用于共同递送尿苷和酮亮氨酸的组合物和化合物

背景技术

年龄相关神经肌肉功能障碍是若干种主要疾病病状的基础，包含肌肉减少症和肌肉失用性萎缩。这两种病状均涉及肌肉和神经系统中的能量代谢受损以及肌肉质量的损失。对这些病状的满意治疗应当解决两种致病因素，即能量代谢缺陷和肌肉蛋白质损失。

用于治疗目的的尿苷口服递送受限于其低生物利用度，在人类和小鼠两者中的生物利用度为大约7％。已经发现，尿苷的酯前药可提高其生物利用度，但仅一种2',3',5,-三-O-乙酰尿苷(或尿苷三乙酸酯)被发现足以递送用于一些临床目的的足够尿苷。口服尿苷三乙酸酯的生物利用度已被测量为大约50％(Ashour 1996)。

发明内容

本发明提供了化合物5'-O-酮亮氨酰-2',3'-二-O-乙酰尿苷，其也被称为2',3'-二-O-乙酰基-5'-O-(α-酮异己酰基)尿苷。本发明还提供了一种组合物，其包括治疗有效量的酮亮氨酸化合物和尿苷前药的组合。

本发明提供了用于治疗或预防肌肉减少症(以及其它肌肉萎缩病状，如恶病质)、肌力减少症(病理性肌肉力量减弱)、运动不耐症(运动期间的耐力病理性降低)和肌肉失用性萎缩的组合物、化合物和方法。还涵盖与肌肉萎缩和运动不耐症的高风险相关的病状，所述病状包含慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性心力衰竭。具体地，提供了递送治疗量的尿苷和酮亮氨酸两者的组合物和化合物。

附图说明

图1：用3-NP、UTA和NaKL处理的小鼠的存活率

第1组：4％ UTA饮食，NaCl饮用水

第2组：4％ UTA饮食，NaKL饮用水

第3组：饲料饮食，常规饮用水，UTA/NaCl管饲

第4组：饲料饮食，常规饮用水，UTA/NaKL管饲

第5组：饲料饮食，NaKL饮用水，UTA管饲

图2：用3-NP、UTA和NaKL处理的小鼠的体重减轻百分比

第1组：4％ UTA饮食，NaCl饮用水

第2组：4％ UTA饮食，NaKL饮用水

第3组：饲料饮食，常规饮用水，UTA/NaCl管饲

第4组：饲料饮食，常规饮用水，UTA/NaKL管饲

第5组：饲料饮食，NaKL饮用水，UTA管饲

具体实施方式

酮亮氨酸(α-酮异己酸；4-甲基-2-氧代戊酸酯；KL)是必需支链氨基酸亮氨酸的脱酰胺化衍生物。亮氨酸不仅是蛋白质(包含骨骼肌中的蛋白质)的组成部分，而且还充当肌肉蛋白质维持的调节剂。亮氨酸代谢物(包含酮亮氨酸和β-羟基-β-甲基丁酸盐)可以激活或维持肌肉蛋白质的合成。

酮亮氨酸也是某些代谢障碍的致病因素。枫糖尿病(MSUD；因尿液的特征性气味类似于枫糖的气味而得名)是一种罕见的由酶复合物支链α-酮酸脱氢酶的缺乏引起的遗传性病症。这使得支链氨基酸和其脱酰胺产物的分解代谢受损，从而使其在脑和其它组织中累积并导致尿液和其它体液的气味。MSUD的特征为进行性神经功能障碍，开始于嗜睡、易怒和进食不良，并且随后出现如异常运动、痉挛加剧等神经体征，并且最终出现癫痫发作和深度昏迷。如果不治疗，进行性脑损伤是不可避免的，并且死亡通常在数周或数月内发生。酮亮氨酸累积部分地通过抑制肌酸激酶而损害脑能量代谢，所述肌酸激酶是一种将衍生自线粒体ATP的能量传递到细胞溶质能量利用位点的关键酶。

因此，出乎意料的是，在严重线粒体能量衰竭模型中，与单独的尿苷三乙酸酯或酮亮氨酸相比，口服酮亮氨酸与口服尿苷三乙酸酯的组合提供了更强的死亡预防。

酮亮氨酸也是一种短链酮酸。本公开还涵盖尿苷的前药，所述前药包括酮亮氨酸作为5'-酯取代基，其中任选的2'和/或3'取代基包括具有2或3个碳原子的乙酸酯或其它羧酸。核糖部分的5'位中的酮亮氨酸取代基与2'和3'位中的乙酸酯取代基的组合产生一种新颖化合物，所述化合物将尿苷递送到循环中，同时还递送前药取代基，所述前药取代基除促进尿苷递送之外还提供另外或补充的治疗益处。

具有酮亮氨酸取代基的尿苷前药或尿苷三乙酸酯加酮亮氨酸的组合的主要临床适应症是用于预防和治疗骨骼肌萎缩病症，包含但不限于肌肉失用性萎缩(例如，在长期住院期间由于固定和缺乏运动而引起的肌肉质量和力量的损失)和肌肉减少症(瘦体肌肉质量的损失)或肌力减少症(肌肉力量的损失，伴有或不伴有肌肉质量的损失)。在患有合并症(包含慢性肾病、COPD和慢性心力衰竭)的人中发现肌肉减少症和肌力减少症的风险和发病率较高，并且本公开的化合物和组合物适于治疗和预防这些病状。癌症相关恶病质、体重和肌肉质量的病理性损失也可用本公开的药剂治疗或预防。

在每天口服给予1至3次的情况下，本发明的化合物和组合物的适当剂量向人类受试者递送相当于1至5克/剂量尿苷，有利地2至4克/剂量。在尿苷三乙酸酯加酮亮氨酸(通常呈酮亮氨酸钠或其它盐的形式)的组合中，酮亮氨酸以在尿苷摩尔量的1至最大4倍的范围内的摩尔当量存在于组合药物产品中。酮亮氨酸的分子量为大约130道尔顿，相比之下尿苷三乙酸酯的分子量为370道尔顿。

实例1：2',3'-二-O-乙酰基-5'-O-(α-酮异己酰基)尿苷的合成

5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷的制备

将咪唑(32.68g，480mmol)和叔丁基(氯)二甲基硅烷(36.2g，240mmol)依次添加到冷却至0℃的尿苷(48.84g，200mmol)于DMF(300mL)中的溶液中。将混合物在0℃下搅拌4小时并在室温下搅拌17小时。TLC(硅胶，10％ MeOH/DCM)显示反应完成。在高真空下使用旋转蒸发器除去DMF。将粗产物溶解于乙酸乙酯中并用水(3X500mL)洗涤。用无水MgSO

5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2',3'-二-O-乙酰尿苷的制备

将5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷(52.0g，145mmol)溶解于DCM(700mL)中，并且依次添加DMAP(40g，328mmol)和乙酸酐(35mL，371mmol)。将反应混合物在室温下在氩气下搅拌4小时。TLC(硅胶，50％乙酸乙酯/己烷)显示反应完成。将反应混合物转移到分液漏斗中并用水(2X 500mL)洗涤。用无水MgSO

2',3'-二-O-乙酰尿苷的制备

将四克对甲苯磺酸添加到冷却至0℃的5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2',3'-二-O-乙酰尿苷(66.0g，0.149mol)于干MeOH(100mL)和干DCM(250mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌3小时并且然后在室温下过夜。TLC(硅胶，50％乙酸乙酯/己烷)显示起始材料的消耗。将反应混合物用三乙胺淬灭，并且蒸发至干燥。使用硅胶和己烷/乙酸乙酯(1:1)对粗产物进行色谱分析，以得到：39.5g(81％)的产物。

2',3'-二-O-乙酰基-5'-O-(α-酮异己酰基)尿苷的制备

将二氯甲基甲醚(5.00mL，56.5mmol)逐滴添加到α-酮异己酸(5.0g，38.5mmol)中，在此期间放出气态HCl。在添加完成后，将混合物在48-52℃下加热30分钟。然后，用冰浴快速冷却混合物。通过注射器将混合物缓慢添加到通过冰浴冷却的2',3'-二-O-乙酰尿苷(12.6g，38.4mmol)和吡啶(9.0mL，112mmol)于180mL DCM中的混合物中。使混合物温热至室温过夜。添加5mL水，并使溶剂蒸发。

将残余物在乙酸乙酯(3X 250mL)与1M HC1(2X 200mL)、0.1M HC1(100mL)和盐水(200mL)之间分配。将合并的有机相经无水MgSO

实例2：口服尿苷三乙酸酯和酮亮氨酸对线粒体功能障碍小鼠模型的保护效应

在线粒体氧化磷酸化的进行性和致死性损伤模型中评估尿苷三乙酸酯和酮亮氨酸的组合。3-硝基丙酸(3-NP)，一种线粒体电子传递链复合物II的不可逆抑制剂。每天施用3-NP引起线粒体储备能量能力的进行性损失，直到突破存活的基线能量需求阈值为止，从而导致由心力衰竭和中枢神经系统功能障碍两者引起的死亡。

在本研究中，尿苷三乙酸酯通过管饲以口服团注方式施用，或者通过以4％w/w的浓度掺入到啮齿动物饲料中施用。类似地，酮亮氨酸(呈其钠盐形式；NaKL)通过管饲或通过将其溶解在饮用水中施用于不同组中。氯化钠(NaCl)在一些组中被用作对照物质，以说明来自酮亮氨酸盐的钠负荷。

化学品：羟丙基甲基纤维素(HPMC)，目录号H3785，批号SLBS5701，CAS 9004-65-3，

西格玛奥德里奇公司(SIGMA-Aldrich)。管饲用尿苷三乙酸酯(UTA)，项D000156，批号Q000001095，埃马卡科学公司(Almac Sciences)，饮食中的尿苷三乙酸酯(UTA)，项和批号D000302，2148-070，项目编号1314A0071A，从R-104批次Q000003578中回收材料，埃马卡科学公司，氯化钠(NaCl)，

VWR，目录号BDH9286-500G，批号1976C500，CAS 7647-14-5，4-甲基-2-

氧代戊酸钠盐(酮亮氨酸：NaKL)，目录号M326425，批号l-AWT-36-1，

CAS4502-00-5，多伦多研究化学公司(Toronto Research Chemicals)以及3-

硝基丙酸(3NP)，目录号N5636，批号11101616，CAS 504-88-1，西格玛奥德里奇公司。

媒剂：在0.75％ HPMC中制备含UTA、NaKL或NaCl的悬浮液。通过溶解于水中来制备含NaCL或NaKL的饮用水。在水中制备3-NP溶液。

给药调配物：制备：将UTA以50mg/ml悬浮于0.75％ HPMC中。

将NaKL以100mg/ml悬浮于0.75％ HPMC中，或以15.8mg/ml

包含在饮用水中。未接受NaKL的组通过管饲(38.4mg/ml)或在饮用水(6.1mg/ml)中接受一定量的NaCL，所述一定量的NaCL

与NaKL所提供的钠等摩尔。制备后，将含NaKL的饮用水过滤灭菌。含NaKL的饮用水每4天更换一次。

对3NP进行称重并将其溶于水中，用1N NaOH中和至pH 7，并过滤灭菌。最终浓度将为6.5mg/ml。

给药：使用含有50mg/ml UTA的UTA悬浮液(0.02ml/g bw，剂量：1,000mg/Kg)

或使用也含有100mg/ml NaKL(0.02ml/g bw，剂量：2,000mg/Kg)或38.42

mg/ml NaCl(0.02ml/g bw，剂量：768mg/Kg)的类似UTA悬浮液管饲一些组的小鼠。一些小鼠的饮用水中将具有NaKL(15.6mg/ml，104mM)或等摩尔量的NaCL(6.1mg/ml)。

向小鼠腹膜内注射(0.01ml/g bw)6.5mg/ml 3-NP，剂量为65mg/Kg。

动物：雌性CD-1小鼠。

一般实验设计：对于实验，将50只小鼠分成5组，每组10只动物：第1组、第2组、第3组、第4组和第5组。

向第1组饲喂含4％ UTA的饮食，并使其饮用含有一定量的NaCl的水

(104mM，6.1mg NaCl/ml)，所述一定量的NaCl与其它组的饮用水中的NaKL所提供的NaCl等摩尔。在下午5点向小鼠腹膜内注射6.5mg/ml 3-NP

(0.01ml/g bw)。

将向第2组饲喂含4％ UTA的饮食，并使其饮用含有NaKL的水(15.6mgNaKL/ml，104mM。在下午5点向小鼠腹膜内注射6.5mg/ml 3-NP(0.01ml/gbw)。

在上午7点和下午4点向第3组管饲1000mg/Kg UTA和768mg/Kg NaCl，

在下午5点向小鼠腹膜内注射6.5mg/ml 3-NP(0.01ml/g bw)。

在上午7点和下午4点向第4组管饲1000mg/Kg UTA+2000mg/Kg NaKL，

并且在下午5点腹膜内注射6.5mg/ml 3-NP(0.01ml/g bw)。

在上午7点和下午4点向第5组管饲1000mg/Kg UTA，并使其饮用含有15.6mg/mlNaKL的水。在下午5点向小鼠腹膜内注射6.5mg/ml 3-NP

(0.01ml/g bw)。

第1组和第2组中的小鼠在2019年5月6日星期一开始4％ UTA饮食。第1组、第2组和第5组中的小鼠也在2019年5月6日星期一开始其相应的饮用水处理。这是为了避免将小鼠3NP注射的任何副作用与饮用水或饮食的变化联系起来，并且由此引起对必要营养和流体摄取的厌恶。小鼠3、4和5于2019年5月8日星期三上午7点和下午4点开始管饲处理。所有小鼠在2019年5月8日星期三下午5点开始3NP处理。

在对小鼠进行饮食和饮用水处理之前，在5月6日星期一进行分组时，对体重进行评估。在5月7日星期二再次评估体重。在开始处理之前，在5月8日星期三开始每天早晨评估体重减轻和死亡，并且处理计划持续至少14天，这取决于死亡的发作和程度。

表1：组和处理的总结

尿苷三乙酸酯和NaKL与通过管饲给予的两种药剂的组合在预防死亡方面比通过管饲或在饲料中单独给与的任一种药剂显著更有效，并且也在将尿苷三乙酸酯和NaKL分别在饲料和饮用水中一起施用时更有效。这可能是由于口服团注给药后获得的血浆尿苷和酮亮氨酸的峰值浓度更高，而在饲料或饮用水中施用后，全身尿苷和NaKL(和其代谢物)的升高更小但更持久。除了尿苷三乙酸酯和NaKL的口服管饲团注施用(第3组)之外，通过口服管饲给予的尿苷三乙酸酯和含NaKL的饮用水(第5组)对死亡更有效。

与啮齿动物饲料中的4％(w/w)尿苷三乙酸酯(第1组和第2组)相比，使用或不使用NaKL的团注(管饲)尿苷三乙酸酯(第3-5组)更好地预防体重减轻，即使在动物饲料中接受尿苷三乙酸酯的动物每天总剂量更大(约8000mg/kg/天)。与饲料中的UTA相比，团注UTA产生更高的尿苷血浆浓度峰值，这表明与恒定的低水平全身暴露相比，周期性高尿苷峰值更好地激活保护机制。

表2：存活率结果