定各亚型标准抗原的7个血凝素浓度的吸光值450/630nm，分别拟合回归曲线，计算曲线的斜率k和相关系数r，计算标准抗原100ng/mL的吸光值450/630nm与阴性性对照吸光值450/630nm的比值（P/N）。以100ng/mL标准抗原的吸光值450/630nm在1.000-2.000范围内的前提下，选择同时满足下列参数要求对应的抗血清和酶标抗体稀释度最为最佳稀释度配比：相关系数r>0.9900；斜率k（可允许范围0.8-1.25）越接近1.0；P/N值越高越好；

表6—IVR-215 (H1N1)标准抗血清和酶标抗体稀释度优化

从表6数据分析可得IVR-215 (H1N1)标准抗血清可选择最佳稀释度为1：1000-1：3000之间，酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。

表7—IVR-228 (H3N2) 标准抗血清和酶标抗体稀释度优化

从表7数据分析可得IVR-228 (H3N2) 标准抗血清可选择最佳稀释度为1：500-1：3000之间，酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。

表8—BVR-26 (B Victoria lineage) 标准抗血清和酶标抗体稀释度优化

从表8数据分析可得BVR-26 (B Victoria lineage) 标准抗血清可选择最佳稀释度为1：1000-1：5000之间，酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。

表9—B Yamagata lineage标准抗血清和酶标抗体稀释度优化

从表9数据分析可得B Yamagata lineage标准抗血清可选择最佳稀释度为1：500-1：3000之间，酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。

综合表6至表9的数据分析以及实际应用需求，四个亚型的标准抗血清和酶标抗体的最佳稀释度配比为：标准抗血清1:3000，酶标抗体1:30000。

对比例2

将0.85% w/v氯化钠换成常规的碳酸盐缓冲液（pH9.6）或者PBS(pH7.4），对各亚型流感病毒标准抗原进行2倍梯度稀释7个浓度，血凝素含量分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562ng/mL。再取含流感病毒血凝素的新鲜无菌样品制备两个稀释度，使其血凝素浓度在标准曲线的范围内。重复实施例1的实验步骤。评价依据如下：双对数标准曲线的斜率k最佳范围为0.8-1.25（越接近1.00越好），r>0.9900；同等稀释度的样品的吸光值最高。

表10—不同包被液对标准曲线的斜率及相关系数的影响

从表10中的各包被液对应的标准曲线的相关系数r以及斜率k可看出，相关系数r均可达到0.9900以上；斜率k方面，只有0.85%w/v氯化钠和PBS（pH7.4）包被的标准曲线的斜率k在0.8-1.25的范围，碳酸盐缓冲液（pH9.6）包被的标准曲线斜率k基本达不到该范围。

表11—包被液对不同亚型流感病毒血凝素的包被作用

备注：表格内数值为各亚型流感病毒样品稀释两个稀释度后分别重复6次测定的平均吸光值450/630nm。

从表11的吸光值变化趋势可见，除了H3N2的吸光值无差异外，其他三个亚型的供试品经过0.85%w/v氯化钠和PBS（pH7.4）包被后的检测吸光值比碳酸盐包被后的更高。

从总体上分析，碳酸盐缓冲液（pH9.6）会影响血凝素含量的测定，0.85%w/v氯化钠和PBS（pH7.4）可以避免碳酸盐缓冲液的高pH环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续抗原抗体结合。其中优选0.85%w/v氯化钠，PBS（pH7.4）次之。

对比例3

在抗血清和酶标抗体孵育过程中以恒温静置代替摇床恒温孵育，重复实施例1的实验步骤。

表12—不同孵育方式的影响

从表12的3组标准曲线的线性关系和斜率可以说明，摇床孵育0.5小时可以达到静置孵育1小时的效果。加入摇床孵育可以使抗原抗体充分接触，并加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合率，从而实现缩短反应时间的效果。

对比例4

抗体稀释液加入一定量海藻糖，任意选取2个亚型的含血凝素的新鲜无菌样品各一批，分别制备6等份，重复实施例1的实验步骤，测定样品的血凝素含量。

表13—海藻糖对检测结果变异率的影响

从表13可以看出，抗体稀释液中含有一定浓度的海藻糖，能使血凝素含量检测结果更稳定，可以控制检测变异率在5%以内。

对比例5

不使用ALB或者脱脂奶粉制备酶标抗体稀释液，而用BSA替代，重复实施例1的实验步骤。

表14—含不同蛋白质成分的抗体稀释液的比较

从表14可以看出，吸光值整体偏低，试验存在干扰特异性结合的现象；线性关系差，r为0.9758，阴性对照的吸光值450/630nm为0.082。相比较之下，使用ALB和脱脂奶粉比BSA更好，阴性对照的吸光值450/630nm远低于0.082，标准曲线的线性关系r均在0.9900以上，说明ALB和脱脂奶比BSA更适用于制备抗体稀释液，不会产生非特异性结合或者阻碍特异性结合。

对比例6

封闭液以1%BSA代替5%w/v脱脂奶粉，抗体稀释液以含0.5%w/vALB的PBS（pH7.4）替换含0.5%w/vALB和0.1%v/v吐温20的PBS（pH7.4），重复实施例1的实验步骤。

表15—不同封闭液对检测结果变异率的影响

结果如表15所示，替换前，得到的标准曲线的线性关系r＞0.9900，阴性对照OD

实施例2

本实施例提供一种流感病毒疫苗血凝素含量测定试剂盒，包括如下组分：

包被液、PBST、封闭液、通用酶标抗体、抗体稀释液、显色液、终止液；

其中，所述包被液为0.85% w/v氯化钠；所述PBST为含0.1%v/v吐温20的PBS（pH7.4）；所述抗体稀释液选择以下任意一种：①含0.5%w/vALB和0.5%w/v海藻糖的PBST，②含5%w/v脱脂奶粉和0.5%w/v海藻糖的PBST；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的PBS（pH7.4）。所述通用酶标抗体为HRP偶联的兔抗绵羊IgG H&L抗体或HRP偶联的驴抗绵羊IgG H&L的酶标抗体。所述试剂盒还可以包括流感病毒不同亚型的标准抗原和标准抗血清。所述流感病毒亚型为IVR-215（H1N1）、IVR-224（H3N2）、IVR-228（H3N2）、BVR-11（B Victoria lineage）、BVR-26（B Victoria lineage）、B Yamagata lineage中的任意一种。

综合以上实施例和对比例，本发明（1）采用0.85% w/v氯化钠对标准抗原和供试品进行包被，相比碳酸盐缓冲液（pH9.6），更能给血凝素（对温度和pH值敏感）提供更理想的环境，保持其生理结构，可以避免碳酸盐缓冲液的高pH环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续抗原抗体结合；（2）采用恒温摇床对酶标板在抗血清和酶标抗体孵育过程中进行慢摇，可以使抗原抗体充分接触，加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合效率，从而实现缩短反应时间的效果；（3）抗体稀释液使用吐温20和海藻糖，在吐温20的参与下减少非特异性结合，降低了实验误差，协同海藻糖提高抗原和抗体的结合效率，从而降低检测结果的变异率；（4）使用ALB制备抗体稀释液。ALB作为抗体稀释液成分更有利于某些亚型血凝素含量测定，比BSA的效果好，BSA可能干扰抗原抗体的特异性结合。（5）选择标准抗血清和酶标抗体的最佳稀释倍数。避免使用浓度过高导致非特异性吸附，避免浓度过低导致未完全结合供试品的血凝素。进行上述调整后，本发明的测定方法具有高灵敏度、高检测通量、耗时短、检测步骤简单、抗原血清消耗少的优点，可以检测任何亚型的血凝素，适用范围大。利用该方法的试剂盒可进行流感病毒疫苗血凝素含量的测定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。