一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法和应用

本申请要求优先权，在先申请的申请号为：CN202211428293.4，名称：一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法和应用，优先权日，2022年11月15日。

技术领域

本发明属于海洋医药生物新材料领域，具体公开了一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法和应用。

背景技术

目前临床上给药途径多样。其中常见的给药途径有皮下注射、静脉注射、口服、涂抹等。从本质上来说，药物的给药途径，同临床各类病症的治疗效果，有着极为紧密的联系，同一种药物，若给药途径不同，其药效有时有着极为巨大的差别。随着科学技术发展，药物剂型给使用带来更多方便，医生需根据药物性质及治疗目的，合理选择用药方式。药物的物理和化学性质为药物在剂型的制备中药用辅料的应用配伍提供依据。药用辅料可溶解、混悬、增稠、稀释、乳化、稳定、保护、着色、矫味或改观药物使之形成有效而适宜的药物制剂。生物药剂学认为药物的分布与疗效有着极为密切的关系，同时亦与药物在组织内的蓄积及不良反应有关。如生物黏附给药系统(BDDS)是现代给药剂型中的一个新分支，按制剂作用于人体组织部位不同可分为口腔黏附制剂、鼻腔黏附制剂、胃肠道口服黏附制剂、眼部黏附制剂、子宫及阴道黏附制剂、直肠黏附制剂等多种剂型。不同给药途径可以影响药物吸收的量和速度，吸收速度比较如下：静脉注射>吸入注射>肌内注射>皮下注射>黏膜>口服>皮肤。

口腔黏膜作为全身用药途径主要分为颊黏膜吸收和舌下黏膜吸收。舌下黏膜渗透能力强，药物吸收迅速，给药方便，许多口服首过作用强或在胃肠道中易降解的药物，如甾体激素、硝酸甘油、二硝酸异山梨酯舌下给药生物利用度显著提高。易受唾液冲洗作用影响、保留时间短是舌下给药的主要缺点。因而舌下片剂要求药物溶出速度快、剂量小、作用强。颊黏膜能够避免肝脏的首过效应，避免胃肠道中的酶解和酸解作用，且受口腔中唾液冲洗作用影响小，能够在黏膜上保持相当长时间，有利于多肽、蛋白质类药物吸收，有利于控释制剂释放。

目前，针对颊黏膜途径开发的药物形式主要有颊黏膜黏附膜(mucoadhesivebuccal films,MBFs)、喷涂剂、脂质体和纳米乳液等。MBFs能够在避免胃肠道首过效应，改善生物利用度的基础上提高顺应性，并能随时终止给药，制备难度低，成为最具产业化前景的颊黏膜给药系统。

成膜材料在MBFs中作为药物载体，并在湿环境下提供黏附性能。目前，解释成膜材料黏附性的理论有电子理论、扩散理论、吸附理论、润湿理论、脱水理论等。第1代黏附聚合物，如纤维素类、胶类等在湿环境下通过氢键、疏水力、静电力作用，以非共价形式黏附于黏液，依赖黏液周转率，因此黏附时间短。第2代黏附聚合物，如接枝凝集素、甘露醇的新型聚合物，通过“受体—配体”作用黏附于细胞表面，增强黏附性能。羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)、果胶、聚丙烯酸等阴离子聚合物由于高黏附性和低毒性，已成为使用最广泛的MBFs载体。目前的MBFs还存在药物渗透性低，施用部位黏附时间短，体内外相关性差等问题亟待解决。

壳聚糖为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，在虾蟹等海洋节肢动物的甲壳、昆虫的甲壳、软体动物和环节动物的壳和骨骼及真菌类和少数海藻的细胞壁中都存在甲壳素物质。甲壳素在自然界分布广泛，储量仅居于纤维素之后，是第二大天然高分子，每年甲壳素生物合成的量约有100亿吨，是一种可循环的再生资源，取之不尽、用之不竭，这些天然聚合物主要分布在沿海地区，壳聚糖已经商业化生产。甲壳素(几丁质)、壳聚糖、纤维素三者具有相近的化学结构，纤维素在C2位上是羟基，甲壳素、壳聚糖在C2位上分别被一个乙酰氨基和氨基所代替，甲壳素和壳聚糖具有生物降解性、细胞亲和性和生物效应等许多独特的性质，尤其是含有游离氨基的壳聚糖，是天然多糖中唯一的碱性多糖。壳聚糖分子结构中的氨基基团比甲壳素分子中的乙酰氨基基团反应活性更强，使得该多糖具有优异的生物学功能并能进行化学修饰反应。因此，壳聚糖被认为是比纤维素具有更大应用潜力的功能性生物材料。

海洋中壳聚糖资源是如此丰富，现有专利中大多将壳聚糖用于口服制剂，如CN202111183969.3一种离子乳化剂壳聚糖纳米粒修饰的槲皮素口服缓释制剂及其制备方法；或者肠道黏膜修复剂，如CN202111347477.3一种肠道黏膜修复及黏膜免疫功能改善的药物及制备方法；经由滴鼻、喷雾或者支气管镜滴入的疫苗递送系统，如CN201710942135.3甘露糖化壳聚糖递送系统组装的结核黏膜基因疫苗。而目前将壳聚糖用于颊黏膜黏附膜方面的专利还较少，如何利用并增强壳聚糖的生理活性，解决上述MBFs药物渗透性低,储药量小，施用部位黏附力小，黏附时间短方面的缺点，需要进一步的研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一个目的在于，提供一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法，所述的壳聚糖材料具有载药量大，唾液中膨胀系数小，遇唾液黏附力衰减小，黏附时间长，具有作为口腔黏膜给药的候选新材料的潜力。

本发明的另一个目的在于，公开上述壳聚糖材料在制备用于贴敷于口腔颊黏膜的长效释放药物制剂，尤其是一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂中的应用。

为达到上述第一个目的，本发明采取以下的技术方案：

一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.壳聚糖预处理：称取壳聚糖投入含有质量分数为1-3％氢氧化钠溶液中超声波清洗10-20min，随后放入0.5-1％的冰醋酸溶液中，对壳聚糖溶液进行抽滤，然后用95％以上乙醇沉淀洗涤，干燥获得壳聚糖原料，所述的壳聚糖原料的脱乙酰度为90～95％、平均分子量为20000-25000Da；

S2.壳聚糖的改性：将壳聚糖原料与质量分数1-3％盐酸溶液加入反应容器，所述壳聚糖原料与所述盐酸溶液的质量体积比为1g：25-50mL；冰水浴控制反应温度在0～5℃；在搅拌的状态下加入适量的改性大豆磷脂和改性双醛淀粉；滴加完毕后撤去冰水浴，在室温下持续搅拌反应2～4h；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到改性壳聚糖；其中所述壳聚糖原料、改性大豆磷脂和改性双醛淀粉的质量比为1：(0.1～0.2)：(0.02～0.3)；

S3.壳聚糖交联：将上述改性壳聚糖溶解在醋酸溶液中，制备成60-100mg/mL的改性壳聚糖溶液，并调节pH值至5.5-6.5；将3-6mg/mL的六偏磷酸钠溶液按照1:(1.0-1.5)的体积比逐滴滴入所述改性壳聚糖溶液中加入终浓度2-20mg/mL稳定剂；所述稳定剂选自黄原胶、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素中的一种或一种以上的组合，形成交联后稳定的壳聚糖溶液；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到所述适于黏膜给药的壳聚糖材料。

在口腔黏膜给药时过高的溶胀率和吸水性会导致患者的不适，同时导致药物释放过快，以及凝胶层机械性能下降，溶解，因此本技术方案通过对壳聚糖进行改进后与明胶混合，降低了溶胀率和吸水性，缩小了孔径，提高了机械强度，使得其更适合口腔黏膜给药使用。

优选的，所述步骤S2或S3中的重结晶是指将抽滤得到的固体进行干燥后，用无水乙醇进行重结晶。乙醇沸点不是很高,结晶后可以比较容易的除去，并且乙醇价格便宜。

一种适于黏膜给药的壳聚糖材料，由上述的方法制备。

上述适于黏膜给药的壳聚糖材料在制备用于贴敷于口腔颊黏膜的长效释放药物制剂中的应用。

优选的，所述长效释放药物制剂选自口腔用抗菌药物制剂、稳定血糖的药物制剂、抗精神分裂药物制剂中的一种。口腔抗菌药物制剂，稳定血糖制剂以及抗精神分裂药物制剂，都要求药物稳定而缓慢的释放，非常适合本发明的特性。

根据本发明的第二个目的，本发明提供一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括上述的壳聚糖材料和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽包含如SEQ IDNO：1＝RRFPSRLSSSPLGLRLFILLSWLLF所示的氨基酸序列。

优选的，所述抗菌肽在N端融合有如SEQ ID NO：2＝GRRRRRRRRRPPQ所示的穿膜肽序列，最终抗菌肽的完整序列如SEQ ID NO：3＝GRRRRRRRRRPPQRRFPSRLSSSPLGLRLFILLSWLLF所示。加上穿膜肽后，抗菌肽穿膜能力增加，对真核细菌的抑菌作用增加。

优选的，所述抗菌肽在完整序列位点的N3、N14、N21、N29进行点突变，所述突变分别为R3-H3、R14-K14、S21-K21、L29-R29；最终获得抗菌肽突变序列如SEQ ID NO：4＝GRHRRRRRRRPPQKRFPSRLKSSPLGLRRFILLSWLLF所示。经计算机预测，结合发明人掌握的结构生物学知识，对上述位点进行突变，暴露活性位点SPLG，在一些实施例中，可以观察到其抑菌性能增强。

进一步的，本发明还公开了上述适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂的制备方法，包括以下步骤：配置质量分数20-25％的明胶溶液，加热至60-70℃，持续搅拌，将壳聚糖材料按照质量比1:5-10加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂。上述制备方便温和简单，也可以同时加入适合药用的各种辅料或者矫味剂。

优选的，所述壳聚糖材料、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量比为1:(0.2-0.4)：(0.02-0.03)。马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST通过引入强极性反应性基团，使材料具有高的极性和反应活性，能较好的接枝在壳聚糖上，并且吸附抗菌肽。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述的抗菌贴剂的凝胶层其溶胀率相比未改性处理壳聚糖，其溶胀率和吸水性下降，机械强度增高。与一般的认为溶胀率高相反，在口腔黏膜给药时过高的溶胀率和吸水性会导致患者的不适，同时导致药物释放过快，以及凝胶层机械性能下降，溶解，因此本发明通过对壳聚糖进行改进后与明胶混合，降低了溶胀率和吸水性，缩小了孔径，提高了机械强度，使得其更适合口腔黏膜给药使用。本发明所述的壳聚糖制备的抗菌贴剂，对于口腔常见的口腔链球菌、卡氏口腔杆菌、白色念珠菌均有很强的抑菌能力、贴剂贴敷牢固，其抗菌肽释放率缓慢而持久，可以满足一天一次给药的需要，具有重大的药用潜力。

附图说明

附图1凝胶层性能对比测试图；

附图2实施例4-6制备的抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)；

附图3抗菌贴剂抗菌肽释放率；

附图4抗菌贴剂临床使用评价。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如克劳泽·施韦特利克(Klaus Schwetlick)等编写的《有机合成实验室手册》和J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

改性大豆磷脂：购自西安达尔闻生物科技有限公司，为羟化卵磷脂(modifiedsoybeanphospholipids)，货号OP-10；

改性双醛淀粉：购自武汉克米克生物医药技术有限公司，英文名：dialdehydestarch，CAS号9047-50-1；

壳聚糖：购自江苏奥福生物科技有限公司，CAS号9012-76-4。

马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST购自南京百慕达生物科技有限公司，货号HD900P，规格25kg。

实施例1

壳聚糖材料的制备

一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法，包括以下步骤：

S1.壳聚糖预处理：称取壳聚糖(购自aladdin-e试剂网，中粘度,200-400mPa.s，货号C105802-500g)投入含有质量分数为1％氢氧化钠溶液中超声波清洗10min，壳聚糖与盐酸溶液的质量体积比为1g：20mL；随后将上述溶液与等体积0.5％的冰醋酸溶液混合，对壳聚糖溶液进行抽滤，然后用96％乙醇沉淀洗涤，干燥获得壳聚糖原料，所述的壳聚糖原料的脱乙酰度为90％、平均分子量为20000Da；

S2.壳聚糖的改性：将上述壳聚糖原料100g与质量分数1％盐酸溶液加入反应容器，所述盐酸溶液的体积为2500mL；冰水浴控制反应温度在0～5℃；在搅拌的状态下加入10g改性大豆磷脂和2g改性双醛淀粉；滴加完毕后撤去冰水浴，在室温下持续搅拌反应2h；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到改性壳聚糖；

S3.壳聚糖交联：将上述改性壳聚糖溶解在醋酸溶液中，制备成60mg/mL的改性壳聚糖溶液，并调节pH值至5.5-6.5；将3mg/mL的六偏磷酸钠溶液按照1:1的体积比逐滴滴入所述改性壳聚糖溶液中，加入终浓度2mg/mL的稳定剂黄原胶，形成交联后的壳聚糖溶液；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到所述适于黏膜给药的壳聚糖材料85g。

实施例2

壳聚糖材料的制备

一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法，包括以下步骤：

S1.壳聚糖预处理：取壳聚糖((购自aladdin-e试剂网，中粘度,200-400mPa.s，货号C105802-500g))投入含有质量分数为2％氢氧化钠溶液中超声波清洗15min，壳聚糖与盐酸溶液的质量体积比为1g：15mL；随后放入等体积0.75％的冰醋酸溶液中，对壳聚糖溶液进行抽滤，然后用96％乙醇沉淀洗涤，干燥获得壳聚糖原料，所述的壳聚糖原料的脱乙酰度为92％、平均分子量为23000Da；

S2.壳聚糖的改性：将上述壳聚糖原料100g与质量分数1-3％盐酸溶液加入反应容器，所述盐酸溶液的体积为4000mL；冰水浴控制反应温度在0～5℃；在搅拌的状态下加入15g改性大豆磷脂和3g改性双醛淀粉；滴加完毕后撤去冰水浴，在室温下持续搅拌反应3h；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到改性壳聚糖；

S3.壳聚糖交联：将上述改性壳聚糖溶解在醋酸溶液中，制备成80mg/mL的改性壳聚糖溶液，并调节pH值至6；将4.5mg/mL的六偏磷酸钠溶液按照1:1.2的体积比逐滴滴入所述改性壳聚糖溶液中，加入终浓度5mg/mL的稳定剂羟丙甲纤维素，形成交联后的壳聚糖溶液；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到所述适于黏膜给药的壳聚糖材料91g，经过显微镜观察到相比改性前的壳聚糖原料，经过改性和交联之后的壳聚糖材料孔隙增多，单个孔隙孔径变小，更加致密，整体孔隙率增大。

所述步骤S2或S3中的重结晶是指将抽滤得到的固体进行干燥后，用无水乙醇进行重结晶。

实施例3

壳聚糖材料的制备

一种适于黏膜给药的壳聚糖材料的制备方法，包括以下步骤：

S1.壳聚糖预处理：称取壳聚糖((购自aladdin-e试剂网，中粘度,200-400mPa.s，货号C105802-500g))投入含有质量分数为3％氢氧化钠溶液中超声波清洗20min，壳聚糖与盐酸溶液的质量体积比为1g：10mL；随后放入等体积1％的冰醋酸溶液中，对壳聚糖溶液进行抽滤，然后用96％乙醇沉淀洗涤，干燥获得壳聚糖原料，所述的壳聚糖原料的脱乙酰度为95％、平均分子量为25000Da；

S2.壳聚糖的改性：将壳聚糖原料100g与质量分数3％盐酸溶液加入反应容器，所述盐酸溶液的体积为5000mL；冰水浴控制反应温度在0～5℃；在搅拌的状态下加入20g改性大豆磷脂和4g改性双醛淀粉；滴加完毕后撤去冰水浴，在室温下持续搅拌反应2～4h；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到改性壳聚糖；

S3.壳聚糖交联：将上述改性壳聚糖溶解在醋酸溶液中，制备成100mg/mL的改性壳聚糖溶液，并调节pH值至6.5；将6mg/mL的六偏磷酸钠溶液按照1:1.5的体积比逐滴滴入所述改性壳聚糖溶液中，加入终浓度20mg/mL的稳定剂(羟丙甲纤维素和羧甲基纤维素钠1:1混合)，形成交联后的壳聚糖溶液；经静置、沉淀、抽滤、干燥、重结晶得到所述适于黏膜给药的壳聚糖材料98g。

实施例4

抗菌贴剂的制备

一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括上述的壳聚糖材料和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽序列为＝SEQ ID NO：1＝RRFPSRLSSSPLGLRLFILLSWLLF；

上述适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂的制备方法，包括以下步骤：配置质量分数20％的明胶溶液，加热至60℃，持续搅拌，将实施例2制备的壳聚糖材料按照质量比1:5加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂；

所述壳聚糖材料、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量分别为10g、2g、0.2g。

实施例5

抗菌贴剂的制备

一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括上述的壳聚糖材料和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽序列为SEQ ID NO：3＝GRRRRRRRRRPPQRRFPSRLSSSPLGLRLFILLSWLLF；

配置质量分数23％的明胶溶液，加热至65℃，持续搅拌，将壳聚糖材料按照质量比1:8加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂；

所述壳聚糖材料、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量比为10g、3g、0.25g。

实施例6

抗菌贴剂的制备

一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括上述的壳聚糖材料和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽序列为SEQ ID NO：4＝GRHRRRRRRRPPQKRFPSRLKSSPLGLRRFILLSWLLF；即对实施例5所述的序列进行点突变，所述抗菌肽在完整序列位点的N3、N14、N21、N29进行点突变，所述突变分别为R3H、R14K、S21K、L29R使用AmberTools里面的tLEaP工具构建多肽的动态3D建模，亲水环境中穿膜肽与抗菌肽折叠较为靠近，经过突变，将抗菌肽的活性位点SPLG暴露出来，理论上能提高其抗菌能力。

配置质量分数25％的明胶溶液，加热至70℃，持续搅拌，将壳聚糖材料按照质量比1:10加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂；

所述壳聚糖材料、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量比为10g、4g、0.3g。

对比例1

抗菌贴剂的制备

一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括壳聚糖(壳聚糖为实施例2中步骤S1制备的壳聚糖原料)和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽序列为SEQ ID NO：4＝GRHRRRRRRRPPQKRFPSRLKSSPLGLRRFILLSWLLF；

配置质量分数23％的明胶溶液，加热至65℃，持续搅拌，将壳聚糖按照质量比1:8加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂；

所述壳聚糖材料、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量比为10g、3g、0.25g。

对比例2

抗菌贴剂的制备

一种适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，包括壳聚糖(壳聚糖为实施例2中步骤S2制备的改性壳聚糖)和接枝在所述壳聚糖材料表面的抗菌肽；所述抗菌肽序列为SEQ ID NO：4＝GRHRRRRRRRPPQKRFPSRLKSSPLGLRRFILLSWLLF；配置质量分数23％的明胶溶液，加热至65℃，持续搅拌，将壳聚糖按照质量比1:8加入所述明胶溶液中，待温度冷却至50摄氏度以下时，加入马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和抗菌肽，继续搅拌至常温凝固，涂布于背衬层，形成凝胶层，烘干得到所述抗菌贴剂；

所述壳聚糖、马来酸酐接枝相容剂PP-g-ST和所述抗菌肽的质量比为10g、3g、0.25g。

测试例1

抗菌贴剂的凝胶层的溶胀率和吸水性能测试

对实施例4-6以及对比例1-2制备的适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂的凝胶层(0.5mm)，进行人工唾液(购自AMEKO货号RC56877)中的溶胀率和吸水性以及机械强度实验对比，实验在模拟人体的36摄氏度温度下进行，试验方法参照论文：不同分子量壳聚糖微凝胶的制备及溶胀性能研究《赤峰学院学报(自然科学版)》,以及凝胶强度测定国标。结果见下表1和附图1所示。

表1凝胶层性能对比测试

从表1的数据可以看出，经过改性之后，本发明所述的抗菌贴剂的凝胶层其溶胀率相比未改性处理壳聚糖，其溶胀率和吸水性下降，机械强度增高。与一般的认为溶胀率高相反，在口腔黏膜给药时过高的溶胀率和吸水性会导致患者的不适，同时导致药物释放过快，以及凝胶层机械性能下降，溶解，因此本发明通过对壳聚糖进行改进后与明胶混合，降低了溶胀率和吸水性，缩小了孔径，提高了机械强度，使得其更适合口腔黏膜给药使用。

测试例2

对实施例4-6制备的抗菌肽进行抗菌测试

将样品用微量肉汤稀释法测试其抗菌效果，具体方法为：先配制浓度为4mg/mL的抗菌肽样品，在96孔板中的每个孔板预先加上100μL肉汤，然后第一列孔加100μL样品原液，将第一列溶液混匀，然后取出100μL加入到第二列孔，再混匀，再从第二列取出100μL加入到第三列，以此类推，到第十列混匀后把多余的100μL吸出弃掉，样品逐级稀释完后在每个孔里加入浓度为10

表2实施例4-6制备的抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)

测试例3

对实施例4-6以及对比例1-2制备的适于口腔颊黏膜给药的抗菌贴剂，浸没于人工唾液中，37℃，0h、1h、2h、4h、8h、16h、32h测试其抗菌肽的释放率。结果见表3和附图3所示。表面使用了本发明所述的壳聚糖制备的抗菌贴剂，其抗菌肽释放率缓慢而持久，可以满足一天一次给药的需要，具有重大的药用潜力。

表3抗菌贴剂抗菌肽释放率

测试例4

口腔炎患者实验。

在医院门诊选择口腔溃疡志愿者平均分成6组，每组30人，分别给实施例4-6、对比例1-2、阴性对照(使用实施例4的工艺制备，不含有抗菌肽)、上述贴剂面积2x2cm，贴于两颊黏膜。阳性对照(市售咪康唑贴剂-诺弥可，说明书临床用量)，使用1天后，分析每组患者唾液中口腔菌落(口腔链球菌、卡氏口腔杆菌、白色念珠菌)总数量。结果见表4和附图4所示。

表4抗菌贴剂临床使用评价

从上表4的结果可以看出，本发明实施例4-6制备的抗菌贴剂，贴剂贴敷牢固，优于阳性对照，并大大优于对比例1-2，并且其抗菌性能依次增加，说明实施例5加入的穿膜肽和实施例6进行的点突变，均增强了抗菌肽的抗菌能力。

综合上述实施例可以看出，本发明所述的抗菌贴剂的凝胶层其溶胀率相比未改性处理壳聚糖，其溶胀率和吸水性下降，机械强度增高。与一般的认为溶胀率高相反，在口腔黏膜给药时过高的溶胀率和吸水性会导致患者的不适，同时导致药物释放过快，以及凝胶层机械性能下降，溶解，因此本发明通过对壳聚糖进行改进后与明胶混合，降低了溶胀率和吸水性，缩小了孔径，提高了机械强度，使得其更适合口腔黏膜给药使用。本发明所述的壳聚糖制备的抗菌贴剂，对于口腔常见的口腔链球菌、卡氏口腔杆菌、白色念珠菌均有很强的抑菌能力、贴剂贴敷牢固其抗菌肽释放率缓慢而持久，可以满足一天一次给药的需要，具有重大的药用潜力。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及说明书内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。