一种灭活型病毒保存液及其应用

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及到一种灭活型病毒保存液及其应用。

背景技术

病毒是由一种核酸分子与蛋白质构成或仅由蛋白质构成，个体微小、结构简单，常见的流行传染病通常是RNA病毒，如流感病毒、艾滋病毒、甲流病毒以及新冠病毒。由于没有细胞结构，病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。病毒样本采集后，通常会将采样拭子放入保存液中保存、运输，储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

目前的灭活型病毒保存液一般都需要加入高浓度胍盐、核酸酶抑制剂、离子型表面活性剂和助溶剂，对于胍盐的选择通常为溶解能力和蛋白质变性能力都十分出色的异硫氰酸胍。然而，由于胍盐与阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基磺酸钠(SDBS)联用时，容易产生沉淀和产生气泡，不利于保存液的罐装、装量精度欠佳，形成的沉淀保存液则会造成材料过多的消耗而增加成本，后续核酸提取实验前对采样管颠倒混匀产生大量气泡也会给使用人员增添不必要的困扰。

并且，市面上的病毒保存液发挥灭活效果都需要10～30分钟不等，有些长达1～2小时。如果保存液中的异硫氰酸胍浓度过低，在样本采集和运输过程中，容易造成灭活效率未达标，发生意外泄露，会给相关采集人员、运输人员、实验人员等造成生物感染风险。但是异硫氰酸胍浓度过高的保存液，异硫氰酸胍容易析出且会影响核酸提取质量，抑制PCR检测。因此，针对以上问题，需要开发一款新型的病毒保存液。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种灭活型病毒保存液。

本发明所采取的技术方案是：

第一个方面，本发明提供了一种灭活型病毒保存液，包括以下组分：70～170g/L异硫氰酸胍，6～10mg/L吐温-20，0.7～1.0g/L三羟甲基氨基甲烷，0.1～1.0g/L EDTA，6～12g/LHanks平衡盐溶液，超纯水以及pH指示剂。

在一些实例中，所述的保存液的pH值为8～9。

在一些实例中，所述的异硫氰酸胍的质量浓度为70～120g/L。

在一些实例中，所述的吐温-20的质量浓度为7～9mg/L。

在一些实例中，所述的三羟甲基氨基甲烷的质量浓度为0.7～0.9g/L。

在一些实例中，所述的EDTA的质量浓度为0.1～0.3g/L。

在一些实例中，所述的Hanks平衡盐溶液的质量浓度为8～12g/L。

在一些实例中，所述的pH指示剂为酚红。

在一些实例中，所述的保存液各组分的质量浓度分别为：异硫氰酸胍为80g/L，吐温-20为8mg/L，三羟甲基氨基甲烷为0.8g/L，EDTA为0.2g/L，Hanks平衡盐溶液为10g/L。

上述各技术特征在不冲突的情况下，可以任意结合。

第二个方面，本发明提供的灭活型病毒保存液在保存病毒样本中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明能适应多种温度进行存储，实验证明，本发明样本核酸在2～8℃或37℃环境下保存6～7天，未发生明显核酸降解，不影响病毒样本的检测灵敏度。因此，本发明降低了病毒样本采集、运输以及保存对环境温度的依赖，适合野外、流动采样；

(2)本发明加入的异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致其细胞结构破碎，从而抑制RNA的降解；

(3)本发明采用的非离子型表面活性剂吐温-20，解决了目前的病毒保存液在不同的存储温度、高浓度的变性剂存在条件下，容易产生沉淀和气泡的问题；

(4)本发明通过加入的强离子离液盐异硫氰酸胍与金属螯合剂EDTA的作用下，能快速地使病毒蛋白变性，同时在增溶剂吐温-20的作用下，结合的蛋白质能快速均匀分散，不形成沉淀，通过Tris-Base(三羟甲基氨基甲烷)作为生物缓冲剂保持本发明的溶液pH稳定，在以上四种成分的协同作用下，本发明在30秒内即可达到灭活率大于99.99％的效果，灭活效率高，大大缩短了灭活处理的时间，同时该浓度下的异硫氰酸胍和EDTA不会抑制后续PCR实验，不影响试剂盒的最低检出限；

(5)本发明添加了酚红指示剂，若保存液发生了变质等影响pH值的不良事件通过指示剂的颜色便能快速分辨出来，为检测人员提高了效率，易于观察和辨识；

(6)本发明组成材料简单，且为市面上常见采购的物料，进一步地控制了生产成本，提高了生产的可行性，减低了防疫成本。

具体实施方式

本发明提供了一种灭活型病毒保存液，包括以下组分：70～170g/L异硫氰酸胍，6～10mg/L吐温-20，0.7～1.0g/L三羟甲基氨基甲烷，0.1～1.0g/L EDTA，6～12g/L Hanks平衡盐溶液，超纯水以及pH指示剂。

在一些实例中，所述的保存液的pH值为8～9。这一pH值下，保存液具有相对更好的稳定性，也有利于保证核酸的稳定性。

在一些实例中，所述的异硫氰酸胍的质量浓度为70～120g/L。本发明的实验数据表明，在这一浓度下，既具有良好的灭活效果，又可以避免其浓度过高带来的不利影响。

在一些实例中，所述的吐温-20的质量浓度为7～9mg/L。实验数据显示，这一浓度下，具有良好的协同作用。

在一些实例中，所述的三羟甲基氨基甲烷的质量浓度为0.7～0.9g/L。

在一些实例中，所述的EDTA的质量浓度为0.1～0.3g/L。

在一些实例中，所述的Hanks平衡盐溶液的质量浓度为8～12g/L。

pH指示剂可以是周知的指示剂，在一些实例中，所述的pH指示剂为酚红。酚红的指示效果更为明显，更易于观察，同时成本相对较低。

在一些实例中，所述的保存液各组分的质量浓度分别为：异硫氰酸胍为80g/L，吐温-20为8mg/L，三羟甲基氨基甲烷为0.8g/L，EDTA为0.2g/L，Hanks平衡盐溶液为10g/L。

为了对本发明的技术特征，效果更加清楚的展示，下面结合应用对本发明进一步说明。

按照表1进行新型冠状病毒保存液的配置。

表1新型冠状病毒保存液的配置

然后以表1中所述的实施例1和对比例1～3为例，具体阐述本发明的病毒核酸保存能力和灭活效果验证。

实验一：新型冠状病毒保存液核酸保存能力验证

本实验所用的病毒核酸样本为菁良基因2019新型冠状病毒(2019-nCoV)全基因组假病毒冻干珠质控品，靶值为1000copies/颗，该产品覆盖新型冠状病毒核酸全基因组序列(Genbank登记号：MN908947.3)，含人源RNaseP基因序列。核酸检测试剂为硕世生物生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。所述的新冠质控品样本分别加至本发明的新型冠状病毒保存液和对照组(百泰克)的病毒保存液中，混合均匀，分别等量分成36份，一共72份，分别保存于对应的温度；保存时长设置为0天(6小时)、1天、2天、3天、4天、6天、7天；保存温度设置为4℃和37℃；

采用杭州博日科技股份有限公司的全自动核酸提取纯化仪(仪器型号NPA-96T)及MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒Ⅲ对保存的样本进行提取，按表2进行自动化提取实验。

表2自动化提取实验设置

提取好的样本核酸采用上海宏石医疗科技有限公司荧光定量PCR仪(仪器型号SLAN-96S)及江苏硕世生物科技股份有限公司的新型冠状病毒(2019)核酸检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，得到对应的Ct值，具体操作如下：取出试剂盒在室温下融化并震荡混匀后，低速离心10秒，计算需准备反应试剂人份数。每人份反应体系配置如表3：

表3反应体系配置表

在上述准备好试剂的PCR管中分别加入提取好的样本核酸各5μL，总反应体积25μL，盖紧管盖，瞬时低速离心；将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测，程序设置如表4：

表4PCR程序设置表

每组样品做3个重复，实验具体设置如表5，取Ct值平均数；通过比较不同保存时长和不同温度保存下的Ct值变化，评估病毒保存液的核酸保存能力。

表5实验一方案设置

本实验的结果如表6所示。

表6实验一方案结果

表7实验组和对照组Ct值差值

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结果显示，无论是实验组还是对照组(已上市产品)保存时间7天与保存0天的CT值相近，表明核酸未存在降解；实验组与对照组的CT值无明显差异，如表7所示，提示两者核酸样本保存能力相近。

实验二：病毒保存液的灭活效率验证

表8实验二方案设置

方案按照《消毒技术规范》2.1.1.10病毒灭活试验方法，以甲型流感病毒作试验病毒，MDCK细胞为宿主进行试验；用本发明处理病毒样品作为实验组，经除药处理后检测病毒感染滴度，如表8所示，共设置4个组，其对应的样本保存液配置方式见表1；阳性对照组中，用无菌去离子水代替本产品，对照组病毒感染滴度为10

1)从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10mL完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时用于试验；

2)取出低温冻存的毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒；

3)取适量的本发明产品，于20℃±1℃水浴中备用；

4)取100μL有机干扰物质与100μL病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8mL本发明，立即混匀并记时。作用规定时间后立即取出0.1mL，用经鉴定合格的除药方法处理；

5)用细胞维持培养液对待测样本做10倍系列稀释，在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔，在37℃，放置1h～2h，取出培养板，更换细胞维持培养液；

6)继续放入二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO

7)阳性对照组试验中，用无菌水代替本发明；

8)各组分别进行病毒滴度测定，采用终点稀释法进行。

方案设置每组实验均为3个重复，结果取其平均值；检测得到阳性对照组的病毒感染滴度对数值N

表9实验二结果(感染滴度平均值对数值lg)

表10病毒灭活率结果

结果表明，实施例1在处理病毒样品时只需要30秒就能达到灭活率99.99％的效果，若延长时间到1小时，灭活效率可达到99.999％；对比例1～3的效果相对于实施例1较差些，说明本发明中异硫氰酸胍、吐温-20、EDTA、Tris-Base在灭活病毒有协同促进的作用。

综上，本发明在配方优化后，能使病毒在30秒就能达到99.99％的灭活率，在配方优化的同时，核酸保存能力仍与上市的产品相当。可见，本发明运用场景广，成本控制理想，同时解决了现在的保存液易于起泡和沉淀析出的问题。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。