一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒及其应用

技术领域

本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒及其应用。

背景技术

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的分裂和不分裂细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100％，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大(可以高达8Kb)；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

缺氧是导致众多疾病的重要原因，例如心肌缺血再灌注损伤和脑卒中等。血管平滑肌是构成血管壁的主要成分之一，其强大的生长加速潜能成为了众多血管源性疾病发生发展的关键因素。缺氧会损伤血管平滑肌的结构及功能，但在缺氧条件下对其保护一直存在困难，因而需要一种有效的治疗缺氧暴露下导致血管平滑肌损伤的方法。

MICU1作为线粒体钙调节的门控分子，在平滑肌细胞中表达十分丰富，且其关键性在多种缺血缺氧性疾病中得到证实。MICU1作为调节线粒体钙平衡的蛋白，在线粒体钙摄取过程中发挥着重要的门控作用。MICU1的分子量大小约为54kDa，位于线粒体内膜，作为一种单跨膜结构，由两个典型的“EF”结构域构成。MICU1与MCU高度关联。MICU1的作用是感受线粒体胞浆中钙离子的浓度变化以及与MCU共同调节钙离子的摄取。这在维持细胞的能量代谢以及正常的生理进程中扮演着重要角色。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒及其应用，保护缺氧暴露下导致的血管平滑肌损伤。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种重组腺病毒载体质粒，将MICU1的编码基因重组至pAdEasy-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP载体，得到重组腺病毒载体质粒；

其中，所述MICU1的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述重组腺病毒载体质粒经由KpnI和XhoI双酶切pAdEasy-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP载体，与MICU1的编码基因连接、转化后构建得到。

本发明还公开了一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒，由上述重组腺病毒载体质粒和骨架质粒转染293A细胞得到。

优选地，骨架质粒为pAdeasy-1。

优选地，转染293A细胞所用的转染试剂为Lipofiter

优选地，所述重组腺病毒的滴度为1.26×10

本发明还公开了上述一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒在制备预防和/或治疗血管平滑肌损伤药物中的应用。

优选地，所述血管平滑肌损伤为缺氧暴露下导致的血管平滑肌损伤。

本发明还公开了一种预防和/或治疗缺氧暴露下导致的血管平滑肌损伤的药物，它的活性成分包括上述一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒。

优选地，所述药物的剂型为注射剂、喷涂剂、滴剂、喷雾剂或冻干粉。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒，将MICU1的编码基因作为目的基因构建重组腺病毒，MICU1可受缺氧调节，细胞MICU1过表达可促进细胞增殖，对抗缺氧损伤，而腺病毒宿主范围广，既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞，具有嗜上皮细胞特性，病毒滴度高，且具有较好的生物安全性。通过荧光检测发现得到的重组腺病毒具有良好的转染效率，通过细胞凋亡检测实验发现得到的重组腺病毒能够显著减少急性缺氧暴露下的小鼠脑血管平滑肌细胞凋亡，证明得到的重组腺病毒能够有效上调血管平滑肌细胞中MICU1的表达，保护细胞在缺氧状态下的损伤。

附图说明

图1为本发明的pAdEasy-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP载体图；

图2为本发明的两个克隆测序对比结果图；其中，绿色区域为与目的序列匹配部分；

图3为本发明的P1代细胞出毒迹象图；其中，P1(倍数：10*10)；

图4为本发明的P2代细胞出毒迹象图；其中，P2(倍数：10*10)；

图5为本发明的P3代细胞出毒迹象图；其中，P3(倍数：10*10)；

图6为本发明的PCR支原体检测结果图；

图7为本发明的病毒感染细胞24h后的荧光结果图；其中，A为对照病毒感染小鼠脑血管平滑肌细胞的免疫荧光结果；B为目的病毒感染小鼠脑血管平滑肌细胞的免疫荧光结果；

图8为本发明的缺氧条件下，各组细胞Annexin V FITC/PI双染检测结果凋亡结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供的一种保护缺氧暴露下血管平滑肌细胞的重组腺病毒，主要构建流程为：构建相应目的载体，并设计目的片段PCR引物；选用KpnI和XhoI作为限制性内切酶并在合适位置进行酶切载体，琼脂糖凝胶回收得到纯化的线性化载体；根据设计的引物进行目的片段PCR，琼脂糖凝胶回收得到正确大小的目的片段；将线性化载体和目的片段按照同源重组的方法进行连接；转化感受态DH5α，菌液涂板，培养12～16h；挑选单克隆行进菌落验证；选择菌落验证正确的阳性克隆进行测序；测序正确的克隆样品进行质粒抽提，然后进行包装，得到重组腺病毒。具体步骤如下：

一、过表达腺病毒载体的制备

1.载体及目的基因信息

pAdEasy-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP载体DNA(购自汉恒生物科技有限公司)图谱参见图1，以MICU1的编码基因为目的基因(购自汉恒生物科技有限公司；目的基因的序列如表1中的SEQ ID NO.1所示)。

表1序列表

2.载体酶切

按照表2依次加入各试剂，轻轻吸打混匀，置于37℃水浴锅中反应1～2h，实现限制性内切酶KpnI和XhoI对pAdEasy-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP载体的酶切，载体酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体片段，待插入目的片段。

表2载体酶切体系

3.目的片段的获取

1)引物设计

引物Adeasy23-m-MICU1-K/X-F(简称F引物)和引物Adeasy23-m-MICU1-K/X-R(简称R引物)的序列分别如表1中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2)PCR扩增目的片段

参见表3配制PCR扩增体系，轻轻混匀，置于PCR仪中进行反应，结合表4进行PCR。

表3 PCR扩增体系

表4 PCR程序

注：1)退火温度为引物Tm值，退火温度直接决定扩增特异性；2)如果发现扩增特异性差，可适当提高退火温度，每次+2℃；3)适当延长延伸时间有助于提高扩增产量。

4.目的片段与载体连接

参见表5，采用HB infusion

于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。连接反应液在50℃反应30min后，置于冰上5min，立即转化，获得连接产物。

表5连接体系

注：1)建议2～3个片段连接时，目的基因片段的使用总量为0.02～0.5pmols(一般使用时，加入的片段量在100～150ng，线性化载体的量在50～100ng)，4～6个片段连接时，加入的DNA总量为0.2～1.0pmols。DNA拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低。

5.转化

1)从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞(购自汉恒生物科技有限公司)，立刻放到冰上融化，感受态分装过程需操作轻柔，以减轻对其机械破坏；

2)待感受态融化后，以每管50μL的体积分装(对于质粒转化，20μL就足够了)，分装之后以不超过感受态体积1/10的量加入步骤4得到的连接产物(实验中加5μL连接产物)，冰上放置20～30min；

3)在42℃对加有连接产物的感受态热激90s(这个时间要非常严格)，热激完之后立刻插入冰上冰育2～3min；

4)于超净台中，在步骤3)冰育之后的连接产物和感受态中加入500μL无抗的LB培养基，轻柔地上下颠倒3～5次；混匀之后，在37℃、230rpm震荡培养45～60min，得到菌液；

5)将步骤4)得到的菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将固体平板倒放于37℃恒温箱中培养12～16h；

6.鉴定

参见表6，使用PCR对菌液进行鉴定，鉴定程序参见表7，引物1和引物2的序列如表1中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，鉴定结果显示成功检测到目标DNA片段。

表6菌液PCR鉴定体系

表7菌液PCR鉴定程序

7.测序

从筛选出来的阳性克隆中选择两个克隆进行测序，测序结果参见图2和表1中的SEQ ID NO.4；测序结果表明：测序结果与目的序列一致，该目的质粒构建成功。

8.质粒抽提

测序成功之后，根据项目要求安排菌液扩增，然后按照质粒抽提试剂盒(购自Generay公司)的说明书进行质粒抽提纯化，QC验证合格之后，得到用于转染细胞的穿梭质粒。

其中，质粒QC的原则是浓度大于200ng/μL，260～280在1.8～2.0之间(详细数据根据试剂盒的不同而不同)。

9.腺病毒载体重组

1)穿梭质粒构建成功之后，选择合适的酶切位点(MluI)进行线性化，并进行琼脂糖胶回收，得到线性化穿梭质粒；

2)使用制备好的含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(购自汉恒生物科技有限公司)的E.coli BJ5183感受态细胞，对步骤1)得到的线性化穿梭质粒进行转化，进行细胞内重组；

3)转化之后，涂板，37℃，培养12～16h；

4)选取单克隆进行培养，抽提质粒进行PacI酶切验证；

5)验证正确的重组质粒转化E.coli stbl3感受态，得到高纯度的重组质粒；

6)对步骤5)得到的重组质粒PacI线性化，得到线性化的重组质粒，待转染细胞。

二、腺病毒包装与质量检测

1.实验材料及仪器

1)细胞株和菌株

包装细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％ FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株：大肠杆菌菌株DH5-α，用于扩增腺病毒载体和辅助包装载体质粒。

2)腺病毒包装系统

Adeasy系统：步骤9中6)中得到的线性化后的重组质粒。

2.腺病毒包装及纯化

1)铺细胞

转染前一天，将293A细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置于37℃含5％CO

2)转染

待293A细胞生长至长满到底面积的70～80％时，取上述步骤6)得到的线性化的重组质粒，用Lipofiter

具体步骤为：

a.转染前2小时更换完全培养基，取4μg上述步骤6)得到的线性化的重组质粒，用300μL的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

b.取15μL的Lipofiter

c.将步骤a和步骤b得到的溶液混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到含有293A细胞的60mm培养皿中并呈“8”字摇晃后，置于37℃含5％CO

3)换液

转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

4)收毒(P1)

每天观察细胞出毒迹象。参见图3，出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15mL离心管中。

5)冻融

打开恒温水浴锅至37℃，将步骤4)得到的15mL离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。得到的上清即为对照病毒第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。

6)扩增

从P1代病毒上清(约3mL左右)中取2mL感染一个10cm的细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中，-80℃保存，作为毒种保留。

7)收毒(P2)

病毒扩增两天后，待所有细胞脱落底面即可进行收毒，收毒结果参见图4。将细胞连同培养液一同收入15mL离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增，或于-80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。

8)P3代病毒扩增及收毒

按每个75cm

9)腺病毒纯化

a.第一次超速离心

将离心机预冷到4℃，然后慢慢将8mL CsCl 1.4加入离心管中，继续缓慢加入10mLCsCl 1.2，在其上部缓慢加入约20mL的第三代病毒溶液(不够20mL用10mM Tris补齐)(体积共约37mL)；配平之，100000×g(24000rpm in SW31)90min，4℃，减速度为0；离心结束后，吸弃离心管上部的废液，并用75％酒精擦拭管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)；用5mL针管配1.22(18G)的针头在蓝白色条带下方穿刺吸出病毒溶液，用至少一倍体积的TE稀释所收集的病毒溶液。

b.第二次超速离心

慢慢将12mL CsCl 1.4加入离心管中，继续缓慢加入14mL CsCl 1.2，在其上部非常缓慢地加入8～10mL步骤a中TE稀释好的病毒溶液。配平之，100000×g(24000rpm inSW31)16～20小时，4℃，减速度为0；离心结束后，吸弃离心管上部的废液，并用75％酒精擦拭管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)；用5mL针管配0.8(20G)的针头吸出蓝白条带(方法同上)，或在离心管下部扎孔使液体自然流下来，收集蓝白色条带即可(可以减少CsCl混入)。

c.透析

每次用200×体积的透析buffer，透析三次，间隔一小时换一次液，透析结束后，测滴度并分装于-80℃保存病毒。

3.腺病毒质量检测

腺病毒的质量控制要点包括无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测。

1)无菌检测

检测方法：取10μL透析之后的病毒，加入96孔板的Hela细胞进行验证，培养24h后显微镜镜检。检测时的QC标准为：培养基需澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，无任何细菌及真菌污染。

检测结果：与QC标准一致。

2)支原体检测

检测方法：取10μL病毒，96℃水浴15min后于超净台中配置PCR反应体系。PCR反应后电泳确定是否含有支原体污染。

QC标准：PCR胶图无明显条带

结果参见图6，500bp左右位置如有条带，1表示阳性对照样品，即表示有支原体污染。2为目的样品检测，没有条带表示没有支原体污染。

3)病毒滴度检测

腺病毒滴度检测采用TCID50滴度检测，检测结果如下：

对照病毒：3.16×10

目的病毒：1.26×10

结论：病毒滴度高，可满足实验需求。

三、重组腺病毒在缺氧暴露条件下对血管平滑肌细胞的保护

以HBAD-EGFP过表达载体作为对照病毒，分别用对照病毒和采用MOI值为100的HBAD-Adeasy-m-MICU1-3xflag-EGFP目的病毒感染原代小鼠脑血管平滑肌细胞，24h后显微镜观察细胞的荧光表达情况，结果参见图7，由图7可看出两者的感染效率超过80％，且细胞生长状态良好，证明病毒的转染效率良好。

将处于对数生长期的小鼠原代脑血管平滑肌细胞随机分为3组，其中，缺氧-空白组细胞未经任何处理，缺氧-对照病毒组细胞作为对照病毒处理24h，缺氧-目的病毒组细胞为HBAD-Adeasy-m-MICU1-3xflag-EGFP目的病毒感染24h。将3组细胞置于三气培养箱中(1％O

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。