一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及间充质干细胞冻存技术领域，具体为一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC，mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞4点；

间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的细胞冻存方法，使具有临床应用价值的MSC能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要；

MSC的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，用含有特定成分的细胞冻存液制成单细胞悬液，分装于冻存管中后置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存，在细胞冻存过程中，冻存液只需要满足2个条件即可：一个是冻存液的组分要在环境温度从37℃到液氮保存中的-196℃时，可以不形成冰晶破损细胞；另一个条件是提供细胞所需的营养。于是，只需要寻找满足上述条件的材料即可开发新的冻存液。甘油，在低温环境下可以防止水分形成冰晶，在菌种保藏中被使用。提供营养，除了条件培养基可以提供说基础的无机盐，水分，氨基酸，脂类及细胞生存必需的生长因子等以外，人血清白蛋白也可以为细胞提供营养，并可以维持细胞正常渗透压，保持细胞膜完整性；

间充质干细胞冻存的方法在现有技术中采用最多的是利用冻存盒置于超低温冰箱中放置24～72h，再转移至液氮中进行长期的保存，但冻存盒在逐渐降温的过程中无法控制降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤，从而使间充质干细胞的复苏率降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，以解决上述背景技术中提出的最多的是利用冻存盒置于超低温冰箱中放置24～72h，再转移至液氮中进行长期的保存，但冻存盒在逐渐降温的过程中无法控制降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤，从而使间充质干细胞的复苏率降低的相关问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，所述冻存液的配方包括；成人血清、DMSO和1640培养液，所述成人血清的体积含量比为70％，所述DMSO的体积含量比为10％，所述1640培养液的体积含量比为20％。

优选的，所述冻存液在与间充质干细胞进行冻存时需要加入体积含量比为20％的成人血清。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种如上述的作为间充质干细胞的冻存液及冻存方法，其包括如下步骤。

S1、取出1瓶接种间充质干细胞100万左右，37℃、5％CO2培养3天左右，细胞长至80％融合度以上，即可以准备消化冻存。

S2、所述间充质干细胞需要加入10-20ml常温的PBS，轻柔晃动培养瓶，使PBS缓缓冲洗细胞层，并弃去培养液。

S3、所述间充质干细胞加入6ml胰蛋白酶消化液，然后晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖在干细胞层上。

S4、所述间充质干细胞加入6ml胰蛋白酶终止液，混匀。

S5、所述收集瓶中的细胞，用PBS清洗一次，并收到50ml离心管中，混匀取样计细胞数，300g并离心10min。

S6、所述按照瓶中的细胞密度，加入冻存液混匀，并加入到专用细胞冻存管中。

S7、所述用逐步降温法冻存细胞：第一阶段，用-20℃保存2个小时，第二阶段，用-80℃中保存2个小时或者过夜，第三阶段，随后可以在-196°C液氮中长期保存。

优选的，所述胰蛋白酶消化液中含有0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种如上述的作为间充质干细胞的冻存液及冻存方法，所述程序降温仪降温程序为；

第一阶段，冻存程序流程为减温速度-1～-2℃/min；

第二阶段，当温度达-25℃下列时，可升至-5℃～-10℃/min；

第三阶段，当温度达-100℃下列时，则可快速渗入液态氮中；

第四阶段，也可将配有体细胞的冻存管放进-20℃电冰箱2-4h，随后放进-70℃电冰箱中留宿，取下冻存管，移进液氮容器内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)该间充质干细胞的冻存液及冻存方法，通过冻存液的配方是由成人血清、DMSO和1640培养液混合配置而成，且成人血清、DMSO和1640培养液的体积含量比分别为70％、10％和20％，同时通过冻存液在与充质干细胞进行冻存是加入体积含量比为20％的成人血清，可以避免细胞在冻存时，可以尽可能降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，从提高细胞复苏时的存活率。

(2)该间充质干细胞的冻存液及冻存方法，通过间充质干细胞加入10-20ml常温的PBS，轻柔晃动培养瓶，使PBS缓缓冲洗细胞层，并弃去培养液，且在间充质干细胞加入6ml胰蛋白酶消化液，然后晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖在干细胞层上，且由于胰蛋白酶消化不可过度，需及时加入胰蛋白酶终止液，否则会对细胞膜造成伤害，并且通过充质干细胞，用PBS清洗一次，并收到50ml离心管中，混匀取样计细胞数，300g并离心10min，然后通过按照瓶中的细胞密度，加入冻存液混匀，并加入到专用细胞冻存管中。

(3)该间充质干细胞的冻存液及冻存方法，通过用逐步降温法冻存细胞：第一阶段，用-20℃保存2个小时，第二阶段，用-80℃中保存2个小时或者过夜，第三阶段，随后可以在-196℃液氮中长期保存，同时，第一阶段，冻存程序流程为减温速度-1～-2℃/min，当温度达-25℃下列时，可升至-5℃～-10℃/min，当温度达-100℃下列时，则可快速渗入液态氮中，避免了充质干细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，从提高细胞复苏时的存活率。

附图说明

图1为本发明的冻存液配置结构示意图；

图2为本发明的冻存液与充质干细胞冻存结构示意图；

图3为本发明的冻存液冻存方法示意图；

图4为本发明的冻存液冻存方法细节结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，请参阅图1和图2，本发明提供一种技术方案：一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，所述冻存液的配方包括；成人血清、DMSO和1640培养液，所述成人血清的体积含量比为70％，所述DMSO的体积含量比为10％，所述1640培养液的体积含量比为20％，所述冻存液在与间充质干细胞进行冻存时需要加入体积含量比为20％的成人血清，可以避免细胞在冻存时，可以尽可能降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，从提高细胞复苏时的存活率；

实施例2，请参阅图2-3，本发明提供一种技术方案：一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，包括如下步骤；

S1、取出1瓶接种间充质干细胞100万左右，37℃、5％CO2培养3天左右，细胞长至80％融合度以上，即可以准备消化冻存。

S2、所述间充质干细胞需要加入10-20ml常温的PBS，轻柔晃动培养瓶，使PBS缓缓冲洗细胞层，并弃去培养液。

S3、所述间充质干细胞加入6ml胰蛋白酶消化液，然后晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖在干细胞层上，所述胰蛋白酶消化液中含有0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA。

S4、所述间充质干细胞加入6ml胰蛋白酶终止液，混匀。

S5、所述收集瓶中的细胞，用PBS清洗一次，并收到50ml离心管中，混匀取样计细胞数，300g并离心10min。

S6、所述按照瓶中的细胞密度，加入冻存液混匀，并加入到专用细胞冻存管中。

S7、所述用逐步降温法冻存细胞：第一阶段，用-20℃保存2个小时，第二阶段，用-80℃中保存2个小时或者过夜，第三阶段，随后可以在-196°C液氮中长期保存；通过逐步降温法来冻存细胞，使减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，从提高细胞复苏时的存活率。

实施例3，请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，所述程序降温仪降温程序为；

第一阶段，冻存程序流程为减温速度-1～-2℃/min；

第二阶段，当温度达-25℃下列时，可升至-5℃～-10℃/min；

第三阶段，当温度达-100℃下列时，则可快速渗入液态氮中；

第四阶段，也可将配有体细胞的冻存管放进-20℃电冰箱2-4h，随后放进-70℃电冰箱中留宿，取下冻存管，移进液氮容器内。

实施例4，当对间充质干细胞进行复苏时，准备间充质干细胞基础培养基，室温复温1-2h，间充质干细胞无血清添加物，37℃水浴解冻，同时将冻存管自液氮中取出，立马放入37℃水浴中，晃动冻存管，待液体剩一点点冰团时取出冻存管，在用75％酒精表面消毒后放入洁净工作台，然后将冻存细胞取出，放入离心管中，加入20-40mlPBS，吹吸均匀，并以300g离心10min，然后离心前可取样计细胞数量及活率，离心后弃去上清液，于培养器皿中接种干细胞(5000-10000个/cm2)，加入干细胞完全培养基(SC2013G-A+SC2013G-B体积比9：1)，并将培养瓶置于37℃、5％CO2培养，使其间充质干细胞复苏成活率高；

工作原理：通过冻存液的配方是由成人血清、DMSO和1640培养液混合配置而成，且成人血清、DMSO和1640培养液的体积含量比分别为70％、10％和20％，同时通过冻存液在与充质干细胞进行冻存是加入体积含量比为20％的成人血清，可以避免细胞在冻存时，可以尽可能降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，从提高细胞复苏时的存活率，

当需要对充质干细胞进行冻存时，首先通过取出1瓶接种间充质干细胞100万左右，37℃、5％CO2培养3天左右，细胞长至80％融合度以上，即可以准备消化冻存，然后通过将取出的间充质干细胞内部需要加入10-20ml常温的PBS，轻柔晃动培养瓶，使PBS缓缓冲洗细胞层，此时需注意不要冲到瓶底细胞层，当冲洗完成并弃去培养液，然后通过向间充质干细胞内部加入6ml胰蛋白酶消化液，且胰蛋白酶消化液中含有0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA，然后晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖在干细胞层上，然后由于充质干细胞较易消化，一般半分钟即可消化完全，显微镜下观察至大部分细胞变圆，即将脱落，然后加入6ml胰蛋白酶终止液，混匀，胰蛋白酶消化不可过度，需及时加入胰蛋白酶终止液，否则会对细胞膜造成伤害，在接着通过将收集瓶中的细胞，用PBS清洗一次，并收到50ml离心管中，进行混匀取样计细胞数，使其每300g并离心10min，然后离心后弃去上青，按照瓶中的细胞密度，加入冻存液混匀，并加入到专用细胞冻存管中，同时用逐步降温法冻存细胞：第一阶段，用-20°

C保存2个小时，第二阶段，用-80℃中保存2个小时或者过夜，第三阶段，随后可以在-196℃液氮中长期保存；

冻存程序流程为，第一阶段，减温速度-1～-2℃/min。当温度达-25℃下列时，第二阶段，可升至-5℃～-10℃/min，当温度达-100℃下列时，

第三阶段，则可快速渗入液态氮中，同时也可将配有体细胞的冻存管放进-20℃电冰箱2-4h，随后放进-70℃电冰箱中留宿，取下冻存管，移进液氮容器内。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。