一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定动物报告疾病，我国目前已经在《中华人民共和国传染病防治法》把它归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的"非典"、"猪流感"、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同属一类传染病。布鲁氏杆菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁氏杆菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁氏杆菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。

布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。布鲁氏杆菌广泛分布于世界各地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁氏菌病报道发生，最严重的地区位于地中海沿岸和阿拉伯半岛诸国，该病在印度、墨西哥、美国的南部和中部地区也较普遍。尽管一些国家已经有效控制了布鲁氏菌病，但中亚地区逐渐成为人布鲁氏菌病的新发地区。据统计，全球每年出现约50万例人布鲁氏菌病。布鲁氏菌病在我国也广泛存在，尤其是在以畜牧业生产为主的地区。2009年全国布鲁氏菌病监测数据显示，全国有29个省区、市发生畜间布鲁氏菌病，牛、羊、猪等感染量达百万头之多，见于内蒙、东北、西北等牧区。人布鲁氏菌病亦呈上升趋势，人布鲁氏菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁氏菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁氏菌病。

一方面，传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；RT-PCR需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带和需要专业人员操作等。另一方面，现有的布鲁氏杆菌的试剂盒虽然能够实现布鲁氏杆菌的检测，但是无法对布鲁氏杆菌的种类进行区分和鉴别。因此，亟需研发一种同时具备检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。

本发明技术方案如下：

一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的crRNA，所述crRNA为crRNA-AO和crRNA-MO的组合；

所述crRNA-AO的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA-MO的序列如SEQ ID NO.2所示。

一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的crDNA，所述crDNA为crDNA-AO和crDNA-MO的组合；

所述crDNA-AO的序列如SEQ ID NO.3所示；所述crDNA-MO的序列如SEQ ID NO.4所示。

一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的DNA，所述DNA为DNA-AO和DNA-MO的组合；

所述DNA-AO的序列如SEQ ID NO.5所示；所述DNA-MO的序列如SEQ ID NO.6所示。

所述crRNA-AO和crRNA-MO可以经人工合成得到，或以crDNA-AO和crDNA-MO为模板转录得到。所述DNA-AO是crRNA-AO的靶向序列，用于检测和鉴别非羊种的布鲁氏杆菌菌株。所述DNA-MO是crRNA-MO的靶向序列，用于检测和鉴别非牛种的布鲁氏杆菌菌株。

一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒，包含上述crRNA或crDNA。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；

进一步优选的，所述Cas蛋白为CRISPR-Cas13蛋白；

根据本发明优选的，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团。

进一步优选的，所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1。

进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。

一种利用上述试剂盒以非诊断目的检测鉴别不同生物种布鲁氏杆菌的方法，包括步骤如下：

(1)提取待测样本的基因组；

(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行双重RPA扩增；

(3)取RPA扩增产物分别建立AO检测体系和MO检测体系，在37℃下，孵育10～60min；

(4)将AO检测体系和MO检测体系分别放入LED照射灯下，当AO检测体系荧光显色、MO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当MO检测体系荧光显色、AO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当AO检测体系和MO检测体系均荧光显色时，表明待测样本是非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌菌株；两个检测体系均不荧光显色时，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述双重RPA扩增为同时使用两对引物进行RPA扩增，引物序列为：

正向引物1：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGTAAACCGATCACAGACACAACAACTTC GCC-3'；

反向引物1：5'-TGCCGCCAGCCGTATTTTCCTGGGAGAGAAA-3'；

正向引物2：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATAGCTGGAACCGCTCACGCGACATGG AC-3'；

反向引物2：5'-GCCTTGTTTCAGGCACATTGTTTCTGGGCG-3'。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述双重RPA扩增体系为：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物1和正向引物2共2.5μL，反向引物1和反向引物2共2.5μL，其余用无酶水8μL补足，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，总体积10μL。

扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。

其中，RPA基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmp

根据本发明优选的，步骤(3)中，所述AO检测体系和MO检测体系相同，具体为：Tris-HCl(400mM)、MgCl

根据本发明优选的，步骤(4)中，所述LED照射灯为便携式LED照射灯，激发波长为360～450纳米。

本发明未详细说明的均为现有技术。

本发明的技术特点：

在本发明的AO检测体系和MO检测体系中，Cas13a蛋白与crRNA-AO和crRNA-MO分别结合成Cas13a-crRNA-AO和Cas13a-crRNA-MO复合物。然后CCas13a-crRNA-AO和Cas13a-crRNA-MO能够特异性地识别RPA扩增产物中DNA-AO和DNA-MO的转录产物。在AO检测体系和MO检测体系同时存在的情况下，当AO检测体系荧光显色MO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当MO检测体系荧光显色AO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当AO检测体系和MO检测体系均荧光显色时，表明待测样本是非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌菌株，两个检测体系均不荧光显色时为阴性，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。

有益效果：

1、本发明提供的检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株以及非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌菌株，有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题，为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导。并且本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，还具有价格便宜，操作简单、快速，且设备仪器方便携带的优点。

2、本发明提供的检测方法将RPA扩增技术、CRISPR系统和快速荧光检测技术联用，通过合理配比降低相互之间的干扰，使反应试剂之间依然能够准确地、特异地实现各自的功能，通过扩增和检测结合进行，用便携式的LED照射灯观测即可得到结果，使得整个检测过程耗时极短，进行定性检测时在5～30min内即可完成，且操作步骤简单，通过荧光颜色即可肉眼分辨出布鲁氏杆菌菌株生物种，判断布鲁氏菌病的感染来源，为布鲁氏菌病的净化提供全新的思路和方法。

附图说明

图1为羊种、牛种以及非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌的差异基因分析图。

图2为羊种、牛种以及非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌的检测和鉴别结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

以下实施例中Cas13a蛋白，北京科昕生物科技有限公司。

TwistAmp

实施例1、用于检测布鲁氏杆菌的crRNA和DNA的设计及获得

登录NCBI，从GenBank中下载基因序列包括：羊种(M28、ATCC23457、NI、BmWS93、CIT31、B9、QH61、BY38、20236、RM57、Rev.1、M5-90)、牛种(A19、A13334、2308、9-941、104M、BD、BAB8416、clpP、MC、BJ1)、猪种(S2、1330、QH05、CVI-71)和犬种(ATCC 23365)布鲁氏杆菌菌株进行基因组生物信息学分析和差异性分析比对，分析结果如图1所示。

由图1可知，羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌和非羊种、牛种的其他布鲁氏杆菌菌株的基因序列之间存在明显差异，本申请发明人进一步发现检测和鉴别这三类来源布鲁氏杆菌的基因位点为AO位点和MO位点，其中AO位点用于检测牛种布鲁氏杆菌，MO位点用于检测羊种布鲁氏杆菌，AO位点和MO位点配合检测非羊种、牛种的其他布鲁氏杆菌。所述含有AO位点的牛种布鲁氏杆菌DNA-AO如SEQ ID NO.5所示，所述含有MO位点的羊种布鲁氏杆菌DNA-MO如SEQ ID NO.6所示。经序列对比可知，在MO位点处，羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌和非羊种、牛种的其他布鲁氏杆菌菌株相比缺少GC两个碱基；在AO位点处，牛种布鲁氏杆菌和非羊种、牛种的其他布鲁氏杆菌菌株相比缺少TTGTTCATCCTGC十三个碱基。

然后根据DNA-AO和DNA-MO的基因序列的差别，设计得到crRNA-AO和crRNA-MO(Vac)，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，本发明设计的crRNA-AO和crRNA-MO能够特异性的匹配到羊种布鲁氏杆菌和牛种布鲁氏杆菌基因区域的差异片段，从而激活对应的Cas蛋白核酸酶活性，对体系中的报告基团进行切割。

获得crRNA的具体操作方法如下：以crDNA为模板，分别进行退火反应形成双链DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化DNA片段，在T7 RNA聚合酶作用下转录生成RNA，回收纯化得到成熟的crRNA，将纯化得到的crRNA分装冻存至-80℃；或者根据序列直接人工合成。

其中，crDNA-AO的序列如SEQ ID NO.3所示；crDNA-MO的如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA可以根据序列直接人工合成。

退火体系：把待退火的DNA oligo(合成的引物)用经灭菌的无酶水或重蒸水配制成50μM。

溶解Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)，混匀备用。

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按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。

T7 primer的序列为：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’。

如下设置PCR仪进行退火反应：

转录体系为：模板DNA 1μg，T7 RNA聚合酶混合物2μL，NTP Buffer Mix 10μL，无酶水补足，总体积30μL。

转录条件为：37℃，16h。

实施例2、用于检测不同生物种来源的布鲁氏杆菌的荧光试剂盒

本实施例试剂盒包括TwistAmp

其中，所述ssRNA荧光探针序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。

实施例3、采用实施例2所述试剂盒进行布鲁氏杆菌荧光检测的方法

分别取含有牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌的血样本20μL，然后以20μL无酶水作为对照组，进行布鲁氏杆菌荧光检测。

具体方法，包括步骤如下：

(1)将待检测样本分别经80℃、10分钟预灭活处理，然后加入20μL的NP-40裂解液，震荡15s至混匀，置于95～99℃的恒温仪加热10min，得到三个待测样本的基因组；

(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和RPA的反应体系中，进行目的基因的核酸扩增；

RPA扩增反应体系：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，总体积45μL，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，可同时扩增五个样本的RPA反应，每个反应体积10μL。

扩增条件为：反应温度40℃，孵育时间15min。

其中，所述RPA基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmp

所述RPA扩增引物选自如下引物对：

正向引物1：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGTAAACCGATCACAGACACAACAACTTC GCC-3'；

反向引物1：5'-TGCCGCCAGCCGTATTTTCCTGGGAGAGAAA-3'；

正向引物2：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATAGCTGGAACCGCTCACGCGACATGG AC-3'；

反向引物2：5'-GCCTTGTTTCAGGCACATTGTTTCTGGGCG-3'；

RPA扩增条件：反应温度40℃，孵育时间10min；所述正向引物1和反向引物1扩增牛种布鲁氏杆菌DNA，正向引物2和反向引物2扩增羊种布鲁氏杆菌DNA；

其中，RPA基础反应球和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmp

(3)取RPA扩增产物分别建立AO检测体系(牛种布鲁氏杆菌)和MO检测体系(羊种布鲁氏杆菌)，在37℃下，孵育20min；

所述AO检测体系(牛种布鲁氏杆菌)和MO检测体系(羊种布鲁氏杆菌)相同，具体为：Tris-HCl(400mM)、MgCl

(4)将10μL的AO检测体系(牛种布鲁氏杆菌)和MO检测体系(羊种布鲁氏杆菌)分别放入360～450纳米激发波长下的便携LED照射灯下，根据荧光显色得到检测结果。

本实施例的检测结果如图2所示。由图2可知，无酶水的检测结果为不形成荧光显示，为对照组(NC)。AO检测体系荧光显色、MO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；MO检测体系荧光显色、AO检测体系荧光不显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；AO检测体系和MO检测体系均荧光显色时，表明待测样本是非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌菌株，在本实施例中为猪种布鲁氏杆菌。