一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid,HA)，又称玻璃酸，是一种以乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸双糖单元交替连接而成的直链酸性黏多糖。透明质酸作为人体自有物质，广泛存在于人体的关节腔、皮肤、眼玻璃体、软骨、脐带等组织中。随着年龄的增长，透明质酸在人体内的含量会逐渐降低。这是导致关节僵化、皮肤老化、皱纹增多、眼花等诸多问题的主要原因之一。多项研究证明，通过口服透明质酸可以促进人体自身合成新的透明质酸，增加体内透明质酸的含量，进而可改善人体皮肤水分，具有体内抗氧化、改善关节功能、修复胃黏膜损伤等作用。因此，透明质酸是一种在日化、医药、生化与保健食品等领域内用途极为广泛、性能优良的功能性生化物质。

现阶段可食用的透明质酸主要来自于鸡冠以及C群链球菌的发酵。从鸡冠提取的透明质酸在食用安全上有人畜共通疾病病毒感染的疑虑。同时，透明质酸经过胃消化液之后会被酶分解，因而无法经由直接摄取透明质酸食品达到显著的效果。因此，通过食用可分泌透明质酸的菌株，使其在肠道定植，并持续分泌透明质酸，从而避免胃消化液对透明质酸的降解作用。然而，C群链球菌为不可用于食品的菌种。迄今为止，已知只有少数可食用的菌株具有分泌透明质酸的能力，例如嗜热链球菌YIT2084和格氏乳杆菌FTDC8131。另外，目前益生菌在抗衰老、促进组织修复中的研究和应用较少。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。

因此，提供一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)E2，其保藏编号为CGMCCNo.21770，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。

进一步，所述的一株鼠李糖乳杆菌E2在制备抗衰老、促进组织损伤修复产品中的应用。

所述一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2在体内氧化应激模型中具有降低斑马鱼体内ROS水平，和提高斑马鱼体内SOD活性的作用，表现出良好的抗氧化延缓衰老的益生功效。

所述一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2在斑马鱼损伤模型中，可显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复，表现出良好的促进组织损伤修复的潜力。

进一步，所述产品为食品、化妆品、药品。

进一步，所述的一株鼠李糖乳杆菌E2在产透明质酸中的应用。

进一步，所述的一株鼠李糖乳杆菌E2在制备发酵乳制品及其他发酵食品中的应用。

进一步，所述鼠李糖乳杆菌E2为菌悬液或发酵上清液。

本发明所述在体内氧化应激模型中能显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性，以及在斑马鱼损伤模型中也能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复的菌株E2，包括菌株E12的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用，鼠李糖乳杆菌E2是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在斑马鱼氧化应激模型中具有显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性，以及在斑马鱼损伤模型中也能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复；具备应用于体内抗衰老、促进组织修复的潜能，此为利用鼠李糖乳杆菌E2开发抗氧化延缓衰老、缓解皮肤老化、促进组织损伤修复的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2在MRS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2革兰氏染色后的显微形态观察；

图3附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2产透明质酸能力；

图4附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的直观图；

图5附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的统计图；

图6附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响；

图7附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的直观图；

图8附图为本发明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1鼠李糖乳杆菌E2分离、鉴定及保藏

(1)分离：将长寿老人粪便经梯度稀释后，分别接种于厌氧血琼脂培养基、MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养 12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株形态学鉴定：对筛选出的菌株革兰氏染色后于显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

(3)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过 PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株E2被鉴定为鼠李糖乳杆菌，其16S rDNA 序列如SEQ ID NO.3所示。

CTGGGCGTGTGCTACAATGCAAGTCGAACGAGTTCCGTTTATTTTT GCTTGTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAAATGCGTGCCGACCTGTA ACCGCTCCGAACCTGCCCTTGAAAGCGGGAGAACATGTGGAAACAGATGCTTATACCGCTGAAATCCAAGAACCGCATGGATCTTGGTTGAATGATG GCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAAATAGTTGGA GAGGTAACCGCTCACCAAAGGAATGATACGCACATTGAACTGAAGGAC GATCCACCACATTGCGACTGAGACACGGGCCAAACTCCTACCAAAGGC AGCAAGACTGAATCTTCCACAATGGACGAAGTCTGATGGAGCAACGCC GCGTGACTGATTTGGCTTTCGGAACGCAAAACTCTGTTGTTGCTTAAGA ATGGTCGCCGAGTAACTGTTGCCAGCGTGACGCGATCCAACCAAAAAG CCACGCGTAACTACGAGCCATTGGCCGCGAAAATA；SEQ ID NO.3。

菌株E2单菌落接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧生长良好，菌落白色、呈圆形、凸起、表面光滑、不透明、边缘整齐(图1)，革兰氏染色呈阳性(图2)。菌株E2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏编号为CGMCC No.21770。

实施例2鼠李糖乳杆菌E2产透明质酸能力测定

将鼠李糖乳杆菌E2接种于MRS液体培养基，置于厌氧工作站内37℃培养14h，调整菌株浓度为1×10

结果见图3。由图3可知，鼠李糖乳杆菌E2接种于培养基6h后即可发酵产生透明质酸，72h后几乎达到饱和浓度，最终透明质酸产量达到46.4±2.1 ng/mL。

实施例3鼠李糖乳杆菌E2发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体) 的制备

将鼠李糖乳杆菌E2活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养15 h后，调整发酵菌浓度为1×10

实施例4鼠李糖乳杆菌E2对斑马鱼氧化应激模型中ROS水平的影响

还原型谷胱甘肽(GSH)、甲萘醌、二甲基亚砜(DMSO)均购自上海源叶生物科技有限公司；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自 Sigma-Aldrich公司。

挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于 6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组，每组20条鱼。空白对照组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，菌悬液组加入菌悬液，发酵上清液组加入发酵上清液，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，空白对照组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，加入20μg/mL DCFH-DA溶液，每孔3mL， 28℃避光孵育1h后，用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，置于荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光强度并拍照记录。使用Image J软件对斑马鱼体内荧光强度 (S)进行定量统计分析。斑马鱼体内ROS水平计算如下：

采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

结果见图4、5；由图4和图5可知，斑马鱼体内绿色荧光的强弱反映ROS 水平的高低；与空白对照组相比，模型组斑马鱼体内绿色荧光强度增强，表明模型组斑马鱼体内ROS水平升高；同时，与空白对照组(100.00±4.14％) 相比，模型组斑马鱼体内ROS水平(172.30±8.38％)显著升高(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。

与模型组相比，阳性对照组(GSH)斑马鱼体内绿色荧光强度减弱，表明GSH在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时，阳性对照组斑马鱼体内ROS水平为108.23±6.18％，与模型组(172.30 ±8.38％)相比差异性显著(P<0.005)；因此，GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。与模型组相比，鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液组、菌悬液组斑马鱼体内绿色荧光强度也减弱，表明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液组、菌悬液组斑马鱼体内ROS水平分别为 117.39±5.45％、128.16±7.89％，与模型组(172.30±8.38％)相比较均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明表明鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著降低斑马鱼体内ROS水平，表现出良好抗氧化延缓衰老的作用。

实施例5鼠李糖乳杆菌E2对斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响

挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于 6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组，每组20条鱼。空白对照组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，菌悬液组加入菌悬液，发酵上清液组加入发酵上清液，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，空白对照组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管50mg 斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入250μL缓冲液(超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒缓冲溶液)。将离心管用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作5s、间隔8s，超声破碎10次，12000×g，4℃离心 10min，收集上清液。使用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(Sigma-Aldrich 公司)检测各组的SOD活性。

采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

结果见图6；由图6可知，与空白对照组(3.32±0.40U/mg)相比，模型组斑马鱼体内SOD活性(0.81±0.13U/mg)显著降低(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。

阳性对照组斑马鱼体内SOD活性为2.66±0.47U/mg，与模型组(0.81± 0.13U/mg)相比差异性显著(P<0.005)，表明GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。鼠李糖乳杆菌E2的发酵上清液组、菌悬液组斑马鱼体内 SOD活性分别为2.31±0.20U/mg、1.96±0.09U/mg，与模型组(0.81±0.13 U/mg)相比较均差异性显著(P<0.05)。因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌 E2的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著提高斑马鱼体内 SOD活性，增强机体清除自由基的能力，表现出良好抗氧化延缓衰老的作用。

实施例6鼠李糖乳杆菌E2对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响

挑选发育正常野生型AB系斑马鱼(3dpf)置于6孔细胞培养板中，于体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，并在0dpa(daypost amputation) 时拍照记录，然后转移至96孔细胞培养板中，模型组加入PBS，菌悬液组加入菌悬液，发酵上清液组加入发酵上清液，每孔200μL，每组15条，孵育至 3dpa后，用三卡因将斑马鱼麻醉，置于体视显微镜下拍照记录。利用Image J 软件分别统计在0dpa和3dpa时斑马鱼尾鳍长度为D1和D2。D1和D2之间的差值就是斑马鱼尾鳍再生长度。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

结果见图7和图8；由图7和图8可知，模型组的斑马鱼尾鳍未长完整，尾鳍再生长度为60.92±2.09μm。鼠李糖乳杆菌E2菌悬液组和发酵上清液组的斑马鱼尾鳍几乎已经长完整，尾鳍再生长度分别为75.38±2.20μm和88.60 ±3.03μm，与模型组(60.92±2.09μm)相比差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌E2的菌悬液、发酵上清液能够促进斑马鱼尾鳍的损伤修复，具有增强损伤组织的自身修复能力的潜力。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 佛山市朗芯生物科技有限公司 广东南芯医疗科技有限公司

<120> 一株产透明质酸的鼠李糖乳杆菌E2及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 517

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctgggcgtgt gctacaatgc aagtcgaacg agttccgttt atttttgctt gttgcatctt 60

gatttaattt tgaacgaaat gcgtgccgac ctgtaaccgc tccgaacctg cccttgaaag 120

cgggagaaca tgtggaaaca gatgcttata ccgctgaaat ccaagaaccg catggatctt 180

ggttgaatga tggcgtaagc tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt aaatagttgg 240

agaggtaacc gctcaccaaa ggaatgatac gcacattgaa ctgaaggacg atccaccaca 300

ttgcgactga gacacgggcc aaactcctac caaaggcagc aagactgaat cttccacaat 360

ggacgaagtc tgatggagca acgccgcgtg actgatttgg ctttcggaac gcaaaactct 420

gttgttgctt aagaatggtc gccgagtaac tgttgccagc gtgacgcgat ccaaccaaaa 480

agccacgcgt aactacgagc cattggccgc gaaaata 517