一种降解菌及其分离筛选方法和应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，且特别涉及一种降解菌及其分离筛选方法和应用。

背景技术

随着我国生猪产业的快速发展，2019 年我国生猪屠宰量高达 68 861 万头，生猪屠宰后留下相当可观的猪毛、蹄脚等副产物，一头生猪大约可产出1 kg 湿猪毛。而绝大部分的猪毛被当作下脚料丢弃。这不仅污染了环境还造成了资源浪费。猪毛中的粗蛋白质质量分数高达 80%，其中包含多种必需氨基酸，且富含微量元素、生长因子及维生素等，是一种具有潜在价值的动物蛋白资源。但猪毛中的蛋白质主要由角质蛋白构成，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力很难被普通蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等）水解。利用高温高压蒸煮、酸碱水解和利用氧化剂或者还原等传统方法加工处理废弃猪毛，氨基酸破坏严重、能耗高、污染大等问题，而利用微生物对角蛋白进行降解可以提高水解产物的营养价值，降低能耗、成本以及对环境的污染问题，是一种环境友好型的废弃物资源化利用方式。

目前分离筛选出的菌株并不多，并且效率较低，且绝大多数为中低温菌。由于角蛋白酶的最适反应温度一般在40-60℃，而中低温菌的最适生长温度一般在28-37℃，两者不相匹配。因此，筛选在高温条件下具有稳定性和高效性的猪毛降解菌也是一个研究热点。猪毛废弃物经过适当处理，使废弃的猪毛角蛋白直接转变成复合氨基酸、肽类或者多肽，从而变废为宝，既能保护环境又能加强资源化利用，这将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请实施例的目的包括提供一种降解菌，以生产角蛋白酶，高效降解猪毛。

第一方面，本申请实施例提供了一种降解菌，该降解菌为贝莱斯芽孢杆菌

在本申请的部分实施例中，该降解菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本申请实施例提供了一种上述降解菌的分离筛选方法，包括：将采集的土壤样品与水混合，得混合液；将混合液加入至选择培养基中进行培养Ⅰ，得菌液；将菌液涂布于固体选择培养基平板上进行培养Ⅱ，筛选生长良好的单菌落于降解培养基中，进行培养Ⅲ，同时以未接种单菌落的降解培养基作对照，观察猪毛降解情况，筛选出符合条件的降解菌。

在本申请的部分实施例中，选择培养基的组成包括：猪毛0.5-10g/L、氯化钠0.1-1.0g/L、磷酸二氢钠0.05-0.2g/L和磷酸氢二钠0.5-2g/L。

在本申请的部分实施例中，培养Ⅰ的条件包括：在150-200r/min下震荡培养，培养温度为24-60℃，培养时间为80-110h。

在本申请的部分实施例中，培养Ⅱ的条件包括：培养温度为24-60℃，培养时间为65-75h。

在本申请的部分实施例中，培养Ⅲ的条件包括：培养温度为24-60℃，培养时间为48-96h。

第三方面，本申请实施例提供了一种上述降解菌在降解猪毛中的应用。

在本申请的部分实施例中，使用降解菌降解猪毛的方法包括：将预处理后的猪毛样品与无机盐溶液混合，再加入含有降解菌的种子液进行培养，使猪毛降解。

在本申请的部分实施例中，预处理包括：将猪毛洗干净去杂，110-130℃蒸煮50-70min，在40-50℃下进行烘干粉碎，得到预处理后的猪毛样品。

在本申请的部分实施例中，猪毛与无机盐溶液的质量比为（0.1-1）:100。

在本申请的部分实施例中，无机盐溶液的组分包括：0.1-1.0g/L的NaCl、0.05-0.2g/L的NaH

在本申请的部分实施例中，种子液的制备包括：将降解菌接种至NA固体培养基平板上，24-60℃下培养15-20h，使其活化；将活化后的降解菌转接至NB液体种子培养基中，培养至对数生长期。

在本申请的部分实施例中，该降解菌培养的条件包括：在24-60℃下培养65-80h。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请中的ZKHW 1.021菌落图；

图2为本申请中的ZKHW 1.021革兰氏染色图；

图3为本申请中的ZKHW 1.021系统发育树图；

图4为本申请中的ZKHW 1.021降解猪毛的效果图；其中，图4A为实验组，即在降解培养基中加入了ZKHW 1.021；图4B为空白对照组，即在降解培养基中未加入ZKHW 1.021；

图5为本申请中的ZKHW 1.021降解猪毛得到酶解液中氨基酸谱图。

生物材料保藏说明：

生物材料ZKHW 1.021，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请实施例提供了一种降解菌，为贝莱斯芽孢杆菌

该降解菌的分离筛选方法，包括：称取从猪屠宰场周围长期堆积废弃猪毛处的土壤样品 10.0 g ，置于内含90 mL无菌水的锥形瓶中，充分振荡混匀，得混合液。取5 mL 混合液置于内含100 mL 选择培养基的锥形瓶中，24-60℃，150-200r/min振荡培养。取驯化培养80-110h的菌液梯度稀释后，涂布于固体选择培养基（选择培养基中添加2%琼脂）平板上培养65-75h（24-60℃），筛选生长良好的单菌落，利用四分区划线法进一步纯化，在NA培养基试管斜面低温保存各菌株。挑选初筛纯化好的单菌落于降解培养基中，置于24-60℃摇床，150-200r/min培养，以未接种的降解培养基作对照，观察猪毛降解情况。经过降解培养基的进一步培养，筛选出分解猪毛效率最高的高温菌株，经过形态学及生理生化和DNA鉴定后，命名为贝莱斯芽孢杆菌（

其中，NA培养基配方：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0g/L。选择培养基配方：猪毛0.5-10g/L、氯化钠0.1-1.0g/L、磷酸二氢钠0.05-0.2g/L和磷酸氢二钠0.5-2g/L，pH自然。降解培养基配方：猪毛10 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸二氢钠0.1g/L，磷酸氢二钠1.3 g/L，pH自然。

使用ZKHW 1.021降解猪毛的方法包括：

（1）ZKHW 1.021种子液制备：将筛选出的贝莱斯芽孢杆菌（

（2）猪毛预处理：将猪毛洗干净去杂，110-130℃高温蒸煮50-70min，在40-50℃下进行烘干粉碎，得到预处理后的猪毛样品。

（3）使用ZKHW 1.021降解猪毛：将步骤（2）中预处理后的猪毛样品与无机盐溶液按照质量比为（0.1-1）:100混合，再加入步骤（1）中制备好的种子液进行培养，使猪毛降解。其中，无机盐溶液的组分包括：0.1-1.0g/L的NaCl、0.05-0.2g/L的NaH

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

（1）分离筛选ZKHW 1.021

称取从猪屠宰场周围长期堆积废弃猪毛处的土壤样品 10.0 g ，置于内含90 mL无菌水的锥形瓶中，充分振荡混匀。取5 mL 混合液置于内含100 mL 选择培养基的锥形瓶中，45℃，180 r/min振荡培养。取驯化培养96 h 的菌液梯度稀释后，涂布固体选择培养基（选择培养基中添加2%琼脂）平板上培养72h，筛选生长良好的单菌落，利用四分区划线法进一步纯化，NA培养基试管斜面低温保存各菌株。挑选初筛纯化好单菌落于降解培养基中，置于45℃摇床，180r/min培养，以未接种的降解培养基作对照，观察猪毛降解情况。经过降解培养基的进一步培养，筛选出分解猪毛效率最高的高温菌株，经过形态学及生理生化和DNA鉴定后，命名为贝莱斯芽孢杆菌（

NA培养基配方：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0 g/L。

选择培养基配方：猪毛1 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸二氢钠0.1 g/L，磷酸氢二钠1.3 g/L，pH自然。

降解培养基配方：猪毛10 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸二氢钠0.1 g/L，磷酸氢二钠1.3 g/L，pH自然。

（2）制备猪毛发酵液

将步骤（1）中筛选出的贝莱斯芽孢杆菌（

将猪毛洗干净去杂，121℃高温蒸煮60min，在45℃下进行烘干粉碎，得到预处理后的猪毛样品；将预处理后的猪毛样品与无机盐溶液按照质量比为1:100混合，再加入上述制备好的ZKHW 1.021种子液（4%），在45℃，180r/min下培养72h，得到猪毛发酵液。其中，无机盐溶液的组分包括：NaCl 0.5g/L、NaH

试验例1

本试验例对实施例1中筛选出的贝莱斯芽孢杆菌（

（1）形态特征

贝莱斯芽孢杆菌（

ZKHW 1.021的菌落图见图1，革兰氏染色图见图2。

（2）生理生化特征

将ZKHW 1.021进行以下实验：

1、接触酶实验：

接触酶实验通常是用来测试微生物菌株是否具有特定的胶原蛋白酶（也称为凝胶酶）活性。这些酶能够分解胶原蛋白，导致凝胶的溶解。以下是接触酶实验的基本操作步骤：

制备琼脂凝胶板：准备含有胶原蛋白的琼脂凝胶板。可以在琼脂凝胶培养基中加入一定浓度的胶原蛋白。

接种菌株：使用贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021的培养物，取一定量的细菌悬浮液并均匀涂抹在琼脂凝胶板表面。

孵育：将琼脂凝胶板在适当的条件下孵育，通常在适当的温度和湿度下孵育一段时间，允许菌株生长和产生酶。

观察结果：观察琼脂凝胶板表面的菌落生长情况。如果菌株具有接触酶的活性，它们将分解胶原蛋白，导致琼脂凝胶的透明区域，即胶原降解区。

结果分析：根据透明区域的大小和形状，以及菌落周围的环境，可以初步判断菌株是否具有接触酶活性。透明区域越大，胶原蛋白分解能力越强。

2、Voges-Proskauer实验（V-P实验）

V-P实验是一种微生物实验，用于检测微生物代谢产物中是否存在醋酸盐。该实验通常用于鉴定革兰氏阴性杆菌，特别是肠杆菌科（

V-P实验的过程涉及两个主要步骤：1.Voges-Proskauer试剂的添加：首先，需要在培养基中添加Voges-Proskauer试剂，该试剂通常由两个成分组成：α-萘乙酚（α-naphthol）和酮类试剂（一般是5%的肥皂水溶液，比如40%的氢氧化钠溶液）。这两个试剂的添加有助于检测产生醋酸盐的代谢产物。2.酮类试剂的氧化反应：酮类试剂与微生物代谢产物中的醋酸盐反应，经过氧化反应形成酮体。酮体在存在α-萘乙酚的催化下发生缩合反应，生成红色的产物。这个红色产物的出现表明样品中存在产生醋酸盐的代谢途径。

V-P实验的结果通常通过产生的颜色变化来判断，如果产生了红色产物，说明样品中存在产生醋酸盐的代谢产物，从而可以判定为阳性反应；如果没有产生颜色变化，则为阴性反应。

3、厌氧生长实验： 将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021于无氧环境中培养，例如密封的容器内，观察是否有生长现象。

4、硝酸盐还原实验：（使用上海源叶生物科技有限公司生产的硝酸盐还原试剂盒）。

5、淀粉水解实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有淀粉的NA培养基中，培养一段时间后，用碘液检测是否有淀粉水解产物的形成。

6、酪蛋白水解实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有酪蛋白的培养基中，培养一段时间后，观察是否发生酪蛋白的降解和产生特定产物。

7、明胶水解实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有明胶的NA培养基中，培养一段时间后，观察是否发生明胶的降解和产生特定产物。

8、纤维素分解实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有纤维素的NA培养基中，培养一段时间后，观察是否发生纤维素的降解和产生特定产物。

9、吲哚实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有吲哚的NA培养基中，培养一段时间后，观察是否发生吲哚酮的产生，若有吲哚酮的产生，培养基颜色会从黄色或无色变为蓝色。

10、卵磷脂酶实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，培养一段时间后，观察是否产生乳白色混浊圈。

11、酪氨酸水解实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有酪氨酸的NA培养基中，培养一段时间后，观察是否产生透明圈。

12、苯丙氨酸脱氢酶实验：将贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021培养在含有苯丙氨酸的NA培养基中，37℃孵育18-24h，生长好后，取出注入0.2mL（或4-5滴）10%的FeCl3水溶液于生长面上，观察是否变绿色。

贝莱斯芽孢杆菌ZKHW 1.021的生理生化特征请详见表1。

表1 ZKHW 1.021的生理生化特征

注：+表示阳性；-表示阴性。

经生理生化测定，本申请提供的贝莱斯芽孢杆菌（

（3）贝莱斯芽孢杆菌（

1. DNA提取：将贝莱斯芽孢杆菌（

以下是CTAB法的一般步骤：

材料和试剂准备：

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZKHW 1.021培养后的单菌落。

CTAB提取缓冲液：含有CTAB（正十六烷基三甲基溴化铵）的缓冲液，常见组分包括CTAB、NaCl、Tris-HCl等。

蛋白酶K溶液：用于去除蛋白质的酶，用于消化细胞膜和蛋白质。

氯仿：用于萃取DNA。

同相等体酚/氯仿混合液：用于分离氯仿中的水相和有机相。

操作步骤：

挑取单菌落：使用无菌的牙签或胶头棉签，在NA培养基平板上挑取单个菌落，转移到1.5 mL离心管中。

细菌裂解：向细菌的1.5 mL离心管中加入适量的CTAB提取缓冲液，使用适当的缓冲液体积，让细菌完全浸泡。然后加入一定量的蛋白酶K溶液，轻轻颠倒混匀。

温育：将含有细菌和缓冲液的离心管置于65°C水浴中，孵育30-60min，促使细胞溶解。

萃取DNA：添加等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，让混合液分成两相。离心管离心，使两相分离。DNA富集在上层水相中。

沉淀DNA：将上层水相转移到新的离心管中，加入异丙醇，轻轻颠倒混匀，促使DNA沉淀。离心管离心，使DNA沉淀。

洗涤DNA：倒掉上层液体，加入75%乙醇洗涤，轻轻颠倒混匀，离心管离心，倒掉洗涤液。重复一次洗涤步骤。

干燥DNA：将离心管颠倒在纸巾上，使DNA颗粒在室温下干燥，避免过度干燥，以免影响溶解。

溶解DNA：将DNA用适量的去离子水溶解，使其浓缩并恢复到适合的浓度。可以用紫外光谱仪或琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

2. 16S rDNA基因PCR扩增

PCR引物由上海生工公司合成。

Primer A：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3'

Primer B：1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

PCR反应体系如表2所示：

表2

PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10min；4℃保藏。采用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）回收纯化PCR产物。

3. 序列测定

PCR产物纯化后，送上海美吉公司进行测序，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该序列与NCBI数据库已知标准菌株比对表明，该菌株与

试验例2

本试验例对实施例1中制得的猪毛发酵液进行猪毛降解率测定，猪毛发酵液中的角蛋白酶活性测定，猪毛发酵液中水溶性游离氨基酸测定以及猪毛发酵液中多肽含量测定。

猪毛降解率测定：将猪毛发酵液用滤纸过滤，收集滤渣于105℃烘干至恒重，计算降解率。猪毛降解率（%）=（对照样品干重−实验样品干重）/对照样品干重×100%。其中，对照样品干重为在猪毛和无机盐的混合溶液中不加入ZKHW 1.021种子液进行发酵培养，最终得到的产物重量。

角蛋白酶活性测定：将发酵液溶液用2层纱布过滤，去滤液，12000g，4℃离心10min，取上清液1.0mL加入2.0mL 0.05mol/L Tris/HCl缓冲液（pH7.5）与10mg角蛋白粉底物，37℃恒温水浴锅反应，100r/min保温处理1h；反应结束时添加2.0mL 10%三氯乙酸（TCA）终止反应，10000g离心15min。上清液于595nm下测定其吸光值，采用保温前添加TCA的反应管作为对照。酶活单位定义：实验条件下，单位mL分解角蛋白产生的酶量是Δ

猪毛发酵液中水溶性游离氨基酸测定：取5mL猪毛发酵液至10mL比色管中，加ddH2O定容至10mL，静置过夜。取2mL上清液至10mL离心管中，加入2mL磺基水杨酸，混匀，静置1h使蛋白沉淀；加入1mL EDTA和1mL盐酸后4℃、6000g离心15min（或用0.22μm微孔滤膜过滤）。取上清液1mL至培养皿中，蒸干；加入1mL 20mmol/L HCl溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，至少取500μL至进样瓶；用L-8900全自动氨基酸分析仪测定。

猪毛发酵液中多肽含量测定：准确称取猪毛发酵液6.000g于50mL容量瓶中，加入15%三氯乙酸溶液定容至50 mL，混合均匀，静置 5min。以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管。4000r/min下离心 10min，准确移取其上清液 10mL 于消化管中，采用凯氏定氮法测定蛋白含量。猪毛发酵液中多肽含量为上述测定的蛋白含量-猪毛发酵液中游离氨基酸含量。

图4A中的三角瓶中为加入了ZKHW 1.021的发酵液，图4B为空白对照组，通过比较图4A和图4B可以看出，ZKHW 1.021可以有效的降解猪毛，且经过测试发现，发酵3天后猪毛的降解率达到88.34%，同时发酵液中角蛋白酶活性达到48.66 U/mL，表明本申请提供的贝莱斯芽孢杆菌（

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。