一种检测苹果叶片蜡质含量的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术与分子标记技术领域，尤其涉及一种检测苹果叶片蜡质含量的SNP分子标记及其应用。

背景技术

目前，苹果是我国第一大水果。黄土高原是我国最大和最佳苹果产区，但该产区降水量小，且年降水季节分配不均，65％以上降水集中在秋季。干旱限制新梢生长、引起落花落果、降低座果率、影响产量和品质。干旱缺水已成为制约黄土高原产区苹果产业可持续发展的主要环境因素，因此，培育抗旱、优质苹果新品种已成为干旱地区苹果产业健康发展亟需解决的关键问题。

为应对干旱环境，植物在形态、生理、分子三个水平上进化出了一系列适应机制。研究表明，叶片蜡质是植物抵御干旱胁迫的重要屏障，它可以通过降低叶表皮角质蒸腾，减少非气孔性水分散失，起到抗旱保水作用，并且不影响光合产物积累。

分子标记是一种检测DNA水平上遗传多样性同时可以反映核苷酸序列变异的一种遗传标记。利用分子标记与目标性状连锁的特点，通过识别分子标记，即可达到选择目标性状的目的。

CAPS技术是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨的技术。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。由于苹果遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了苹果遗传育种及新品种的选育。因此，通过设计一对特异引物进行PCR扩增，之后采用CAPS技术进行酶切可以有效识别苹果叶片蜡质含量较高的种质资源，为选育一些叶片蜡质含量较高的苹果品种提供了重要的参考。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：苹果因其遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了苹果遗传育种及新品种的选育。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记及其应用，尤其涉及一种识别苹果叶片蜡质含量高低的SNP分子标记。

本发明是这样实现的，一种检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记，所述检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记包括：MdHDG5启动子上高蜡质含量种质SNP位置碱基为A/A或A/G，低蜡质含量种质SNP位置碱基为G/G。

进一步，所述检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记的引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述反向引物R的核苷酸序列为SEQ IDNO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定所述检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中应用的方法。

进一步，所述鉴定所述检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中应用的方法包括以下步骤：

步骤一，提取不同苹果种质的基因组DNA；

步骤二，以提取的DNA为模板，利用引物进行PCR扩增；

步骤三，利用CAPS技术对PCR产物进行酶切。

进一步，所述步骤三中，如果扩增产物中SNP位点为A/G或A/A，酶切后琼脂糖凝胶结果为三条或者一条带，则待测苹果植物属于叶片蜡质含量高的品种；如果扩增产物中SNP位点为G/G，酶切后琼脂糖凝胶结果为两条带，则待测苹果植物属于叶片蜡质含量低的品种；同时对PCR产物使用引物进行测序，在叶片蜡质含量比较高的品种，SNP位置中测序峰图为A单峰或者A套峰；在叶片蜡质含量比较低的品种，SNP位置中测序峰图为G单峰。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在苹果分子标记辅助育种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记的用于调控苹果叶片蜡质含量的基因MdHDG5。

进一步，所述用于调控苹果叶片蜡质含量的基因MdHDG5为LOC103420161。

进一步，利用基因工程的手段，通过抑制苹果中的基因MdHDG5的表达降低叶片蜡质含量。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明实施例利用Illumina HiSeq4000测序平台对158份苹果种质的基因组进行测序，共获得594万个SNPs。然后，本发明从不同苹果种质成熟叶片中提取蜡质，通过GC-MS测定了不同苹果种质的叶片蜡质成分及其含量，对获得的表型数据进行GWAS分析，定位到显著关联的MdHDG5。本发明提供的单倍型分析显示其启动子上存在SNP位点可将不同种质的高低蜡质含量表型区分开，但MdHDG5的基因组序列中不存在可以区分高低蜡质含量表型的SNP。因此，本发明通过这个SNP位点开发了选育叶片蜡质含量高的苹果品种的分子标记。另外，本发明通过Sanger测序以及CAPS技术验证了MdHDG5启动子上的显著的SNP。验证结果发现，高蜡质含量种质SNP位置碱基为A/A或A/G，低蜡质含量种质SNP位置碱基为G/G，可利用这个SNP位点开发检测叶片蜡质含量高低的分子标记。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

本发明通过设计特异性引物进行PCR扩增并进行测序或CAPS鉴定的方法，解决了选育高叶片蜡质含量品种的问题，并可以筛选叶片蜡质含量高的苹果种质资源；通过设计特异性引物进行PCR扩增并进行测序或CAPS鉴定的方法高效、快捷、准确性高，可以极大程度的帮助缩短苹果育种年限，集中优良性状。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的MdHDG5的发现及其SNP的确定示意图；A为利用Illumina HiSeq 4000测序平台对158份苹果种质资源基因组进行重测序同时对这158份苹果种质资源的叶片蜡质进行测定；通过对苹果叶片蜡质的全基因组关联分析，发现了一个与苹果叶片蜡质显著相关的转录因子MdHDG5；B为MdHDG5单倍型分析显示其启动子上存在SNP位点可将不同种质的高低蜡质表型区分开，但MdHDG5的基因组序列中不存在可以区分高低蜡质表型的SNP；

图2是本发明实施例1提供的MdHDG5启动子SNP的验证示意图；A为克隆不同叶片蜡质含量的种质资源启动子并进行Sanger测序；在叶片蜡质比较高的品种，SNP位置中测序峰图为A单峰或者A套峰，在叶片蜡质比较低的品种，SNP位置中测序峰图为G单峰(注：每个峰图为五个样本PCR产物的混样)；B为通过CAPS技术验证MdHDG5启动子SNP；高蜡质品种中酶切后琼脂糖凝胶结果为三条或者一条带，低蜡质品种中酶切后琼脂糖凝胶结果为两条带；

图3是本发明实施例1提供的MdHDG5在不同种质中的表达量示意图；

图4是本发明实施例2提供的MdHDG5干扰株系的基因表达检测示意图；

图5是本发明实施例2提供的MdHDG5干扰株系及GL-3的叶绿素浸出速率检测示意图；

图6是本发明实施例2提供的MdHDG5干扰株系及GL-3的叶片蜡质含量检测示意图；

图7是本发明实施例提供的鉴定检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中应用的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明实施例利用Illumina HiSeq4000测序平台对158份苹果种质的基因组进行测序，共获得594万个SNPs。然后从不同苹果种质成熟叶片中提取蜡质，通过GC-MS测定了不同苹果种质的叶片蜡质成分及其含量，对获得的表型数据进行GWAS分析，定位到显著关联的MdHDG5。单倍型分析显示其启动子上存在SNP位点可将不同种质的高低蜡质表型区分开，但MdHDG5的基因组序列中不存在可以区分高低蜡质表型的SNP。因此，本发明通过这个SNP位点开发了选育叶片蜡质含量高的苹果品种的分子标记。

本发明实施例通过Sanger测序以及CAPS技术验证了MdHDG5启动子上的显著的SNP；验证结果发现，高蜡质含量种质SNP位置碱基为A/A或A/G，低蜡质含量种质SNP位置碱基为G/G。

本发明实施例还提供了一种检测与苹果叶片蜡质含量相关的SNP分子标记的引物包括正向引物F和反向引物R；其中，正向引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：1为5’-GTAGGGAACCCATTATGCCTCAAG-3’；反向引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO：2为5'-GGTGGGGTCTATTAGTTCAAGACAG-3'。

本发明实施例还提供了一种与苹果叶片蜡质含量相关的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中的应用。

如图7所示，本发明实施例提供的鉴定检测苹果叶片蜡质的SNP分子标记在鉴定苹果叶片蜡质含量高低的种质资源中应用的方法包括以下步骤：

S101，提取不同苹果种质的基因组DNA；

S102，以提取的DNA为模板，利用引物进行PCR扩增；

S103，利用CAPS技术对PCR产物进行酶切。

本发明实施例提供的步骤S103中，如果扩增产物中SNP位点为A/G或A/A，酶切后琼脂糖凝胶结果为三条或者一条带，则待测苹果植物属于叶片蜡质含量高的品种；如果扩增产物中SNP位点为G/G，酶切后琼脂糖凝胶结果为两条带，则待测苹果植物属于叶片蜡质含量低的品种；同时也可以对PCR产物，使用上述引物进行测序；在叶片蜡质比较高的品种，SNP位置中测序峰图为A单峰或者A套峰，在叶片蜡质比较低的品种，SNP位置中测序峰图为G单峰。

本发明实施例还提供了一种与苹果叶片蜡质含量相关的SNP分子标记在苹果分子标记辅助育种中的应用。

本发明实施例还提供了一种用于调控苹果叶片蜡质含量的基因MdHDG5(LOC103420161)；利用基因工程的手段，通过抑制苹果中该基因的表达可以降低叶片蜡质含量。

二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

实施例1：MdHDG5的发现及其启动子SNP的验证

本发明实施例利用Illumina HiSeq4000测序平台对158份苹果种质资源基因组进行重测序，共获得594万个SNPs，然后从不同苹果种质成熟叶片中提取蜡质，采用气相色谱-质谱法测定蜡质成分及含量，通过对苹果叶片蜡质的全基因组关联分析，发现了一个与苹果叶片蜡质显著相关的转录因子MdHDG5，单倍型分析显示其启动子上存在SNP位点可将不同种质的高低蜡质表型区分开，但MdHDG5的基因组序列中不存在可以区分高低蜡质表型的SNP。本发明实施例选取了一些高蜡质和低蜡质的种质对MdHDG5的表达量进行了检测发现高蜡质的种质MdHDG5表达量较高。在此基础上，本发明实施例克隆不同叶片蜡质含量的种质资源启动子，进行Sanger测序以及通过CAPS技术验证SNP，可利用这个SNP位点开发检测叶片蜡质含量高低的分子标记。

具体方法如下：

1.不同种质苹果叶片总RNA提取

(1)将样品于液氮中研磨成粉状，装入2.0mL硅化离心管中。

(2)65℃水浴锅提前预热CTAB，向样品中加入700μL CTAB和40μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀后于水浴锅65摄氏度水浴10min，期间摇晃3次。

(3)水浴后将样品取出冷却至室温，加入700μL氯仿：异戊醇(24：1)，混匀。

(4)将样品4℃12000rpm离心10min。

(5)取出样品，吸取500μL上清至新硅化管，向样品中加入500μL氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀。

(6)将样品4℃12000rpm离心10min，吸取300μL上清液至新硅化管，向样品中加入30μL 3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)及600μL无水乙醇，颠倒混匀，于-20℃过夜静置。

(7)取出过夜静置的样品，4℃12000rpm离心20min，弃去上清液，在通风橱中晾干。

(8)向样品中加入500μL 75％乙醇，4℃12000rpm离心30s，弃去上清液。

(9)向样品中加入500μL无水乙醇，4℃12000rpm离心1min，弃去上清液，在通风橱中晾干。

(10)向样品中加入303μL DEPC水、35μL DNase I Buffer及12μL DNase I，37℃水浴孵育30min。取出样品，加入150μL DEPC水和500μL氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，4℃12000rpm离心10min。

(11)取400μL上清液加入40μL 3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)和800μL无水乙醇，于-20℃沉降2h。4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入500μL 70％乙醇，4℃12000rpm离心10min，弃去上清液。

(12)加入500μL无水乙醇，4℃12000rpm离心10min，弃去上清液，在通风橱中晾干。

(13)加入30μL DEPC水溶解RNA，并使用紫外分光光度计测量浓度。

2.逆转录反应体系及步骤(1)基因组DNA去除

在RNase-free的离心管中配置如下混合液

4xgDNA wiper Mix(Vazyme，R223) 4μL

模板RNA 1μg

RNase-free ddH

用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。

(2)配置逆转录反应体系

5x HiScript II qRT SuperMix II(Vazyme，R223) 4μL

第一步反应液16μL

用移液器轻轻吹打混匀。

50℃15min，85℃5sec。

产物可以立即用于qPCR反应，或者-20℃保存，并在半年内使用。

3.荧光定量反应体系

设计MdHDG5特异引物(F：GTCGTGGACGGCTATATCTGATT，R：TAAGGGAGCCAAGTGGTAGAAAC)；

用SYBR Green荧光定量预混液(Yugong Biolabs Co.,Ltd.,REF:EG20117M)在CFX96进行荧光定量，PCR反应程序如下：95℃，15mins；95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。结果利用2

4.苹果种质资源DNA提取

(1)大田采集苹果种质资源叶片，用锡箔纸包裹，做好标记放入液氮。

(2)将样品于液氮中研磨成粉状，装入硅化管中。

(3)65℃水浴锅提前预热CTAB，向样品中加入700μL CTAB和40μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀后于水浴锅65℃水浴10min。

(4)水浴后将样品取出冷却至室温，加入700μL氯仿：异戊醇(24：1)混匀。

(5)将样品4℃12000rpm离心10min。

(6)取出样品，吸取500μL上清至新硅化管，向样品中加入500μL氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀。

(7)将样品4℃12000rpm离心10min。

(8)吸取300μL上清液至新硅化管，向样品中加入30μL 3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)及600μL无水乙醇，颠倒混匀，于-20℃过夜静置。

(9)4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入500μL 70％乙醇，4℃12000rpm离心10min，弃去上清液。

(10)加入500μL无水乙醇，4℃12000rpm离心10min，弃去上清液，在通风橱中晾干。

(11)加入30μL水溶解，-20℃保存。

5.MdHDG5启动子片段扩增及CAPS验证SNP位点

(1)MdHDG5启动子片段扩增。

以其上述提取的不同种质的DNA为模板进行包含SNP的启动子片段扩增，体系如下：

其中，F：GTAGGGAACCCATTATGCCTCAAG；

R：GGTGGGGTCTATTAGTTCAAGACAG。

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃15s，56℃15s，72℃30sec，共35个循环；最后72℃延伸5min。

(2)CAPS验证SNP位点。

利用http://helix.wustl.edu/dcaps/对已扩增的包含SNP的启动子片段序列进行分析，发现Hph I酶切位点(该酶识别的序列为GGTGA)，对上述扩增的不同苹果种质资源包含SNP的启动子片段进行CAPS检测。

酶切反应体系

37℃3h利用琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

利用CAPS对不同苹果种质(包含高低蜡质)的启动子进行分析。其中高蜡质含量种质SNP位置碱基为A/G或A/A，低蜡质含量种质SNP位置碱基为G/G，结果如图2所示。提取不同种质(包含高低蜡质)的RNA并且进行逆转录，在这些种质中对MdHDG5的表达量进行分析，发现高蜡质种质中MdHDG5的表达量高，低蜡质种质中MdHDG5的表达量低，结果如图3所示。

实施例2：MdHDG5转基因植物叶片蜡质表型

1.农杆菌介导的叶片侵染法侵染苹果叶片

(1)将过夜培养的农杆菌从培养箱取出，5000rpm 5min收菌，并用重悬液洗菌两次。倒掉上清液，用重悬液将菌重悬。

(2)挑选叶片幼嫩且无菌的野生型GL-3组培苗，用镊子取下合适的叶片，叶背朝下置于重悬液中，使用手术刀片快速划伤叶背，将划伤的叶片转移至菌液中摇30min，使菌液与伤口处充分接触。

(3)用镊子将叶片取出，叶背朝下置于无菌滤纸上吸干水分，叶背朝上平铺于共培养基上，室温黑暗培养3天。

(4)从培养箱中取出培养3天的苹果叶片，观察无污染迹象后和筛选培养基一同放入超净台。

(5)镊子和解剖刀经灭菌器高温灭菌后晾凉，拆开封口膜，将共培养基上的叶片叶背朝上移至筛选培养基，铺叶片时保持每个筛选培养基铺10～15个叶片，叶片间有一定距离，轻微按压对叶片无伤处进行固定防止叶片移动。

(6)将叶片于培养箱室温黑暗培养30天，后再次挑选有芽叶片更换至新的筛选培养基室温见光培养。

2.叶绿素浸出实验

(1)选择生长健壮且长势一致的野生型GL-3和转基因组培苗，选取每个苗子的相同部位摘取幼嫩程度一致的叶片，每样5片，三个生物学重复。

(2)准备洁净的50mL离心管，倒入30mL 80％乙醇，将叶片加入离心管使其被酒精浸过，标记，用黑布遮盖使其处于暗处减少叶绿素见光分解损失造成的误差。

(3)每间隔10min从每样吸取1mL酒精加入新的1.5mL离心管并标记样品名称和取样时间，取样前需摇动离心管使样品均匀，所有样品于暗处保存。

(4)取浸提80min样后将所有样品放置在暗处，取浸提24h样品，同样于暗处放置。

(5)使用酶标仪对所有样品叶绿素含量进行测定(647nm和664nm)。

3.转基因植物叶片蜡质含量测定

(1)选择生长旺盛且长势一致的转基因植物和野生型GL-3植株，取完整苹果叶片，先进行叶面积扫描之后浸没在有氯仿的烧杯中提取表皮蜡质60s。提取结束后，向每个样品中加入20μL浓度为1μg/μL的正二十四烷烃作为内标。

(2)过滤挥发：当提取的蜡质混合物挥发至约以前的1/2时，用0.45μm的有机滤膜过滤，过滤后转移至另一干净的10mL左右的玻璃离心管中，放在通风橱中挥发至少于3mL，然后用氮吹仪吹干。

(3)于通风橱中在玻璃离心管中加入40μL吡啶和40μL BSTFA，轻轻混匀迅速盖上盖子，放于水浴锅中70℃衍生60min。随后立即用氮气吹干衍生剂，并加入1mL左右氯仿重新溶解样品，接着用0.22μm的有机滤膜过滤到GC色谱分析小瓶中。

(4)用气相色谱-质谱联用仪对样品进行分析。

通过农杆菌介导的叶片侵染法侵染苹果叶片获得了MdHDG5干扰株系，干扰株系的表达量检测如图4所示。之后本发明实施例对干扰株系的叶片蜡质表型进行了鉴定，通过叶绿素浸出实验以及GC-MS测定叶片蜡质发现MdHDG5干扰株系的叶片蜡质低于GL-3，如图5和图6所示。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。