一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，更具体地，本发明涉及一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡及其制备方法，其特别适于牛尿液样品中氨苯砜的快速检测。

背景技术

氨苯砜(Dapsone,DDS)中文称4,4'-磺酰基二苯胺；或者4,4’-二氨基苯砜；分子式C12H12N2O2S,一种白色结晶粉末。由于其可以对麻风杆菌有较强的抑制作用，临床上主要用于麻风病和某些皮肤类基本的治疗。据报道较大剂量使用氨苯砜时会有明显的杀菌作用，和磺胺类增效剂有相似的作用机制，因此也可以作为磺胺增效剂用于水产品养殖过程，主要用于防治鱼类细菌性疾病。但是由于氨苯砜毒性较高，其具有较强的氧化能力，可以把血红蛋白中氧化成血铁蛋白，从而失去携带氧气的能力，进而引起也有血液系统疾病，如出现溶血性贫血和高铁血红蛋白血症，此外还有可能会造成周围神经炎、粒细胞缺乏症、肝肾功能损害或者精神障碍，严重的会出现死亡。为此我国农业部193号、235号公告做了明确规定，禁止以任何形式在所有食品动物中使用，而且不得在动物食品中检出；欧盟也在23777/90/37/2010中也进行了明确规定将氨苯砜列为禁用药物。

目前国内外关于食品中氨苯砜的报道主要在蜂蜜、牛奶、鸡肉、猪肉、鱼肉等样品的检测，常用的仪器方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MS法)，仪器方法可以实现精确的定量分析检测，都是也有其本身的不足，其设备昂贵，对人员的操作相对要求较高、样品的前处理比较复杂，检测成本较高、检测周期长，无法满足实际过程中大量样本的快速筛查需求。

此外已经报道的快速检测方法有酶联免疫法(ELISA)、化学发光分析法(CLA)和胶体金免疫层析法等方法，主要集中在组织类样本的可以实现样本的快速检测和大量筛查。但是也存在着滞后性，无法做到在动物养殖生产过程中的实时监测。因此市场上急需要一种既不对动物造成伤害，同时又可以实现在动物养殖过程中实时监测的快速检测方法。

本发明建立了牛尿液中氨苯砜残留量胶体金免疫层析快速检测方法，检测样本由传统的牛肌肉组织变成了尿液，样本不需要复杂的前处理，也缩短了前处理的时间，实现了养殖现场实时检测，同时不会对动物造成伤害。

发明内容

针对现有技术的不足，为解决上述仪器法的不足和弥补氨苯砜快速检测的研究空白,本发明提供了一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡及其制备方法与应用，该检测卡结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带、适用于大批量样品的氨苯砜半定量快速检测。

较为具体地，本发明第一方面提供了一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡，包括：外壳和其内部的试纸条。所述外壳包括底板和盖板；所述盖板上设有加样孔和结果判读窗口；所述试纸条包括背衬、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述金标垫上包被有胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上有包被氨苯砜—牛血清白蛋白复合物的检测线和羊抗兔IgG抗体的质控线；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫根据层析方向由下及上首尾衔接依次粘于背衬上。

作为第一方面产品的进一步优化方案，本发明具体限定了所述免疫层析试纸条的宽度为4mm。

较为具体地，本发明第二方面提供了一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡的制备方法，将样品垫靠近检测线端搭接于包被有氨苯砜—牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于背衬上；将羊品垫搭接于金标垫上粘于背衬上；将吸水垫靠近质控线端搭接于包被有氨苯砜包被抗原和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于底板上，搭接尺寸为2-4mm，切割成条；将上述试纸条装于外壳中得到氨苯砜胶体金免疫层析检测卡。

作为第二方面方法的进一步优化方案，本发明具体限定了所述包被有氨苯砜多克隆抗体金标垫制备方法包括：

将质量分数为0.01％的氯金酸水溶液加热至沸腾，向其中加入质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸30min，冷却后得到胶体金溶液；优选地所述氯金酸与柠檬酸三钠的质量为1:2-1:3；

用0.1mol/L pH 9.0硼酸缓冲液于搅拌条件下调节上述步骤所得胶体金溶液pH至7.2-7.8；

将氨苯砜多克隆抗体按质量浓度30-40mg/L加入至上述步骤所得胶体金溶液,搅拌均匀后室温静置10-20min，加入10％ BSA至最终质量浓度为1.5％-2％,静置5-10min，4℃12000-15000r/min离心，弃去上清液,得沉淀物；

加入1mL pH 7.8 20mmol/L PB缓冲液重悬沉淀物，震荡混匀，12000-15000rpm离心，弃去上清液，得到沉淀物；

将上述步骤所得沉淀物用胶体金重悬液重悬，得到混合液置于4℃冰箱中备用；

所述胶体金重悬液的与胶体金溶液的体积比为1:8-1:10；

所述胶体金重悬液为pH 7.4-7.8 20mmol/L PB缓冲液，含有2％-3％海藻糖、1％-2％BSA、0.5％-1％ Tween-20、0.1％-0.3％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％-0.1％ProClin 300；

将上述步骤得到的胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体用XYZ三维划膜喷金仪按4-6μL/cm包被量包被到宽度为0.8-1.0cm聚酯纤维金标垫上，后置于37-42℃烘干6-8h，得到包被有氨苯砜多克隆抗体金标垫。

作为第二方面方法的进一步优化方案，本发明具体限定了所述的背衬为PVC底板。

作为第二方面方法的进一步优化方案，本发明具体限定了所述样品垫为玻璃纤维，其制备方法为将玻璃纤维浸泡于20mmol/L pH7.4-7.8PB缓冲液中10min，37℃-42℃烘干备用，其中所述PB缓冲液含有1-1.5％BSA、0.5-1％Tween-20。

作为第二方面方法的进一步优化方案，本发明具体限定了所述硝酸纤维素膜的包被方法包括：

将氨苯砜—牛血清白蛋白复合物与硼酸缓冲液混合得到检测线包被溶液，将得到的包被溶液包被在靠近金标垫端的硝酸纤维素膜上，后置于37—42℃烘箱中烘烤10-12h；

所述检测线包被溶液浓度为0.8-1.0mg/mL；

所述硼酸缓冲液浓度为20-50mmol/L；

所述硼酸盐缓冲液的PH值为7.8-8.2；

所说硼酸盐缓冲液中含有质量分数为0.8％-1.2％NaCl和0.5-1.0％蔗糖。

将羊抗兔IgG抗体用磷酸缓冲液混合得到质控线包被溶液，将得到的包被溶液包被在靠近吸水垫端的硝酸纤维素膜上，后置于37—42℃烘箱中烘烤10-12h；

所述质控线包被溶液浓度为0.6-0.8mg/mL；

所述中磷酸缓冲液浓度为20-50mmol/L；

所述中磷酸盐缓冲液的PH值为7.2-7.4；

所述中磷酸盐缓冲液中含有质量分数为0.8-1.2％NaCl。

作为第二方面方法的进一步优化方案，本发明具体限定了所述吸水垫为吸水性材料。

较为具体地，本发明第三方面提供了一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡的检测方法，在加样孔中加入待检液后，待检液中的氨苯砜与硝酸纤维素膜检测线上包被的氨苯砜—牛血清白蛋白复合物竞争金标垫上包被的胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体，样品中氨苯砜的残留量在一定范围内与检测线的颜色深浅呈负相关，通过比较检测线和质控线的颜色深浅来判断样品中氨苯砜残留量是否超过检出限。

作为第三方面检测方法的进一步优化方案，本发明具体限定了取100—120μL待测液滴加于加样孔中静置5-8min，计时结束后，根据结果判断示意图进行结果判定。

作为第三方面检测方法的进一步优化方案，本发明具体限定了当检测线显色比质控线显色深或者两者一样深，表示样品中氨苯砜含量低于检出限或者不含氨苯砜；当检测线显色比质控线浅或者检测线不显色，表示样品中氨苯砜含量高于或等于检出限，检测线显色比质控线显色越浅，表示样品中氨苯砜含量越高；当质控线不显色，可能是操作不当或试纸条失效，需要用新的试纸条重新检测。

较为具体地，本发明第四方面提供了一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡在检测牛尿液中的应用。

作为第四方面应用的进一步优化方案，本发明具体限定了半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡在检测牛尿液时检出限为5μg/L。

综上所述，本发明主要具有以下有益效果：

本发明一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡及其制备方法主要采用竞争法半定量检测样品中氨苯砜的含量。与传统仪器分析技术相比，检测过程简单，设备简单，能同时检测大批量样品，具有人员要求低、检测快速简便、检测成本低、检测卡携带便利、结果判断简单直观、试纸条稳半定量强、易于保存等优点，尤其适宜基层实验室的大批量样品现场快速半定量检测。

附图说明

图1：本发明一种半定量检测氨苯砜的胶体金试纸条的结构示意图：

1.背衬,2.金标垫,3.样品垫,4.硝酸纤维素膜,5.吸水垫,6.检测线,7.质控线。

图2：本发明一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡结果判断示意图：

质控线(C线)，2.检测线(T线)，3.加样孔(S)。

图3：氨苯砜快速检测试纸条检测限结果；注：Ⅰ氨苯砜浓度0μg/L，Ⅱ氨苯砜浓度1.25μg/L，Ⅲ氨苯砜浓度2.5μg/L，Ⅳ氨苯砜浓度5μg/L，Ⅴ氨苯砜浓度10μg/。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。注：以下实施例中的实验方法，如无特殊要求，均为常规方法。下述实施例中的原料、试剂耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

如图1所示，一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡，包括外壳和其内部的试纸条。所述内部试纸条，包括背衬1、样品垫3、金标垫2、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；所述金标垫上包被有胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上有包被氨苯砜—牛血清白蛋白复合物的检测线6和羊抗兔IgG抗体的质控线7；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫根据层析方向由下及上首尾衔接依次粘于背衬上。

如图2所示，一种半定量检测氨苯砜的胶体金检测卡，检测结果判断，当检测线显色比质控线显色深或者两者一样深，表示样品中氨苯砜含量低于检出限或者不含氨苯砜；当检测线显色比质控线浅或者检测线不显色，表示样品中氨苯砜含量大于或等于检出限，检测线显色比质控线显色越浅，表示样品中氨苯砜含量越高；当质控线不显色，可能是操作不当或试纸条失效，需要用新的试纸条重新检测。

本发明通过抗原抗体高效特异性竞争结合特性，制备氨苯砜胶体金免疫层析检测卡，具有特异性强、灵敏度高(具体数据见下表1和图3)、性能稳定、操作简便快速、检测结果肉眼可判等有益效果，其可用于快速半定量检测牛尿液中氨苯砜的残留量，适宜基层实验室的大批量样品检测和养殖现场快速筛选，能够实现从源头上控制牛肉的质量安全。

表1氨苯砜快速检测试纸条特异性结果

注：*—表示阴性，#+表示阳性。

以下为本发明的实施例。

实施例1

一、金标垫的制备

(1)将质量分数为0.01％的氯金酸水溶液加热至沸腾，向其中加入质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸30min，冷却后得到胶体金溶液；优选地所述氯金酸与柠檬酸三钠的质量为1:2；

(2)用0.1mol/L pH 9.0硼酸缓冲液于搅拌条件下调节步骤(1)所得胶体金溶液pH至7.2-7.8；

(3)将氨苯砜多克隆抗体按质量浓度30mg/L加入至步骤(2)所得胶体金溶液,搅拌均匀后室温静置10min，加入10％ BSA至最终质量浓度为1.5％,静置5min，4℃12000r/min离心，弃去上清液,得沉淀物；

(4)加入1mL pH 7.4 20mmol/L PB缓冲液重悬沉淀物，震荡混匀，12000rpm离心，弃去上清液，得到沉淀物；

(5)将步骤(4)所得沉淀物用胶体金重悬液重悬，得到混合液置于4℃冰箱中备用，胶体金重悬液与步骤(2)胶体金溶液的体积比为1:8；

所述步骤(5)胶体金重悬液为pH 7.4 20mmol/L PB缓冲液，含有2％海藻糖、1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％ProClin 300；

(6)将步骤(5)得到的胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体用XYZ三维划膜喷金仪按4μL/cm包被量包被到宽度为0.8cm聚酯纤维金标垫上，后置于37℃烘干6h，得到包被有氨苯砜多克隆抗体金标垫。

二、样品垫的制备

将玻璃纤维裁剪为20mm宽的长条，浸泡于20mmol/L pH7.4 PB缓冲液中10min，37℃烘干备用，其中所述PB缓冲液含有1％BSA、0.5％Tween-20。

三、硝酸纤维素膜的包被

(1)将氨苯砜—牛血清白蛋白复合物用pH 7.8浓度为20mmol/L的含有质量分数为0.8％NaCl和0.5％蔗糖的硼酸缓冲液稀释至0.8mg/mL，将得到的包被溶液用XYZ三维喷金划膜仪包被在靠近金标垫端的硝酸纤维素膜上，包被量为1μL/cm,置于37℃烘箱中烘烤10h。

(2)将羊抗兔IgG抗体用pH 7.2浓度为20mmol/L的含有质量分数为0.8％NaCl的磷酸缓冲液稀释至0.6mg/mL，将得到的包被溶液用XYZ三维喷金划膜仪包被在靠近吸水垫端的硝酸纤维素膜上，包被量为1μL/cm，置于37℃烘箱中烘烤10h。

四、试纸条的组装

将金标垫靠近检测线端搭接于包被有氨苯砜—牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于背衬上；将样品垫搭接于金标垫上粘于背衬上；将吸水垫靠近质控线端搭接于包被有氨苯砜包被抗原和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于底板上，搭接尺寸为2mm，切割成4mm宽试纸条，得到氨苯砜试纸条；将上述试纸条装于外壳中得到氨苯砜胶体金免疫层析检测卡，密封干燥保存。

实施例2

一、金标垫的制备

(1)将质量分数为0.01％的氯金酸水溶液加热至沸腾，向其中加入质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸30min，冷却后得到胶体金溶液；优选地所述氯金酸与柠檬酸三钠的质量为1:3；

(2)用0.1mol/L pH 9.0硼酸缓冲液于搅拌条件下调节步骤(1)所得胶体金溶液pH至7.8；

(3)将氨苯砜多克隆抗体按质量浓度40mg/L加入至步骤(2)所得胶体金溶液,搅拌均匀后室温静置20min，加入10％ BSA至最终质量浓度为2％,静置10min，4℃15000r/min离心，弃去上清液,得沉淀物；

(4)加入1mL pH 7.8 20mmol/L PB缓冲液重悬沉淀物，震荡混匀，15000rpm离心，弃去上清液，得到沉淀物；

(5)将步骤(4)所得沉淀物用胶体金重悬液重悬，得到混合液置于4℃冰箱中备用，胶体金重悬液与步骤(2)胶体金溶液的体积比为1:10；

所述步骤(5)胶体金重悬液为pH 7.8 20mmol/L PB缓冲液，含有3％海藻糖、2％BSA、1％ Tween-20、0.3％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％ProClin 300；

(6)将步骤(5)得到的胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体用XYZ三维划膜喷金仪按6μL/cm包被量包被到宽度为1.0cm聚酯纤维金标垫上，后置于42℃烘干8h，得到包被有氨苯砜多克隆抗体金标垫。

二、样品垫的制备

将玻璃纤维裁剪为15mm宽的长条，浸泡于20mmol/L pH7.8 PB缓冲液中10min，42℃烘干备用，其中所述PB缓冲液含有1.5％BSA、1％Tween-20。

三、硝酸纤维素膜的包被

(1)将氨苯砜—牛血清白蛋白复合物用pH 8.2浓度为50mmol/L的含有质量分数为1.2％NaCl和1.0％蔗糖的硼酸缓冲液稀释至1.0mg/mL，将得到的包被溶液用XYZ三维喷金划膜仪包被在靠近金标垫端的硝酸纤维素膜上，包被量为1μL/cm,置于42℃烘箱中烘烤12h。

(2)将羊抗兔IgG抗体用pH 7.4浓度为50mmol/L的含有质量分数为1.2％NaCl的磷酸缓冲液稀释至0.8mg/mL，将得到的包被溶液用XYZ三维喷金划膜仪包被在靠近吸水垫端的硝酸纤维素膜上，包被量为1μL/cm，置于42℃烘箱中烘烤12h。

四、试纸条的组装

将金标垫靠近检测线端搭接于包被有氨苯砜—牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于背衬上；将样品垫搭接于金标垫上粘于背衬上；将吸水垫靠近质控线端搭接于包被有氨苯砜包被抗原和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜上粘于底板上，搭接尺寸为4mm，切割成4mm宽试纸条，得到氨苯砜试纸条；将上述试纸条装于外壳中得到氨苯砜胶体金免疫层析检测卡，密封干燥保存。

实施例3氨苯砜试纸条在检测牛尿液中是否含有氨苯砜的实际应用。

取牛尿液用定量滤纸过滤，取120μL滤液滴加于加样孔中静置5min，计时结束后，根据结果判断示意图进行结果判定。结果显示氨苯砜在检测牛尿液时最低检出限可以达到5μg/L。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。