一种改进的唾液酸糖肽SGP的工业化生产方法

技术领域

本发明涉及糖肽化合物的生产技术领域，具体涉及一种改进的唾液酸糖肽SGP的工业化生产方法。

背景技术

抗体药物是生物药的一个主要研究方向，其生物学功能来自于蛋白的翻译后修饰。糖基化修饰作为抗体重要的一种修饰，对抗体的生物活性有着极其重要的作用。体外糖基化修饰技术中糖噁唑啉底物的制备是糖抗体基化修饰的核心，传统的噁唑啉全合成因为合成过程中的一系列保护和脱保护反应，往往需要数十步反应，这种困难的长步反应极大地限制了抗体糖基化修饰乃至抗体药物的发展。因此，一种高效制备糖基转移底物的方法很有必要。

唾液酸糖肽(Sialylglycopeptides,SGP)是一种从鸡蛋黄中提取到的具有天然复杂型N糖链的糖肽，其结构如图1所示，由十一个单糖与6个氨基酸组成，其非还原末端通常为两个唾液酸，又称为双唾液酸糖肽，其结构如图1所示。因其所具有的特殊糖型结构与抗体Fc区域的糖型结构高度相似甚至一致，可以作为很多种蛋白质或抗体的糖基供体，是抗体乃至其他蛋白的糖基底物半合成的完美天然原料。

SGP的制备方法最早由Seko

因此，开发一种低毒、短周期、高产的SGP制备方法是很有必要的。

[1]Seko A,Koketsu M,Nishizono M,et al.Occurrence of asialylglycopeptide and free sialylglycans in hen's egg yolk[J].Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-General Subjects,1997,1335(1–2):23-32.

[2]邹洋.糖核苷酸的酶法合成与唾液酸糖肽的分离制备[D].山东大学.

[3]Sun B,Bao W,Tian X,et al.A simplified procedure for gram-scaleproduction of sialylglycopeptide(SGP)from egg yolks and subsequent semi-synthesis of Man3GlcNAcoxazoline[J].Carbohydrate Research,2014,396:62-69.

[4]Liu L,Prudden A R,Bosman G P,et al.Improved isolation andcharacterization procedure of sialylglycopeptide from egg yolk powder[J].Carbohydr Res,2017:122-128.

[5]郭伟来.转糖基底物的制备及抗体糖基化修饰[D].南昌大学.

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发明内容

本发明提供的一种改进的唾液酸糖肽SGP的工业化生产方法，使用市售蛋黄粉为原料，采用有机溶剂超声萃取的方法除脂，用乙醇水溶液提取原料中的SGP。提取液使用纳滤浓缩，后加入有机溶剂进行重结晶，得到SGP粗品，粗品SGP使用C18制备液相进一步纯化，得到高纯度的SGP产品。该方法不使用大毒性有机溶剂、周期短、产量高，适用于工业化生产。

为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

本发明提供了一种改进的唾液酸糖肽SGP的工业化生产方法，包括如下步骤：

S1：将蛋黄粉加入到超声提取罐中，利用第一提取液进行多次超声提取，过滤，收集滤饼得到脱脂蛋黄粉；

S2：将步骤S1得到的滤饼加入到超声提取罐中，利用第二提取液进行多次超声提取，过滤，收集滤液，浓缩，得到唾液酸糖肽SGP浓缩液；

S3：将步骤S2得到的唾液酸糖肽SGP浓缩液和硅藻土依次加入到有机溶剂中，搅拌均匀后过滤，收集滤饼，然后通过纯水多次超声溶解滤饼，过滤，合并滤液，得到唾液酸糖肽SGP第一次重结晶粗品水溶液；

S4：重复步骤S3，得到唾液酸糖肽SGP粗品水溶液；

S5：将唾液酸糖肽SGP粗品水溶液浓缩后过滤，制备成液相上样液，然后利用C18柱进行洗脱，浓缩、冻干，收集得到唾液酸糖肽SGP纯品。

在本发明的较佳实施方式中，步骤S1中，80kg蛋黄粉通过多次采用150～500L的第一提取液进行超声提取，所述第一提取液为无水乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂，且无水乙醇和乙酸乙酯的体积比为V

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S2中，所述滤饼通过多次采用150～500L的第二提取液进行超声提取，所述第二提取液为20～60％乙醇水溶液。

在本发明的另一较佳实施方式中，超声提取时，超声功率设置为2kw～20kw之间，超声温度20～40℃，超声频率20～50kHz，超声时长20～60min；且步骤S1-S3中，过滤时均采用5μm滤膜正压过滤。

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S2中，所述唾液酸糖肽SGP浓缩液的体积为10～30L。

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S3中，所述有机溶剂为甲醇和乙醇的混合溶剂，且甲醇和乙醇的体积比为V

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S3中，通过纯水多次超声溶解滤饼具体包括如下步骤：先用5～20L纯水超声溶解滤饼，过滤，收集滤液，然后滤饼再次用2～10L纯水超声溶解，过滤，合并两次滤液。

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S5中，将唾液酸糖肽SGP粗品水溶液浓缩后过滤，制备成液相上样液，具体包括：将唾液酸糖肽SGP粗品水溶液用旋转蒸发仪浓缩至1～5L，旋蒸水浴温度20～45℃，真空度高于-0.095MPa，再使用0.45μm滤膜过滤，制备成液相上样液。

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S5中，C18柱使用的硅胶粒径为50～100μm，用量2～10kg，装柱后柱高10～40cm；对C18柱进行洗脱前，分别使用3倍柱体积的纯甲醇和3倍柱体积的纯水交替冲洗活化C18，待活化完毕后再将上样液上样到C18柱内。

在本发明的另一较佳实施方式中，

步骤S5中，上样液单次上样20～800ml，使用有机溶剂水溶液进行线性梯度洗脱，所述有机溶剂水溶液中有机溶剂浓度为0～20％，洗脱时的流速为20～1000ml/min，有机溶剂选自甲醇或乙腈，梯度洗脱程序为：从上样后梯度洗脱的有机溶剂浓度由0％线性逐步增加，直至有机溶剂浓度达到20％，总洗脱时间为30～120min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的唾液酸糖肽SGP的工业化生产方法，在提取过程中，超声代替传统机械搅拌，缩短时间不仅效率提升并且效果更好，且使用无水乙醇和乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂进行提取，替代了传统的苯酚、丙酮等具有较大毒性的溶剂，具有降低毒性作用的优点；

2、本发明在纯化过程中，采用结晶与反相制备设备结合，实现产品的大量富集，制备出的唾液酸糖肽SGP具有产量高、纯度高的优点；

3、本发明可以在较短时间内生产大量高纯度唾液酸糖肽，工艺简单且便于工业化生产，避免了使用高毒性有机试剂，全部工艺流程均可由自动化机械完成，全工艺流程仅需7天，可单批次生产百克级95％以上纯度SGP。

附图说明

图1为本发明提供的唾液酸糖肽的结构示意图；

图2为采用本发明实施例1的生产方法制备得到的唾液酸糖肽的HPLC谱图；

图3为采用本发明实施例2的生产方法制备得到的唾液酸糖肽的HPLC谱图；

图4为采用本发明实施例3的生产方法制备得到的唾液酸糖肽的HPLC谱图；

图5为采用本发明对比例1的生产方法制备得到的唾液酸糖肽的HPLC谱图；

图6为采用本发明对比例2的生产方法制备得到的唾液酸糖肽的HPLC谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优势更加清楚，以下结合实施例对本发明进行进一步说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1：

(1)称量80kg市售蛋黄粉，加入1000L超声提取罐中，加入400L无水乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂(V

(2)得到的滤饼，加入1000L超声提取罐中，加入40％乙醇水溶液400L，打开超声发生器，功率设置为9kw，超声温度30℃，超声频率25kHz，超声时长45min。超声结束后，使用5μm滤膜的正压过滤器进行固液分离。收集滤液，得到的滤饼再次投入超声提取罐中，加入同样的乙醇水溶液，重复上述超声步骤并过滤，废弃滤饼，合并两次滤液得到SGP提取液。

(3)SGP提取液使用纳滤机进行浓缩，浓缩至20L。

(4)浓缩SGP提取液加入100L混合有机溶剂进行重结晶，该有机溶剂为甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(5)SGP第一次重结晶粗品水溶液加75L甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(6)SGP粗品水溶液用旋转蒸发仪浓缩至4L，旋蒸水浴温度33℃，真空度高于-0.095MPa。再使用0.45μm滤膜过滤，制得制备液相上样液。制备液相选择DAC200型号，使用C18填料，粒径50～100μm，用量4kg，装柱后柱高20cm。

(7)装柱后，分别使用3倍柱体积的纯甲醇和3倍柱体积的纯水交替冲洗活化C18，活化完毕后上样。单次上样400ml，使用纯水、有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，有机溶剂为乙腈，有机溶剂水溶液中有机溶剂浓度为0～10％线性梯度，流速500ml/min。高纯度SGP随1.5～5％乙腈水溶液洗脱出来，经过纳滤或旋蒸浓缩后冻干，得到纯度为95.49％的SGP固体粉末56.0g。

实施例2：

(1)称量80kg市售蛋黄粉，加入1000L超声提取罐中，加入500L无水乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂(V

(2)得到的滤饼，加入1000L超声提取罐中，加入20％乙醇水溶液400L，打开超声发生器，功率设置为5kw，超声温度20℃，超声频率50kHz，超声时长60min。超声结束后，使用5μm滤膜的正压过滤器进行固液分离。收集滤液，得到的滤饼再次投入超声提取罐中，加入同样的乙醇水溶液，重复上述超声步骤并过滤，废弃滤饼，合并两次滤液得到SGP提取液。

(3)SGP提取液使用纳滤机进行浓缩，浓缩至30L。

(4)浓缩SGP提取液加入120L混合有机溶剂进行重结晶，该有机溶剂为甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(5)SGP第一次重结晶粗品水溶液加100L甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(6)SGP粗品水溶液用旋转蒸发仪浓缩至5L，旋蒸水浴温度25℃，真空度高于-0.095MPa。再使用0.45μm滤膜过滤，制得制备液相上样液。制备液相选择DAC100型号，使用C18填料，粒径50～100μm，用量1kg，装柱后柱高30cm。

(7)装柱后，分别使用3倍柱体积的纯甲醇和3倍柱体积的纯水交替冲洗活化C18，活化完毕后上样。单次上样100ml，使用纯水、有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，有机溶剂为甲醇，有机溶剂水溶液中有机溶剂浓度为0～20％线性梯度，流速100ml/min。高纯度SGP随2.5～8％甲醇水溶液洗脱出来，经过纳滤或旋蒸浓缩后冻干，得到纯度为91.81％的SGP固体粉末50.8g。

实施例3：

(1)称量80kg市售蛋黄粉，加入1000L超声提取罐中，加入200L无水乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂(V

(2)得到的滤饼，加入1000L超声提取罐中，加入50％乙醇水溶液200L，打开超声发生器，功率设置为20kw，超声温度30℃，超声频率20kHz，超声时长30min。超声结束后，使用5μm滤膜的正压过滤器进行固液分离。收集滤液，得到的滤饼再次投入超声提取罐中，加入同样的乙醇水溶液，重复上述超声步骤并过滤，废弃滤饼，合并两次滤液得到SGP提取液。

(3)SGP提取液使用纳滤机进行浓缩，浓缩至10L。

(4)浓缩SGP提取液加入100L混合有机溶剂进行重结晶，该有机溶剂为甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(5)SGP第一次重结晶粗品水溶液加100L甲醇和乙醇的混合溶剂(V

(6)SGP粗品水溶液用旋转蒸发仪浓缩至1.6L，旋蒸水浴温度30℃，真空度高于-0.095MPa。再使用0.45μm滤膜过滤，制得制备液相上样液。制备液相选择DAC200型号，使用C18填料，粒径50～100μm，用量6kg，装柱后柱高30cm。

(7)装柱后，分别使用3倍柱体积的纯甲醇和3倍柱体积的纯水交替冲洗活化C18，活化完毕后上样。单次上样800ml，使用纯水、有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，有机溶剂为乙腈，有机溶剂水溶液中有机溶剂浓度为0～20％线性梯度，流速300ml/min。高纯度SGP随1.2～4.5％乙腈水溶液洗脱出来，经过纳滤或旋蒸浓缩后冻干，得到纯度为90.71％的SGP固体粉末54.0g。

对比例1

(1)称量2kg市售蛋黄粉，加入10L圆底烧瓶中，加入4L无水乙醇和2L乙醚，机械搅拌16h，转速800-1000rpm。搅拌结束后，使用滤纸和布氏漏斗进行负压抽滤。得到的滤饼用2L乙醚冲洗，抽干后再次投入10L圆底烧瓶中，加入6L无水乙醇，机械搅拌过夜，转速800-1000rpm，重复上述搅拌步骤并过滤，收集滤饼得到脱脂蛋黄粉。

(2)得到的滤饼，加入10L圆底烧瓶中，加入50％乙醇水溶液6L，机械搅拌16h，转速800-1000rpm。搅拌结束后，使用滤纸和布氏漏斗进行负压抽滤。收集滤液，得到的滤饼再次投入圆底烧瓶中，加入同样的乙醇水溶液，重复上述搅拌步骤并过滤，废弃滤饼，合并两次滤液得到SGP提取液。

(3)SGP提取液使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至500mL。

(4)向柱子中加入2cm厚度的硅藻土粉末，再往柱子里加入100mL的0.1％TFA水溶液，摇匀后，用空气泵压实压干。称量550g活性炭粉末和550g硅藻土粉末，用2L的0.1％TFA水溶液将活性炭和硅藻土混合均匀，充分搅匀，倒入柱子中，用空气泵压实压干。向柱子中加入2cm厚度的硅藻土粉末，再往柱子里面加入100mL的0.1％TFA水溶液，轻摇柱子使硅藻土混匀，用空气泵压实压干。柱子活化方法为：用8L的0.1％TFA水溶液冲柱子来进行活化。

(5)SGP浓缩提取液上样于活化好的活性炭柱，按顺序分别使用3L的水(含0.1％TFA)、5％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、10％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、25％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、30％乙腈水溶液(含0.1％TFA)洗脱，SGP样品集中在30％乙腈水溶液馏分中。

(6)上一步所得SGP溶液用旋转蒸发仪浓缩至1L，旋蒸水浴温度30℃，真空度高于-0.095MPa。再冻干得到SGP粗品粉末。

(7)P2填料用开水活化，后装柱，直径3cm，高度120cm，待柱子压实后，用50mM的碳酸氢铵溶液平衡后上样纯化样品。

(8)取冻干的SGP粗品粉末，用2mol/L的碳酸氢铵溶解后，12000rpm离心3min，上清进行上样，用50mM碳酸氢铵洗脱，收集含SGP馏分。

(9)P2洗脱的含SGP馏分用旋转蒸发仪浓缩后冻干，可以得到1.2g纯度为58.82％的SGP粉末。

对比例2

(1)称量2kg市售蛋黄粉，加入10L圆底烧瓶中，加入6L苯酚，机械搅拌16h，转速800-1000rpm。搅拌结束后，使用高速离心机进行固液分离，转速8000rpm，时长20min。得到的离心沉淀用2L苯酚冲洗，抽干后再次投入10L圆底烧瓶中，加入6L苯酚，机械搅拌过夜，转速800-1000rpm，重复上述搅拌步骤并离心，收集离心沉淀得到脱脂蛋黄粉。

(2)得到的滤饼，加入10L圆底烧瓶中，加入纯水6L，机械搅拌16h，转速800-1000rpm。搅拌结束后，使用高速离心机进行固液分离，转速8000rpm，时长20min。收集离心上清，得到的离心沉淀再次投入圆底烧瓶中，加入6L纯水，重复上述搅拌步骤并离心，废弃离心沉淀，合并两次上清得到SGP提取液。

(3)SGP提取液使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至500mL。

(4)G50填料用开水活化，后装柱，直径3cm，高度120cm，待柱子压实后上样SGP浓缩提取液。用纯水洗脱，收集含SGP馏分。所得SGP溶液用旋转蒸发仪浓缩至1L，旋蒸水浴温度30℃，真空度高于-0.095MPa。再冻干得到SGP粗品粉末。

(5)向柱子中加入2cm厚度的硅藻土粉末，再往柱子里加入100mL的0.1％TFA水溶液，摇匀后，用空气泵压实压干。称量550g活性炭粉末和550g硅藻土粉末，用2L的0.1％TFA水溶液将活性炭和硅藻土混合均匀，充分搅匀，倒入柱子中，用空气泵压实压干。向柱子中加入2cm厚度的硅藻土粉末，再往柱子里面加入100mL的0.1％TFA水溶液，轻摇柱子使硅藻土混匀，用空气泵压实压干。柱子活化方法为：用8L的0.1％TFA水溶液冲柱子来进行活化。

(6)SGP浓缩提取液上样于活化好的活性炭柱，按顺序分别使用3L的水(含0.1％TFA)、5％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、10％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、25％乙腈水溶液(含0.1％TFA)、30％乙腈水溶液(含0.1％TFA)洗脱，SGP样品集中在30％乙腈水溶液馏分中。

(7)活性炭柱洗脱的含SGP馏分用旋转蒸发仪浓缩后冻干，可以得到0.9g纯度为65.74％的SGP粉末。

下面为本发明实施例1-3与对比例1-2的对比总表，如下表1所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。