工程化的葡糖基转移酶

本申请要求美国临时申请号62/640,708(2018年3月9日提交)和62/792,449(2019年1月15日提交)的权益，所述申请以其全文通过引用并入本文。

技术领域

本公开属于酶催化领域。例如，本公开涉及具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶。此类经修饰的酶合成具有降低的分子量的产物。

所述序列表的官方副本经由EFS-Web以ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20190306_CL6607WOPCT_SequenceListing.txt，创建于2019年3月6日，且具有约315千字节的大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。

背景技术

受到在多种应用中使用多糖的期望所驱动，研究人员已经探索了可生物降解的并且可以从可再生来源的原料经济地制造的多糖。一种这样的多糖是α-1，3-葡聚糖，其是特征在于具有α-1，3-糖苷键的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已经使用从唾液链球菌(Streptococcus salivarius)分离的葡糖基转移酶制备了这种聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物学]141：1451-1460，1995)。还例如，美国专利号7000000公开了由酶促生产的α-1，3-葡聚糖制备纺成纤维。还研究了多种其他葡聚糖材料以用于开发新应用或增强的应用。例如，美国专利申请公开号2015/0232819公开了具有混合的α-1，3键和α-1，6键的几种不溶性葡聚糖的酶促合成。

虽然已经在使用葡糖基转移酶生产不溶性葡聚糖聚合物方面取得了这些进展和其他进展，但似乎很少关注调节由此类酶合成的不溶性葡聚糖产物的分子量。为解决这一技术差距，本文公开了具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶产生较低分子量不溶性葡聚糖产物。

发明内容

在一个实施例中，本公开涉及在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量低于由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。

在另一个实施例中，本公开涉及包含编码如本文公开的非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列的多核苷酸，任选地其中一个或多个调节序列可操作地连接到所述核苷酸序列，并且优选地其中所述一个或多个调节序列包含启动子序列。

在另一个实施例中，本公开涉及反应组合物，所述反应组合物包含水、蔗糖和如本文公开的非天然葡糖基转移酶。

在另一个实施例中，本公开涉及产生包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和如本文公开的非天然葡糖基转移酶接触，从而产生包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及(b)任选地，分离在步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖。

在另一个实施例中，本公开涉及制备编码如本文公开的非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)鉴定编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述亲本葡糖基转移酶(i)包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的位置55-960具有至少约40％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及(b)修饰步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列以在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处取代亲本葡糖基转移酶的至少一个氨基酸，从而提供编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，其中不溶性α-葡聚糖的分子量低于由亲本葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量。

具体实施方式

所有引用的专利和非专利文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。

除非另外公开，否则如本文所使用的术语“一个/一种”旨在涵盖一个/一种或多个/多种(即，至少一个/一种)所引用的特征。

如果存在，所有范围是包含性的和可组合的，除非另有说明。例如，当列举“1至5”(即，1-5)的范围时，所列举的范围应当解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。

术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。在典型的实施例中，本文的α-葡聚糖包含100％的α-糖苷键，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的α-糖苷键。本文的α-葡聚糖聚合物的实例包括α-1，3-葡聚糖。

术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，其中至少约50％的糖苷键是α-1，3。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖包含至少90％或95％的α-1，3糖苷键。本文的α-1，3-葡聚糖中的大部分或全部其他键典型地是α-1，6，尽管一些键还可以是α-1，2和/或α-1，4。

术语“糖苷键(glycoSidic linkage)”、“糖苷键(glycoSidic bond)”、“键”等在本文中可互换地使用，并且是指连接糖类化合物(低聚糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。如本文所使用的，术语“α-1，3-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和3将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键的类型。如本文所使用的，术语“α-1，6-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和6将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键。本文的葡聚糖聚合物的糖苷键(glycosidic linkage)也可以称为“糖苷键(glucosidic linkage)”。本文中，“α-D-葡萄糖”将被称为“葡萄糖”。

本文的α-葡聚糖的糖苷键谱图可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)光谱法(例如，

本文的大α-葡聚糖聚合物的“分子量”可以表示为重均分子量(Mw)或数均分子量(Mn)，其单位为道尔顿或克/摩尔。替代性地，大α-葡聚糖聚合物的分子量可以表示为DPw(重均聚合度)或DPn(数均聚合度)。较小α-葡聚糖聚合物(如寡糖)的分子量可以典型地以“DP”(聚合度)提供，所述分子量仅指α-葡聚糖内包含的葡萄糖的数量；“DP”还可以表征基于单个分子的聚合物的分子量。用于计算这些不同分子量测量值的各种手段在本领域中是已知的，如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。

本文中，术语“蔗糖”是指由α-1，2-糖苷键连接的α-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子构成的非还原性二糖。通常，蔗糖被称为食用糖。蔗糖可替代地可以称为“α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-果糖呋喃糖苷”。“α-D-吡喃葡糖基”和“葡糖基”在本文可互换使用。

术语“葡糖基转移酶(glucosyltransferase)”、“葡糖基转移酶(glucosyltransferase enzyme)”、“GTF”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互换地使用。本文的葡糖基转移酶的活性催化底物蔗糖的反应以制成产物α-葡聚糖和果糖。GTF反应的其他产物(副产物)可以包括葡萄糖、各种可溶性葡萄糖-寡糖、和明串珠菌二糖。葡糖基转移酶的野生型形式通常含有(在N-末端至C-末端方向上)信号肽(典型地被裂解过程除去)、可变结构域、催化结构域和葡聚糖-结合结构域。根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(Cantarel等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]37：D233-238，2009)，将本文中的葡糖基转移酶分类在糖苷水解酶家族70(GH70)下。

本文的术语“葡糖基转移酶催化结构域”是指为葡糖基转移酶提供α-葡聚糖合成活性的葡糖基转移酶的结构域。典型地，葡糖基转移酶催化结构域不需要存在任何其他的结构域以具有此活性。

术语“酶促反应”、“葡糖基转移酶反应”、“葡聚糖合成反应”、“反应组合物”、“反应制剂”等在本文中可互换地使用，并且通常指最初包含水、蔗糖、至少一种活性葡糖基转移酶和任选的其他组分的反应。典型地在葡糖基转移酶反应开始后可以进一步存在于所述反应中的组分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性葡萄糖-寡糖(例如，DP2-DP7)(这类糖可以被认为是基于使用的葡糖基转移酶的产物或副产物)、和/或DP8或更高(例如，DP100和更高)的一种或多种不溶性α-葡聚糖产物。应当理解的是，具有聚合度(DP)为至少8或9的某些葡聚糖产物(如α-1，3-葡聚糖)是水不溶性的，并因此不溶解于葡聚糖合成反应，而是可能存在于溶液之外(例如，由于从反应中沉淀出来)。在葡聚糖合成反应中，进行了使水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤。如本文所使用的，术语“在合适的反应条件下”是指通过葡糖基转移酶活性支持将蔗糖转化为一种或多种α-葡聚糖产物的反应条件。

术语“按体积计百分比(percent by volume)”、“体积百分比(volume percent)”、“体积％(vol％)”、“体积/体积％(v/v％)”等在本文中可互换地使用。溶质在溶液中的按体积计百分比可以使用以下公式确定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。

术语“按重量计百分比(percent by weight)”、“重量百分比(weightpercentage，wt％)”、“重量-重量百分比(weight-weight percentage，％w/w)”等在本文中可互换地使用。按重量计百分比是指当材料包含在组合物、混合物、或溶液中时，所述材料在质量基础上的百分比。

术语“水性条件”、“水性反应条件”、“水性设置”、“水性体系”等在本文中可互换地使用。本文中的水性条件是指其中溶剂为例如至少约60wt％的水的溶液或混合物。本文中的葡糖基转移酶反应在水性条件下进行。

“不溶性”、“水不溶性(aqueous-insoluble)”、“水不溶性(water-insoluble)”(和类似术语)的葡聚糖(例如，DP为8或更高的α-1，3-葡聚糖)不溶解(或不明显地溶解)在水或其他水性条件中，任选地其中所述水性条件进一步特征为具有4-9的pH(例如，pH 6-8)和/或约1℃至85℃(例如，20℃-25℃)的温度。相比之下，本文的“可溶性的”、“水性可溶性的”、“水可溶性的”葡聚糖如某些低聚糖等(例如，具有小于8的DP的α-1，3-葡聚糖)在这些条件下明显地溶解。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸分子”等在本文中可互换地使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，其任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。多核苷酸可以由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物的一个或多个区段构成。

如本文所使用的，术语“基因”是指从编码区表达RNA(RNA转录自DNA多核苷酸序列)的DNA多核苷酸序列，所述RNA可以是信使RNA(编码蛋白质)或非蛋白质编码RNA。基因可以是指单独的编码区，或者可以包括编码区上游和/或下游的调节序列(例如启动子、5’-非翻译区、3’-转录终止子区)。可替代地，编码蛋白质的编码区在本文中可以被称为“可读框”(ORF)。“天然”或“内源”的基因是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因；这样的基因位于宿主细胞的基因组中的其天然位置。“嵌合”基因是指不是天然基因的任何基因，所述基因包括在自然界中未一起发现的调节序列和编码序列(即，调节区和编码区彼此是异源的)。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“外来”或“异源”的基因可能是指通过基因转移引入宿主生物体的基因。外来/异源基因可以包含插入非天然生物体内的天然基因、引入天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。在某些实施例中，本文公开的多核苷酸序列是异源的。“转基因”是通过基因递送程序(例如，转化)已经引入基因组中的基因。“密码子优化的”可读框的密码子使用频率被设计为模拟宿主细胞的优选密码子使用的频率。

如本文所使用的，术语“多肽”被定义为氨基酸残基链，通常具有确定的序列。如本文所使用的，术语多肽可与术语“肽”和“蛋白质”互换。在本文的多肽中包含的典型氨基酸包括(括号中显示了相应的三字母和单字母代码)：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酸(Glu，E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、缬氨酸(Val，V)。

术语“异源”意指不是天然地在目的位置发现的。例如，异源基因可以不是天然地在宿主生物体中发现的基因，而是通过基因转移引入所述宿主生物体中的基因。作为另一个实例，存在于嵌合基因中的核酸分子可以表征为异源的，因为这样的核酸分子不与所述嵌合基因的其他区段天然相关(例如，启动子对于编码序列可以是异源的)。

本文中包含在细胞或生物体中的“非天然”氨基酸序列或多核苷酸序列不会出现在这样的细胞或生物体的天然的(自然的)对应物中。这样的氨基酸序列或多核苷酸序列也可以被称为是与细胞或生物体异源的。

如本文所使用的，“调节序列”是指位于基因转录起始位点(例如启动子)上游的核苷酸序列、5’非翻译区、内含子和3’非编码区，并且所述调节序列可以影响转录、加工或稳定性、和/或从所述基因转录的RNA的翻译。本文中，调节序列可以包括启动子、增强子、沉默子、5’非翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构以及涉及基因表达调节的其他元件。本文中的一个或多个调节元件可以与本文中的编码区异源。

如本文所使用的，“启动子”是指能够控制从基因转录RNA的DNA序列。通常，启动子序列位于基因的转录起始位点的上游。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。在所有情况下在多数时候引起基因在细胞中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。可替代地，启动子可以是诱导型的。本文中的一个或多个启动子可以与本文中的编码区异源。

如本文所使用的，“强启动子”是指可以指导每单位时间相对大量的生产性启动的启动子，和/或是驱动比在细胞中基因的平均转录水平更高的基因转录水平的启动子。

如本文所使用的，术语“3’非编码序列”、“转录终止子”、“终止子”等是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。

如本文所使用的，当在合适的退火条件下(例如，温度、溶液离子强度)单链形式的第一核酸序列可以退火为第二核酸序列时，第一核酸序列可与第二核酸序列“杂交”。杂交和洗涤条件是熟知的并且在Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T，

术语“DNA操作技术”是指其中将DNA多核苷酸序列的序列进行修饰的任何技术。尽管可以将经修饰的DNA多核苷酸序列用作用于修饰的底物本身，但是对于某些技术，无需有形存在(例如，可以将存储在计算机中的序列用作操作技术的基础)。可以将DNA操作技术用于在更长的序列中使一个或多个DNA序列缺失和/或突变。DNA操作技术的实例包括重组DNA技术(限制和连接，分子克隆)，聚合酶链式反应(PCR)和合成DNA的方法(例如寡核苷酸合成和连接)。关于合成DNA技术，DNA操作技术可能需要在计算机芯片上观察DNA多核苷酸，确定DNA多核苷酸的所希望的修饰(例如一个或多个缺失)，并合成含有所希望的修饰的DNA多核苷酸。

本文术语“在计算机芯片上”意指在诸如计算机的信息存储和/或处理设备中或其上；使用计算机软件或模拟来完成或产生，即虚拟现实。

如本文所使用的，关于多核苷酸的术语“上游”和“下游”分别是指“5’的”和“3’的”。

如本文中所使用，术语“表达”是指(i)由编码区转录RNA(例如，mRNA或非蛋白质编码RNA)，和/或(ii)由mRNA翻译多肽。在某些实施例中，可以对多核苷酸序列的编码区域的表达进行上调或下调。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指两种或更多种核酸序列的缔合，这样使得其中一种核酸序列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。即，编码序列处于启动子的转录控制下。例如，编码序列可以可操作地连接到一种(例如，启动子)或多种(例如，启动子和终止子)调节序列。

当本文中用于表征DNA序列例如质粒、载体或构建体时，术语“重组”是指例如通过化学合成和/或通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的序列区段进行人工组合。

如本文所使用的，术语“转化”是指通过任何方法将核酸分子转移到宿主生物体或宿主细胞中。已经转化到生物体/细胞中的核酸分子可以是在生物体/细胞中自主复制、或整合到生物体/细胞的基因组中、或瞬时存在于细胞中而不进行复制或整合的核酸分子。在本文中公开了适合于转化的核酸分子的非限制性实例，例如质粒和线性DNA分子。本文中含有转化核酸序列的宿主生物体/细胞可以被称为例如“转基因的”、“重组的”、“转化的”、“工程化的”、被称为“转化体”、和/或被称为“经修饰以用于外源基因表达”。

如本文所使用的，关于多核苷酸或多肽序列的术语“序列同一性”、“同一性”等是指在两个序列中的核酸残基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。因此，“序列同一性百分比”、“百分比同一性”等是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，所述多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算所述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将所述结果乘以100以产生序列同一性的百分比。应当理解的是，当计算DNA序列和RNA序列之间的序列同一性时，DNA序列的T残基与RNA序列的U残基比对，并且可以被认为与其“具有同一性”。出于确定第一多核苷酸和第二多核苷酸的“百分比互补性”的目的，可以通过确定(i)第一多核苷酸与第二多核苷酸的补体序列之间的百分比同一性(或反之亦然)，例如和/或(ii)将产生规范的沃森和克里克碱基对的第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的碱基百分比来获得。

可以通过任何已知方法容易地确定百分比同一性，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：1)

用于确定百分比同一性的优选方法被设计为在测试序列之间给出最佳匹配。例如，确定同一性和相似性的方法被编入公共可用的计算机程序中。例如，序列比对和百分比同一性计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MEGALIGN程序进行。序列的多重比对可以例如使用Clustal比对方法进行，所述比对方法涵盖几不同的算法，包括Clustal V比对方法(通过Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]，8：189-191(1992)描述)并且存在于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR公司)的MEGALIGN v8.0程序中。对于多重比对，默认值可能对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。使用Clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可以为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、以及存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数可以是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、以及存储的对角线＝4。另外，可以使用Clustal W比对方法(通过Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]8：189-191(1992)；Thompson，J.D.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，22(22)：4673-4680，1994描述)并且存在于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR公司)的MEGALIGN v8.0程序中。用于多重比对(蛋白质/核酸)的默认参数可以是：空位罚分＝10/15、空位长度罚分＝0.2/6.66、延迟发散序列(Delay Divergent Seqs)(％)＝30/30、DNA转换权重＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列、DNA权重矩阵＝IUB。

作为某些实施例的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。可以使用或引用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。替代性地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。本文的变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有所公开的序列的相同功能/活性，或具有所公开的序列的功能/活性的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。典型地，本文公开的不以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以在氨基酸序列的N-末端进一步包含至少一个起始甲硫氨酸。相反，本文公开的以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以任选地缺少这种甲硫氨酸残基。

术语“与……比对”、“对应于”等在本文中可互换地使用。本文的一些实施例涉及在与SEQ ID NO：62的至少一个特定氨基酸残基相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的葡糖基转移酶。葡糖基转移酶的氨基酸位置或其子序列(例如，催化结构域或催化结构域加葡聚糖-结合结构域)(可以将这样的氨基酸位置或序列称为“查询”位置或序列)可以被表征为与SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基(可以将这样的氨基酸位置或序列称为“主题”位置或序列)相对应，如果(1)可以将所述查询序列与所述主题序列比对(例如，其中比对表明所述查询序列和所述主题序列[或主题序列的子序列]具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％同一性)，并且(2)如果直接将所述查询氨基酸位置与在(1)的比对下的主题氨基酸位置进行比对(直接排列对比)。通常，可以使用本文公开所述的任何比对算法、工具和/或软件(例如，BLASTP、ClustalW、ClustalV、Clustal-Omega、EMBOSS)将查询氨基酸序列与主题序列(SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：62的子序列)进行比对以确定百分比同一性。仅用于其他实例，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453，1970)将查询序列与本文的主题序列进行比对，如在欧洲分子生物学开放软件包(European Molecular Biology Open Software Suite，EMBOSS[例如，版本5.0.0或更新]，Rice等人，Trends Genet.[遗传学趋势]16：276-277，2000)的Needle程序中所执行。这种EMBOSS比对的参数可以包含，例如：空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

本文的SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基的编号(例如，Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、Gln-616)是相对于SEQ ID NO：62的全长氨基酸序列的。SEQ ID NO：62的第一个氨基酸(即，位置1，Met-1)位于信号肽的起始处。除非另有公开，否则本文的取代是相对于SEQ ID NO：62的全长氨基酸序列而言的。

本文中的“非天然葡糖基转移酶”(“突变体”、“变体”、“经修饰的”等术语同样可用于描述这样的葡糖基转移酶)在与SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基相对应的位置处具有至少一个氨基酸取代。这样的至少一种氨基酸取代典型地代替正常地(天然地)发生在非天然葡糖基转移酶的天然对应物(亲本)中的相同位置的一个或多个氨基酸残基(即，尽管SEQID NO：62被用作位置的参考，但本文中的氨基酸取代是相对于非天然葡糖基转移酶的天然对应物)(考虑另一种方式，当将非天然葡糖基转移酶的序列与SEQ ID NO：62比对时，确定在特定位置是否存在取代本身并不取决于SEQ ID NO：62中的各自的氨基酸残基，而是取决于在非天然葡糖基转移酶的天然对应物的主题位置上存在什么氨基酸)。正常地出现在天然对应物葡糖基转移酶的相关位点的氨基酸通常(但不总是)与进行比对的SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基相同(或与之保持一致)。相对于其天然对应物序列，非天然葡糖基转移酶任选地可以具有其他氨基酸变化(突变、缺失和/或插入)。

在本文中阐明取代/比对可能是有益的。SEQ ID NO：12(GTF 0544)是表兄链球菌葡糖基转移酶的截短形式。应注意，SEQ ID NO：12的Leu-193与SEQ ID NO：62的Leu-373相对应(比对未显示)。例如，如果SEQ ID NO：12在位置193处突变以用不同的残基(例如，Gln)取代Leu残基，那么可以这样说SEQ ID NO：12的位置193突变的版本表示在与SEQ ID NO：62的Leu-373相对应的位置处具有氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶。

术语“分离的”意指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质(或过程)。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质(例如，本文的非天然葡糖基转移酶)，(2)任何物质，包括但不限于，从与其天然相关联的天然存在的成分中的一种或多种中或所有中至少部分地除去的任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽、辅因子、或碳水化合物/糖类；(3)相对于自然界中发现的物质，经人手修饰的任何物质(例如，本文的非天然葡糖基转移酶)；或(4)相对于与其天然相关的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。据信本文公开的实施例(例如，酶和反应组合物)是合成的/人造的(除了人为干预/参与之外不可能制造)，和/或具有非天然存在的特性。

如本文所使用的，术语“增加的”可以是指比所述增加的数量或活性与之进行比较的数量或活性多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、50％、100％或200％的量或活性。术语“增加的”、“提高的”、“增强的”、“大于”、“改进的”等在本文中可互换地使用。例如，可以将这些术语用于表征编码蛋白质的多核苷酸的“过表达”或“上调”。

虽然已经在使用葡糖基转移酶生产不溶性葡聚糖聚合物方面取得了进展，但似乎很少关注调节由此类酶合成的不溶性葡聚糖产物的分子量。为解决这一技术差距，本文公开了具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶产生较低分子量不溶性葡聚糖产物。

本公开的某些实施例涉及在与SEQ ID NO：62的一个或多个氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量低于由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。因此，通常，本文公开了突变体葡糖基转移酶，这些酶可以合成具有α-1，3糖苷键的较低分子量不溶性α-葡聚糖。

本文的非天然葡糖基转移酶合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖。在一些方面，这种α-葡聚糖的至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、69％、70％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的糖苷键可以是α-1，3键。不溶性α-葡聚糖的键谱图可以任选地被表征为具有这些值中的任何两个之间的范围。在具有30％-99.5％α-1，3键的这些方面中的任一个中，其他键可以是例如α-1，6和/或不包括任何α-1，4或α-1，2键。

在一些方面中，不溶性α-葡聚糖可以具有例如小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的α-1，2或α-1，4糖苷键。在另一个实施例中，不溶性α-葡聚糖仅具有α-1，3键和任选地α-1，6键(即，不具有α-1，2键或α-1，4键)。在不溶性α-葡聚糖包含50％α-1，3糖苷键的方面，此种葡聚糖典型地不包含交替键(交替的α-1，3和α-1，6键)。

在一些方面中，不溶性α-葡聚糖可以是线性/非支化的(不具有分支点)。可替代地，本文的不溶性α-葡聚糖中可以存在分支。例如，作为聚合物中这些键的百分比，不溶性α-葡聚糖可以具有小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0.5％的分支点。

在某些方面，不溶性α-葡聚糖可以具有以DPw或DPn表示的小于约300的分子量。例如，DPw或DPn可为约，或小于约300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、或11。不溶性α-葡聚糖的分子量可以任选地表示为在这些值中的任何两个之间的范围(例如，11-25、12-25、11-22、12-22、11-20、12-20、20-300、20-200、20-150、20-100、20-75、30-300、30-200、30-150、30-100、30-75、50-300、50-200、50-150、50-100、50-75、75-300、75-200、75-150、75-100、100-300、100-200、100-150、150-300、150-200、200-300)。例如，本文的分子量可以根据任何合适的方法进行测量，所述方法包括本实例(下文)中公开的或如在美国专利申请公开号2017/0002335、2015/0064748或2015/0232819中公开的那些方法。

本文的α-葡聚糖在非苛性水性系统中是不溶性的，例如本文的葡糖基转移酶反应的那些条件(例如，pH 4-8，参见以下)。通常，在本文的水性环境中葡聚糖聚合物的溶解度与其键谱图、分子量、和/或支化度相关。例如，在DPw为8及以上，在水性条件下，在20℃下，具有≥95％的1，3键的α-1，3-葡聚糖通常是不溶性的。通常，随着分子量增加，α-1，3-葡聚糖不溶性要求的α-1，3键的百分比降低。

例如，可以将本文中的前述键谱图和/或分子量谱图中的任一种进行合并以适当地表征本公开的非天然葡糖基转移酶的不溶性α-葡聚糖产物。

非天然葡糖基转移酶例如可以包含在以下出版物中公开的能够产生如目前公开的不溶性α-葡聚糖的任何葡糖基转移酶的氨基酸序列，但除了该非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代：美国专利号7000000和8871474；以及美国专利申请公开号2015/0232819和2017/0002335中，将其全部通过引用并入本文。在一些方面，这样的非天然葡糖基转移酶(i)具有前述取代中的至少一个，并且(ii)包含与不具有所述至少一个取代的各自对应物/亲本葡糖基转移酶的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶(i)在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，并且(ii)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、26、28、30、34、或59具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列或由其组成。在表2中提供了关于具有这些氨基酸序列中大多数的葡糖基转移酶的不溶性α-葡聚糖产物的某些信息。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶(i)在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，并且(ii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸残基55-960、SEQ ID NO：65的残基54-957、SEQ ID NO：30的残基55-960、SEQ ID NO：28的残基55-960、或SEQ ID NO：20的残基55-960具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的葡糖基转移酶催化结构域，或由其组成。例如，据信这种非天然葡糖基转移酶能够产生水不溶性的α-葡聚糖，并且包含至少约50％(例如，≥90％或≥95％)的α-1，3键。例如，应注意具有SEQ ID NO：65的氨基酸位置54-957的葡糖基转移酶可以产生具有100％α-1，3键的α-1，3-葡聚糖(数据未显示，参考美国专利申请公开号2017/0002335的表6，这些申请通过引用并入本文)。进一步注意到SEQ ID NO：65(GTF 7527)、30(GTF 2678)、4(GTF 6855)、28(GTF 2919)和20(GTF 2765)各自表示一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶与其各自的野生型对应物相比缺少信号肽结构域以及全部或大部分的可变结构域。因此，这些葡糖基转移酶中的每一个具有催化结构域，之后是葡聚糖结合结构域。催化结构域序列在这些酶中的大致位置如下：7527(SEQ ID NO：65的残基54-957)、2678(SEQ ID NO：30的残基55-960)、6855(SEQ ID NO：4的残基55-960)、2919(SEQID NO：28的残基55-960)、2765(SEQ ID NO：20的残基55-960)。GTF 2678、6855、2919和2765的催化结构域(大致)的氨基酸序列分别与GTF 7527的大致催化结构域序列(即，SEQ IDNO：65的氨基酸54-957)具有约94.9％、99.0％、95.5％和96.4％的同一性。这些具体的葡糖基转移酶(GTF 2678、6855、2919和2765)中的每一个可以产生具有100％α-1，3键和DPw为至少400的α-1，3-葡聚糖(数据未显示，参考美国专利申请公开号2017/0002335的表4)。基于前述催化结构域的活性和关联性(高百分比同一性)，预期具有前述催化结构域之一的本文的非天然葡糖基转移酶可以产生包含至少约50％(例如，≥90％或≥95％)α-1，3键的较低分子量的不溶性α-葡聚糖，这些催化结构域进一步具有如目前公开的至少一个氨基酸取代。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶(i)在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，并且(ii)包含与SEQ ID NO：62或其子序列如SEQ ID NO：4(无其起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：4的位置55-960(大致催化结构域)具有至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、69％、70％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，或由其组成。

尽管据信在某些方面非天然葡糖基转移酶仅需要具有催化结构域，但所述非天然葡糖基转移酶可以包含在更大的氨基酸序列内。例如，可以将催化结构域在其C-末端连接至葡聚糖结合结构域，和/或在其N-末端连接至可变结构域和/或信号肽。

尽管本文通常公开了非天然葡糖基转移酶中的关于SEQ ID NO：62中相应位置的氨基酸取代，但是这样的取代可以可替代地关于非天然葡糖基转移酶本身的序列中的位置编号而简单地陈述，按方便可以这样规定。

非天然葡糖基转移酶的仍进一步的实例可以是如本文公开的任何酶并且包括在N-末端和/或C-末端的1-300(或之间的任何整数[例如，10、15、20、25、30、35、40、45、或50])个残基。例如，这样的另外的残基可以来自衍生出葡糖基转移酶的相应的野生型序列，或可以是异源序列例如像表位标签(在N-或C-末端)或异源信号肽(在N-末端)。本文中非天然葡糖基转移酶典型地缺少N-末端信号肽；如果在分泌过程中去除其信号肽，则这种酶可任选地被表征为是成熟的。

本文的非天然葡糖基转移酶可以衍生自任何微生物来源，例如像细菌。细菌葡糖基转移酶的实例是衍生自链球菌属物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种或乳杆菌属(Lactobacillus)物种的那些。链球菌属物种的实例包括唾液链球菌、表兄链球菌、牙链球菌、汗毛链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和血链球菌。明串珠菌属物种的实例包括肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、阿米巴氏明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argenunum)、肉明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。乳杆菌属物种的实例包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布赫内氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentumn)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)。

例如，本文的非天然葡糖基转移酶可以通过适当工程化的微生物菌株的发酵来制备。通过发酵进行重组酶生产是本领域熟知的，使用微生物种类如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)菌株(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、以及曲霉属(Aspergillus)(例如，泡盛曲霉(A.awamori))和木霉属(Trichoderma)(例如，里氏木霉(T.reesei))的物种(例如，参见Adrio和Demain，Biomolecules[生物分子]4：117-139，2014，将其通过引用并入本文)。将编码非天然葡糖基转移酶氨基酸序列的核苷酸序列典型地与异源启动子序列连接以产生所述酶的表达盒，和/或因此被密码子优化。可以使用本领域熟知的方法将这种表达盒并入到合适的质粒上或整合到微生物宿主染色体中。表达盒可以包括在氨基酸编码序列之后的转录终止子核苷酸序列。表达盒还可以在启动子序列和葡糖基转移酶氨基酸编码序列之间包括编码信号肽(例如，异源信号肽)的核苷酸序列，所述信号肽被设计用于指导葡糖基转移酶的分泌。在发酵结束时，细胞可以相应地破裂(通常当不使用用于分泌的信号肽时)，并且可以使用诸如沉淀、过滤和/或浓缩等方法分离葡糖基转移酶。可替代地，可以使用包含葡糖基转移酶的裂解物或提取物而无需进一步分离。如果葡糖基转移酶被分泌(即，它存在于发酵液中)，则所述葡糖基转移酶可以任选地与发酵液分离来使用或包含在发酵液中使用。葡糖基转移酶的活性可以通过生物化学测定来确认，例如测量其将蔗糖转化成葡聚糖聚合物。

本文的非天然葡糖基转移酶可以在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。在一些方面，非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。在一些方面，与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Pro-550相对应的位置处的氨基酸可以被Leu、Val、或Ile残基(例如，Leu或Val)取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Ser-553相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Cys、Glu、Phe、His、Ile、Met、Asn、Arg、Thr、Val、或Tyr残基取代。在一些方面，在与SEQID NO：62的氨基酸残基Asn-557相对应的位置处的氨基酸可以被Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、或Ser残基(例如，Glu、Gln、Ile、或Thr)取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Asn-558相对应的位置处的氨基酸可以被Asp或Glu残基(例如，Asp)取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Trp-571相对应的位置处的氨基酸可以被Val、Asp、Cys、Ile、Leu、Glu、或Ser残基(例如，Val、Asp、或Cys)取代。在一些方面，在与SEQ IDNO：62的氨基酸残基Asn-573相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Asp、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Thr、Val、或Trp残基取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Asp-575相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr残基取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Lys-578相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Asn-581相对应的位置处的氨基酸可以被Pro或Gly残基(例如，Pro)取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Thr-585相对应的位置处的氨基酸可以被Pro或Gly残基(例如，Pro)取代。在一些方面，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Gln-616相对应的位置处的氨基酸可以被Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代。

例如，合适的取代位点和在这些位点具体取代的实例可以包括如在实例1(以下)的表3中列出的那些，其与不溶性α-1，3-葡聚糖产物的分子量(DPw)中降低约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％相关。如在表3中列出的前述取代与SEQ ID NO：62中列出的残基位置编号相对应。

本文的非天然葡糖基转移酶可以包含目前公开的氨基酸取代的例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、或更多个。例如，具有两个或更多的目前公开的氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶在与(i)SEQ ID NO：62的氨基酸残基Pro-550、Asn-557、Asn-558、Asn-581、或Thr-585，和/或(ii)SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、或Gln-616相对应的位置处可以包含至少一个氨基酸取代。取代位置的实例是在P550(L)和N557(I)、P550(L)和N581(P)、N557(I)和N581(P)、S553(C)和N558(D)、S553(C)和D575(V)、S553(C)和T585(P)、N558(D)和T585(P)、D575(V)和T585(P)、N558(D)和D575(V)、P550(V)和S553(R)、P550(V)和N581(P)、P550(V)和T585(P)、S553(R)和N581(P)、S553(R)和T585(P)、N581(P)和T585(P)、P550(L)和S553(F)、P550(L)和N581(P)、S553(F)和N581(P)、P550(V)和N557(E)、P550(V)和T585(P)N557(E)和T585(P)，其中取代的氨基酸残基作为实例附带列出；除了任何前述位置对之外的一个或多个取代可选地在位置P550(L、V)、N557(I、E)、N581(P)、S553(任何本文的如C、R、F)、N558(D)、D575(任何本文的如V、A)、T585(P)、L513(任何本文的)、N573(任何本文的I、V、P)、K578(任何本文的N、D、R)、Q616(任何本文的)、W571(V、D、C)、和/或本文相应地任何其他位置，其中取代的氨基酸残基作为实例附带列出。

仅出于说明目的，本文的非天然葡糖基转移酶可以包含如表A(i-lxiii)所示的位置处的氨基酸取代的组合，其中每个取代位置与在SEQ ID NO：62中的各自氨基酸位置数量相对应。表A中的取代的氨基酸残基作为实例附带列出。在一些方面，非天然葡糖基转移酶可以包含如表A所示的氨基酸取代的组合，其中取代的氨基酸是在表A中附带显示的那些。

例如，具有一个或多个本文的氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶可以基于如目前公开的多个葡糖基转移酶氨基酸序列中的任一个。仅出于说明目的，这种非天然葡糖基转移酶的实例包括具有单个氨基酸取代(例如，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处)或氨基酸取代的组合(例如，表A的实施例i-lxiii中的任一个)，并且其包含如下氨基酸序列或由其组成的那些，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：65(任选地无SEQ ID NO：65的起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：65的残基54-957、SEQ ID NO：30(任选地无SEQ ID NO：30的起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：30的残基55-960、SEQ ID NO：4(任选地无SEQ ID NO：4的起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：4的残基55-960、SEQ ID NO：28(任选地无SEQ ID NO：28的起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：28的残基55-960、或SEQ ID NO：20(任选地无SEQ ID NO：20的起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：20的残基55-960具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性。

在一些方面，一个或多个取代是保守取代或非保守取代；这种保守(或不保守)可以是例如相对于衍生出非天然葡糖基转移酶的天然葡糖基转移酶中存在的氨基酸而言的。

本文的非天然葡糖基转移酶可以合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，所述不溶性α-葡聚糖具有比由第二葡糖基转移酶(或，仅，“另一个”葡糖基转移酶)(例如，亲本葡糖基转移酶)合成的包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的分子量较低的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。本文的第二葡糖基转移酶例如可以由天然氨基酸序列的全部或大部分组成。因此，当本文的第二葡糖基转移酶在一些方面可以是天然葡糖基转移酶时，所述第二葡糖基转移酶在其他方面可以是修饰前的葡糖基转移酶(例如，具有与本公开的一个或多个取代不同的一个或多个其他氨基酸取代的葡糖基转移酶)。在一些实施例中，与非天然葡糖基转移酶相比的第二葡糖基转移酶在一个或多个取代位置处具有一个或多个天然氨基酸残基。可以通过将第二葡糖基转移酶氨基酸序列与衍生出所述第二葡糖基转移酶的天然/野生型葡糖基转移酶氨基酸序列进行比较来确定氨基酸残基是否是天然的。

在一些方面，本文的非天然葡糖基转移酶可合成具有分子量比由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖分子量低约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％的不溶性α-葡聚糖。关于如本文公开的任何葡聚糖合成反应/过程(例如，考虑到初始蔗糖浓度、温度、pH和/或反应时间)，并且使用任何合适的测量技术(例如，SEC)，可以进行这样的测定。典型地，在相同或相似的反应条件下，可以进行非天然葡糖基转移酶和本文的第二葡糖基转移酶之间的比较。例如，不溶性α-葡聚糖的分子量可以表示为DPw。例如，在关于具有20或更少的单体单元的不溶性葡聚糖的实施例中，分子量可以任选地被表示为DP。

本文公开的一些实施例涉及包含编码如目前公开的非天然葡糖基转移酶(例如，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶)的核苷酸序列的多核苷酸。任选地，一个或多个调节序列与所述核苷酸序列可操作地连接，并且优选包含启动子序列作为调节序列。

包含编码本文的非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列的多核苷酸可以是例如用于将核苷酸序列转移到细胞中的载体或构建体。合适的载体/构建体的实例可以选自质粒、酵母人工染色体(YAC)、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、病毒、或线性DNA(例如，线性PCR产物)。在一些方面多核苷酸序列能够在细胞中瞬时存在(即未整合到基因组中)或稳定存在(即整合到基因组中)。在一些方面多核苷酸序列可以包含或缺少一个或多个合适的标记序列(例如选择或表型标记)。

在某些实施例中，多核苷酸序列可以包含与编码非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列可操作地连接的一个或多个调节序列。例如，编码非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列可以与启动子序列(例如，异源启动子)可操作地连接。例如，启动子序列可适用于在细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌或芽孢杆菌属；真核细胞，如真菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中或体外蛋白质表达系统中表达。其他合适的调节序列的实例包括转录终止子序列。

本文的一些方面涉及包含如目前公开的多核苷酸序列的细胞；这样的细胞可以是本文所公开的任何类型(例如，细菌细胞，如大肠杆菌或芽孢杆菌属；真核细胞，如真菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)。细胞可以任选地表达由多核苷酸序列编码的非天然葡糖基转移酶。在一些方面，所述多核苷酸序列在细胞中瞬时存在(即，未整合到基因组中)或稳定存在(即，整合到基因组中)。

本文公开的一些实施例涉及反应组合物，该反应组合物包含水、蔗糖和本文的一种或多种非天然葡糖基转移酶(例如，在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶)。这样的反应组合物至少产生包含如公开的α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖。

如果需要，可以控制本文的反应组合物的温度，并且可以是例如约5℃-50℃、20℃-40℃、30℃-40℃、20℃-30℃、20℃-25℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃。

本文的反应组合物中的蔗糖的初始浓度可以是例如约20-400g/L、75-175g/L或50-150g/L。在一些方面，初始蔗糖浓度是约或至少约，50、75、100、150或200g/L，或是约50-600g/L、100-500g/L、50-100g/L、100-200g/L、150-450g/L、200-450g/L或250-600g/L。“蔗糖的初始浓度”是指在反应组合物中刚刚在已经添加/合并所有反应组分(例如，至少水、蔗糖、非天然葡糖基转移酶)之后的蔗糖浓度。

在某些实施例中，反应组合物的pH可以是约4.0-9.0、4.0-8.5、4.0-8.0、5.0-8.0、5.5-7.5、或5.5-6.5。在一些方面，pH可以是约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。可以通过添加或掺入适合的缓冲液来调节或控制pH，所述缓冲液包括但不限于：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸盐、或其组合。在本文的反应组合物中的缓冲液浓度可以是例如约0.1-300mM、0.1-100mM、10-100mM、10mM、20mM或50mM。

反应组合物可以包含在适合用于应用本文公开的一种或多种反应条件的任何容器(例如，惰性容器/器皿)中。在一些方面，惰性容器可以是不锈钢、塑料、或玻璃的(或包含这些组分中的两种或更多种)并且具有适合于容纳特定反应的尺寸。例如，惰性容器的体积/容量(和/或本文中的反应组合物的体积)可以是约或至少约1、10、50、100、500、1000、2500、5000、10000、12500、15000、或20000升。惰性容器可以任选地配备有搅拌装置。例如，任何前述特征可用于表征本文的分离反应。

本文的反应组合物可以包含一种、两种或更多种不同的葡糖基转移酶，例如，只要至少一种酶是如目前公开的非天然葡糖基转移酶。在一些实施例中，仅一种或两种葡糖基转移酶包含在反应组合物中。本文的葡糖基转移酶反应可以是并且典型地是不含细胞的(例如，无全细胞存在)。

本文公开的关于反应组合物的任何特征(例如，以上和下面的实例中)可以表征本文的葡聚糖生产方法的合适方面，反之亦然。

本公开还涉及用于产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖以及如本文公开的产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的至少一种非天然葡糖基转移酶接触，从而产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；和(b)任选地，分离在步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖。当利用本文的反应组合物时，典型地还进行这样的方法，所述方法可以任选地被表征为葡聚糖合成方法。

如目前公开的葡聚糖合成方法包括使至少水、蔗糖以及产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的本文的非天然葡糖基转移酶接触。如下文的讨论，可以将这些和任选地其他试剂一起添加或按任何顺序添加。该步骤可任选地被表征为提供反应组合物，所述反应组合物包含水、蔗糖以及合成包含α-1，3-键的不溶性α-葡聚糖的非天然葡糖基转移酶。本文的接触步骤能以任何数目的方式进行。例如，可以首先将所希望的量的蔗糖溶解在水中(任选地，也可以在这个制备阶段添加其他组分，例如缓冲液组分)，接着添加葡糖基转移酶。溶液可以保持静止，或经由例如搅拌或轨道振摇而搅动。葡聚糖合成方法可以通过分批、补料分批、连续模式或通过这些模式的任何变化来进行。

在某些实施例中，反应的完成可以目视地(例如，无更多的不溶性葡聚糖积累)，和/或通过测量溶液中剩余的蔗糖的量(残余的蔗糖)来确定，其中至少约90％、95％或99％的蔗糖消耗百分比可以表示反应完成。所公开方法的反应可以进行例如约1小时至约或至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72、96、120、144或168小时。

在本文葡聚糖合成方法的一些方面中产生的不溶性α-葡聚糖的分子量可以比由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量低约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％。在一些方面，在进行约36-60小时(例如，约48小时)的反应中，实现了这样的分子量的下调。

可任选地分离本文方法中产生的包含α-1，3-键的不溶性α-葡聚糖。在某些实施例中，分离不溶性α-葡聚糖至少可包括进行离心和/或过滤的步骤。分离可以任选地进一步包括用水或其他水性液体洗涤不溶性α-葡聚糖一次、两次或更多次，和/或干燥所述不溶性α-葡聚糖产物。

可以将用于合成不溶性α-葡聚糖的任何公开的条件(例如前述或在以下实例中描述的那些)应用于实践如目前公开的反应组合物(并且反之亦然)，和/或因此用于表征非天然葡糖基转移酶的特征/活性。

在一些方面，已经分离的(任选地表征为“纯化的”)不溶性α-葡聚糖产物可以以至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的wt％(以干重计)存在于组合物中。例如，这种分离的聚合物可以用作产品/应用中的成分/组分。

本公开还涉及制备编码本文的非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列的方法。该方法包括：

(a)鉴定编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述亲本葡糖基转移酶(i)包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的位置55-960具有至少约40％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及

(b)修饰步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列以在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处取代亲本葡糖基转移酶的至少一个氨基酸，从而提供编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述非天然葡糖基转移酶合成包含α-1，3-糖苷键并且具有分子量低于由亲本葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量的不溶性α-葡聚糖。

这种方法可任选地进一步包括使用以这种方式制备的多核苷酸用于表达由所述多核苷酸编码的非天然葡糖基转移酶的方法中。这种表达方法可以遵循例如如本领域已知的任何异源蛋白质表达方法。制备多核苷酸的本方法可任选地可替代地被表征为降低葡糖基转移酶的产物分子量的方法。

例如，本文的亲本葡糖基转移酶可以包含与SEQ ID NO：4(任选地无其起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：4的位置55-960(大致催化结构域)具有至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、69％、70％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列。应注意仅出于参考目的，无其起始甲硫氨酸的SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：62的子序列。

在一些情况下，本文的鉴定步骤(a)可以包括鉴定亲本葡糖基转移酶的氨基酸序列。可以根据遗传密码(密码子)(例如鉴定出亲本葡糖基转移酶的物种中使用的遗传密码)从该氨基酸序列确定多核苷酸序列。

例如，可以按以下进行鉴定编码本文的亲本葡糖基转移酶的多核苷酸：(a)在计算机芯片上，(b)用包括核酸杂交步骤的方法，(c)用包括蛋白质测序步骤的方法，和/或(d)用包括蛋白质结合步骤的方法。

关于在计算机芯片上检测，可以将存储在计算机或数据库(例如，公共数据库，例如GENBANK、EMBL、REFSEQ、GENEPEPT、SWISS-PROT、PIR、PDB)中的候选亲本葡糖基转移酶的氨基酸序列(和/或编码这样的葡糖基转移酶的核苷酸序列)在计算机芯片上进行评估以鉴定葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶包含与如上文所述的亲本葡糖基转移酶具有百分比序列同一性的氨基酸序列。这样的评估可以包括使用本领域已知的任何手段，例如通过使用如以上描述的比对算法或软件(例如，BLASTN、BLASTP、ClustalW、ClustalV、Clustal-Omega、EMBOSS)。

可以任选地通过包括核酸杂交步骤的方法进行如以上公开的亲本葡糖基转移酶的鉴定。这样的方法可以包括使用例如DNA杂交(例如DNA印迹、斑点印迹)、RNA杂交(例如RNA印迹)，或具有核酸杂交步骤的任何其他的方法(例如DNA测序、PCR、RT-PCR，所有这些都可以包括寡核苷酸的杂交)。例如，在这样的杂交中，可以将编码SEQ ID NO：4或其子序列(例如，SEQ ID NO：4的位置55-960)的多核苷酸序列用作探针。用于进行杂交方法的条件和参数通常是熟知的并且公开于以下文献中：例如，在Sambrook J，Fritsch EF和ManiatisT，

可以任选地通过包括蛋白质测序步骤的方法进行如以上公开的亲本葡糖基转移酶的鉴定。这样的蛋白质测序步骤可以包括一种或多种程序，例如N-末端氨基酸分析、C-末端氨基酸分析、埃德曼降解、或质谱法。

可以任选地通过包括蛋白质结合步骤的方法进行如以上公开的亲本葡糖基转移酶的鉴定。可以使用例如与SEQ ID NO：4内(例如，SEQ ID NO：4的位置55-960内)的基序或表位结合的抗体进行这样的蛋白质结合步骤。

在一些方面，步骤(a)中鉴定的多核苷酸(即，在步骤[b]中进行其修饰之前)可以编码葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶包含与表1中公开的任何葡糖基转移酶的氨基酸序列相同或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列。由这种葡糖基转移酶产生的α-葡聚糖可以例如是如本文所公开的。

制备编码本文的非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列的方法包括修饰步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列(编码亲本葡糖基转移酶)的步骤(b)。这种修饰取代与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处的亲本葡糖基转移酶的至少一个氨基酸。由这样的一个或多个取代得到的非天然葡糖基转移酶(由经修饰的多核苷酸序列编码)可以任选地被表征为本文的“子代葡糖基转移酶”。

对步骤(b)中多核苷酸的适合的修饰可以遵循本领域已知的任何DNA操作技术进行。修饰步骤(b)可任选地在计算机芯片上进行，然后合成编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列。例如，可以使用合适的序列操作程序/软件(例如，VECTOR NTI，生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州；DNAStrider；DNASTAR，麦迪逊，威斯康星州)在计算机芯片上对步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列进行操作。在这种虚拟操作之后，可以通过任何合适的技术(例如，基于退火的寡核苷酸连接，或在Hughes等人，Methods Enzymol.[酶学方法]498：277-309中公开的任何技术，将所述文献通过引用并入本文)人工合成经修饰的多核苷酸序列。应当理解，不认为前述方法必然依赖于使预先存在的多核苷酸(编码亲本葡糖基转移酶)受控。

使用在步骤(a)中鉴定的编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列的物理拷贝可以任选地进行修饰步骤(b)。作为实例，使用按使得扩增产物编码本文的非天然葡糖基转移酶的方式设计的引物，这样的多核苷酸可以用作扩增模板(例如，参考Innis等人，同上)。

该方法中的氨基酸取代可以是如本文公开的那些一个或多个组合的任何一个。例如，基本上，如目前公开的任何非天然葡糖基转移酶可以通过如通过这种方法制备的多核苷酸编码。

本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：

1.一种非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量低于由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。

2.如实施例1所述的非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ IDNO：62的氨基酸残基Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。

3.如实施例1或2所述的非天然葡糖基转移酶，其中：(i)在与氨基酸残基Leu-513相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代；(ii)在与氨基酸残基Pro-550相对应的位置处的氨基酸被Leu、Val、或Ile残基取代；(iii)在与氨基酸残基Ser-553相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Glu、Phe、His、Ile、Met、Asn、Arg、Thr、Val、或Tyr残基取代；(iv)在与氨基酸残基Asn-557相对应的位置处的氨基酸被Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、或Ser残基取代；(v)在与氨基酸残基Asn-558相对应的位置处的氨基酸被Asp或Glu残基取代；(vi)在与氨基酸残基Trp-571相对应的位置处的氨基酸被Val、Asp、Cys、Ile、Leu、Glu、或Ser残基取代；(vii)在与氨基酸残基Asn-573相对应的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Thr、Val、或Trp残基取代；(viii)在与氨基酸残基Asp-575相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr残基取代；(ix)在与氨基酸残基Lys-578相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代；(x)在与氨基酸残基Asn-581相对应的位置处的氨基酸被Pro或Gly残基取代；(xi)在与氨基酸残基Thr-585相对应的位置处的氨基酸被Pro或Gly残基取代；和/或(xii)在与氨基酸残基Gln-616相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代。

4.如实施例1、2、或3所述的非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶包含两个或更多个氨基酸取代，其中所述取代中的至少一个在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处。

5.如实施例4所述的非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ IDNO：62的氨基酸残基Pro-550、Asn-557、Asn-558、Asn-581、或Thr-585相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代；任选地，其中：(i)在与氨基酸残基Pro-550相对应的位置处的氨基酸被Leu、Val、或Ile残基取代；(ii)在与氨基酸残基Asn-557相对应的位置处的氨基酸被Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、或Ser残基取代；(iii)在与氨基酸残基Asn-558相对应的位置处的氨基酸被Asp或Glu残基取代；(iv)在与氨基酸残基Asn-581相对应的位置处的氨基酸被Pro或Gly残基取代；和/或(v)在与氨基酸残基Thr-585相对应的位置处的氨基酸被Pro或Gly残基取代。

6.如实施例1、2、3、4、或5所述的非天然葡糖基转移酶，其中所述不溶性α-葡聚糖包含至少约50％的α-1，3-糖苷键。

7.如实施例6所述的非天然葡糖基转移酶，其中所述不溶性α-葡聚糖包含至少约90％的α-1，3-糖苷键。

8.如实施例1、2、3、4、5、6、或7所述的非天然葡糖基转移酶，其中所述不溶性α-葡聚糖具有小于约300的重均聚合度(DPw)。

9.如实施例8所述的非天然葡糖基转移酶，其中所述不溶性α-葡聚糖具有小于约150的DPw。

10.如实施例9所述的非天然葡糖基转移酶，其中所述不溶性α-葡聚糖具有小于约75的DPw。

11.如实施例6、7、8、9或10所述的非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4的残基55-960、SEQ ID NO：65的残基54-957、SEQ ID NO：30的残基55-960、SEQ ID NO：28的残基55-960、或SEQ ID NO：20的残基55-960具有至少约90％同一性的催化结构域。

12.如实施例11所述的非天然葡糖基转移酶，该非天然葡糖基转移酶包含与SEQID NO：4、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：28、或SEQ ID NO：20具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

13.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12所述的非天然葡糖基转移酶，其中不溶性α-葡聚糖的分子量比由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量低至少约10％。

14.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如实施例1-13中任一项所述的非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列，任选地其中一个或多个调节序列可操作地连接到所述核苷酸序列，并且优选地其中所述一个或多个调节序列包含启动子序列。

15.一种反应组合物，所述反应组合物包含水、蔗糖以及如实施例1-13中任一项所述的非天然葡糖基转移酶。

16.一种产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖以及如实施例1-13中任一项所述的非天然葡糖基转移酶接触，从而产生包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；和(b)任选地，分离在步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖。

17.一种制备编码非天然葡糖基转移酶(例如，如实施例1-13中任一项所述的)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)鉴定编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述亲本葡糖基转移酶(i)包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的位置55-960具有至少约40％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及(b)修饰步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列以在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处取代亲本葡糖基转移酶的至少一个氨基酸，从而提供编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述非天然葡糖基转移酶合成包含α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，其中不溶性α-葡聚糖的分子量低于由亲本葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量。

18.如实施例17所述的方法，其中按以下进行所述鉴定步骤：(a)在计算机芯片上，(b)用包括核酸杂交步骤的方法，(c)用包括蛋白质测序步骤的方法，和/或(d)用包括蛋白质结合步骤的方法；和/或其中按如下进行所述修饰步骤：(e)在计算机芯片上，随后合成编码所述非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，或(f)使用编码所述亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列的物理拷贝。

本公开在以下实例中进一步举例说明。应当理解，尽管这些实例说明了本文的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。从上述论述和这些实例中，本领域的技术人员可以确定所公开的实施例的本质特征，并且在不脱离所公开的实施例的精神和范围的情况下，可以进行各种变化和修改以使所公开的实施例适应多种用途和条件。

本实例描述了对产生具有降低的分子量的α-葡聚糖的葡糖基转移酶变体的筛选。

在所述实例中用于制备氨基酸取代的葡糖基转移酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：4(GTF 6855)，所述序列本质上是来自唾液链球菌SK126(参见表1)的全长野生型葡糖基转移酶(由SEQ ID NO：62表示)的N-末端截短(去除信号肽和可变区)形式。SEQ ID NO：4中做出的取代可以被表征为取代天然氨基酸残基，因为SEQ ID NO：4的每个氨基酸残基/位置(除了SEQ ID NO：4的Met-1残基)与SEQ ID NO：62中的氨基酸残基/位置相对应。在至少包含蔗糖和水的反应中，具有SEQ ID NO：4的葡糖基转移酶典型地产生具有约100％α-1，3键和重均聚合度(DPw)为400或更高的α-葡聚糖(例如，参考美国专利号8871474和9169506，和美国专利申请公开号2017/0002336，将这些文献通过引用并入本文)。例如，可以在酶催化合成后经由过滤分离该不溶性的α-葡聚糖产物。

使用基于PCR(聚合酶链式反应)的诱变方案(QUIKCHANGE LIGHTNING定点诱变试剂盒，安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州)，将单个突变单独引入编码SEQ ID NO：4的DNA序列。对每个突变，使用具有编码SEQ ID NO：4的DNA模板、编码突变的正向引物、和共有的反向引物的PCR来产生包含突变的DNA序列。

使用用于分别表达GTF 6855(SEQ ID NO：4)的多种单个氨基酸取代变体的质粒(基于pBAD载体)来转化大肠杆菌菌株Bw25113(ΔilvC)，大肠杆菌菌株Bw25113是具有一个另外的敲除(ΔilvC)的F

GTF 6855(SEQ ID NO：4)和其每个单个氨基酸取代变体分别进行葡聚糖合成反应，反应参数与以下相同或相似：容器，50-mL凹口摇瓶在75rpm下搅动；初始pH，5.7；反应体积，10mL；蔗糖，400g/L；GTF，0.3mL培养上清液(以上)；KH

基于表3的数据，明显的是，与通过未修饰的GTF 6855(SEQ ID NO：4)产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的分子量相比，GTF 6855(SEQ ID NO：4)中的某些氨基酸取代导致酶产生分子量降低的不溶性α-1，3-葡聚糖。对于表3中的那些产生不溶性葡聚糖的酶，除四个氨基酸取代之外的所有氨基酸取代导致分子量降低至少约23％；表3中列出的超过三分之二的氨基酸取代导致分子量降低50％或更多。例如，观察到分子量降低可高达约86％(D575P、Q616E)。

在该实例中，在任何前述位点的一个或多个取代(与SEQ ID NO：62的Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、或Gln-616相对应的位置)预期允许产生不溶性α-1，3-葡聚糖，该不溶性α-1，3-葡聚糖的DPw显著低于由亲本未经取代葡糖基转移酶产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的DPw。

该实例描述了以下操作的效果：将多个氨基酸取代引入葡糖基转移酶中并确定它们对其不溶性α-葡聚糖合成功能的影响。例如，该分析表明，上述为降低不溶性α-葡聚糖产物分子量而鉴定的氨基酸取代可以包括在同样赋予这种分子量影响的取代组合中。

简言之，通过定点诱变对SEQ ID NO：4(GTF 6855，参见表1和实例1中关于该葡糖基转移酶的描述)进行氨基酸取代的某些组合。对每个组合，QUIKCHANGE LIGHTNING定点诱变试剂盒以连续的方式使用以将每个取代引入编码SEQ ID NO：4的序列。下表4中列出了取代的每种组合。编码每个经修饰的葡糖基转移酶的序列被单独测序以确认预期的变化。然后根据实例1表达并制备每个氨基酸修饰的葡糖基转移酶。

每个修饰的葡糖基转移酶使用与实例1中使用的参数相同或相似的参数进行葡聚糖合成反应，随后将每个反应在80℃下加热灭活30分钟。分别收集反应中产生的不溶性葡聚糖聚合物，用水洗涤，并经由标准的SEC法分析分子大小。表4(以下)提供每个不溶性α-1，3-葡聚糖产物的DPw。

基于表4中的数据，明显的是，将多个氨基酸取代引入GTF 6855(SEQ ID NO：4)(其中一些组合包括实例1中所示的取代以降低分子量)可用于更好地产生较低分子量的不溶性α-1，3-葡聚糖。例如，将这些DPw值(表4)与通过无取代的GTF 6855(SEQ ID NO：4)产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的约350DPw(表3)进行比较。

明显的是，具有多个取代(包括例如在与(i)SEQ ID NO：62的Pro-550、Asn-557、Asn-558、Asn-581、和/或Thr-585，和/或(ii)SEQ ID NO：62的Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、和/或Gln-616相对应的位置处那些)的葡糖基转移酶可以产生具有降低的分子量的不溶性α-1，3-葡聚糖。

本实例描述了葡糖基转移酶反应中α-1，3-葡聚糖的合成，所述葡糖基转移酶反应含有预先修饰成具有18.6％α-1，2分支的右旋糖酐引物。对这些反应中使用的葡糖基转移酶进行修饰(如以上实例公开的)，以产生与由所述酶的未修饰对应物制备的葡聚糖产物相比具有较低分子量的α-1，3-葡聚糖。合成了包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。

产生了α-1，2-分支的右旋糖酐来引发用于α-1，3-葡聚糖合成的葡糖基转移酶反应。此引物的制备基本上如国际专利申请公开号WO 2017/091533和美国专利申请公开号2018/0282385中所述进行，所述专利均通过引用并入本文。简而言之，使用葡糖基转移酶GTF8117产生分子量为约14kDa(DPw为约89)的直链右旋糖酐(即，具有100％α-1，6糖苷键的多糖)。然后使用α-1，2-分支酶GTFJ18T1将此右旋糖酐修饰为具有18.6％α-1，2-分支。具有约104(约17kDa)的DPw和18.6％α-1，2-分支的所得右旋糖酐在本文中称为P5引物。

然后将P5引物包括在包含葡糖基转移酶的α-1，3-葡聚糖合成反应中，以产生包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。这些反应中使用的葡糖基转移酶是如以上实例2中描述的非天然的葡糖基转移酶(表4)。本实例中的酶制备如下进行。简而言之，使异源表达葡糖基转移酶的KOBW-3a细胞在含有100ng/mL氨苄西林(ampicillin)和0.025％L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下生长过夜。通过离心使细胞沉淀，然后在室温下用10体积％的

在50-mL玻璃凹口烧瓶中进行十三个单独的4.0-mLα-1，3-葡聚糖合成反应。每个反应包含水、蔗糖(约20、50或200g/L)、磷酸盐缓冲液(5mM，pH 5.7)、任选地P5引物(约0.2、1.0或5.0g/L)、和葡糖基转移酶(上文)。通过混合适量的P5引物(使用50g/L储备溶液)、0.2mL细胞裂解液(包含葡糖基转移酶)和相应的缓冲液来制备反应物。将这些制剂和蔗糖储备溶液(400g/L)中的每一种在35℃下加温至少30分钟。然后将合适体积的蔗糖溶液添加到每种制剂中以起始α-1，3-葡聚糖合成。反应在35℃下在摇动(10rpm)下进行约60小时。孵育后，将反应的全部内容物分别转移到15-mL离心管中，将所述离心管置于85℃的烤箱中约30分钟以使葡糖基转移酶失活，从而终止反应。通过SEC分析每个反应中产生的约300-500mg的湿饼，以确定不溶性聚合物产物的分子量和DP。表5提供了这些分析的结果。

设想接枝到每个含引物反应的葡聚糖产物中的引物上的单个α-1，3-葡聚糖臂的大小与不含添加的引物的对照反应中产生的α-1，3-葡聚糖的大小非常类似；对照反应产物包含α-1，3-葡聚糖均聚物。也就是说，似乎显而易见，随着每组反应系列(20、50或200g/L蔗糖)中引物浓度的增加，接枝共聚物产物DPw显著降低。

因此，使用本公开的非天然葡糖基转移酶合成了包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。引物经证明已被消耗并掺入到接枝共聚物产物中。虽然在本实例中α-1，2-分支的右旋糖酐被用作引物，但当使用未被α-1，3-分支修饰的右旋糖酐(如上所述)时也观察到了α-1，2-葡聚糖的合成(数据未显示)。

本实例描述了葡糖基转移酶反应中α-1，3-葡聚糖的合成，所述葡糖基转移酶反应含有预先修饰成具有9.7％α-1，2分支的右旋糖酐引物。对这些反应中使用的葡糖基转移酶进行修饰(如以上实例公开的)，以产生与由所述酶的未修饰对应物制备的葡聚糖产物相比具有较低分子量的α-1，3-葡聚糖。合成了包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。

产生了α-1，2-分支的右旋糖酐来引发用于α-1，3-葡聚糖合成的葡糖基转移酶反应。此引物的制备基本上如国际专利申请公开号WO2017/091533和美国专利申请公开号2018/0282385中所述进行。简而言之，使用葡糖基转移酶GTF6831产生分子量为约40kDa(DPw为约250)的直链右旋糖酐(即，具有100％α-1，6糖苷键的多糖)。然后使用α-1，2-分支酶GTFJ18T1将此右旋糖酐修饰为具有9.7％α-1，2-分支。所得DPw为约271(约44kDa)的α-1，2-分支的右旋糖酐在本文中称为P6引物。

然后将P6引物包括在包含葡糖基转移酶的α-1，3-葡聚糖合成反应中，以产生包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。这些反应中使用的葡糖基转移酶与实例3中使用和制备的相同。

在50-mL玻璃凹口烧瓶中进行十三个单独的4.0-mLα-1，3-葡聚糖合成反应。每个反应包含水、蔗糖(约20、50或200g/L)、磷酸盐缓冲液(5mM，pH 5.7)、任选地P6引物(约0.2、1.0或5.0g/L)、和葡糖基转移酶(上文)。通过混合适量的P6引物(使用50g/L储备溶液)、0.2mL细胞裂解液(包含葡糖基转移酶)和相应的缓冲液来制备反应物。将这些制剂和蔗糖储备溶液(400g/L)中的每一种在35℃下加温至少30分钟。然后将合适体积的蔗糖溶液添加到每种制剂中以起始α-1，3-葡聚糖合成。反应在35℃下在摇动(10rpm)下进行约60小时。孵育后，将反应的全部内容物分别转移到15-mL离心管中，将所述离心管置于85℃的烤箱中约30分钟以使葡糖基转移酶失活，从而终止反应。通过SEC分析每个反应中产生的约300-500mg的湿饼，以确定不溶性聚合物产物的分子量和DP。表6提供了这些反应的结果。

设想接枝到每个含引物反应的葡聚糖产物中的引物上的单个α-1，3-葡聚糖臂的大小与不含添加的引物的对照反应中产生的α-1，3-葡聚糖的大小非常类似；对照反应产物包含α-1，3-葡聚糖均聚物。也就是说，似乎显而易见，通常随着每组反应系列(20、50或200g/L蔗糖)中引物浓度的增加，接枝共聚物产物DPw显著降低。

因此，与实例3相似的，使用本公开的非天然葡糖基转移酶合成了包含右旋糖酐骨架和α-1，3-葡聚糖臂的接枝共聚物。引物经证明已被消耗并掺入到接枝共聚物产物中。