具有生物活性的波形蛋白及应用
文献发布时间：2024-04-18 19:58:53
技术领域
本申请涉及活性蛋白制备技术领域，具体涉及具有生物活性的波形蛋白及应用。
背景技术
波形蛋白(Vimentin，Vim)为高度保守的真核细胞骨架Ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，以多聚体纤维稳定存在。Vim仅溶于离子型表面活性剂如尿素、盐酸胍等溶液。Vim具有调节细胞迁移、粘附、信号传导、自身抗原和细胞因子特性，诱导T细胞增殖并介导体内免疫反应，在感染、肿瘤、自身免疫、固有免疫等方面显现多种功能，具有生物药品开发的广阔前景。
等电点法是一种常用于提取波形蛋白的方法，等电点法利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。等电点法提取的波形蛋白的过程，也是蛋白质多步骤变性的过程，首先是带负电荷的硫酸盐基团与带相反电荷的碱性氨基酸侧链相互作用。如采用十二烷基磺酸钠(SDS)分子时，其疏水尾部埋在蛋白质的疏水核心中，开始破坏蛋白质的固有结构。最后，多肽链的很大一部分，独立于其在原生状态下的构象，采用α-螺旋构象，并被SDS分子胶束包围。
因此，通过常用等电点法提取的波形蛋白，制备的波形蛋白存在纯度低，蛋白活性弱等技术问题。
发明内容
等电点法提取的波形蛋白粉末经过超滤透析除去绝大多数盐等物质后，但仍然会存在SDS分子，因此等电点法所提取的波形蛋白构像丧失了其天然构像，即特征性的折叠三维结构，使其不能像在天然条件下那样发挥功能。因此，可以采取将波形蛋白和如SDS分子的表面活性剂形成的复合物分离并去除表面活性剂从而实现蛋白质生物结构的恢复，从而解决和缓解现有存在的技术问题。
为达到以上目的，本申请提供了如下技术方案：
(1)一种具有生物活性的波形蛋白，所述波形蛋白的分子量为53.6KD，所述波形蛋白通过提取和复性的步骤获得；其中，所述提取的步骤包括：
A.将新鲜猪脑剪碎；
B.加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，将匀浆溶液中加入聚乙二醇单辛基苯基醚，搅拌，离心，弃上清液，留沉淀物；所述第一盐溶液为100mmol/L KCl、2mmol/LMgCl
C.重复B步骤三次，将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，搅拌，离心，获得第一沉淀；
D.将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，搅拌，离心，获得第二沉淀；所述第二盐溶液为500mol/L NaCl、5mmol/L EDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl，pH为7.0的混合溶液；
E.将第二沉淀与PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠，搅拌，离心收集上清液；
F.向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液，搅拌、离心，获得第三沉淀，即波形蛋白前体或未经复性的波形蛋白。
在进一步的实施方案中，所述复性的步骤包括：
向波形蛋白前体加入复性缓冲液，所述复性缓冲液为100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mM EDTA，pH 7.4的混合溶液；室温下搅拌，获得混合溶液A；
向混合溶液A中加入羟丙基β-环糊精，使混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为4～10mM；在室温条件下反应，反应时间不低于40min，获得混合溶液B；
超滤离心混合溶液B，获得超滤浓缩液；以及将超滤浓缩液收集于透析袋中，透析之后进行冻干保存。
在优选的实施方案中，混合溶液A中羟丙基β-环糊精终浓度为8～10mM；更优选的实施方案中，混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为10mM。
优选的实施方案中，反应时间不低于60min；更优选的实施方案中，反应时间为60～100min。
优选的实施方案中，波形蛋白前体中加入复性缓冲液的比例为1mg：10mL。
进一步的实施方案中，E步骤中PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的浓度为50mmol/L。
进一步的实施方案中，F步骤中十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的浓度为1～50mmol/L，优选实施方案中，为10～20mmol/L。
(2)如(1)所述波形蛋白在促进T淋巴细胞增殖的应用。
本申请提供的促进T淋巴细胞增殖功能的波形蛋白及应用的技术效果将在发明实施例中具体阐明。
附图说明
图1为本申请实施例提供的不同终浓度羟丙基β-环糊精复性、超滤、透析后波形蛋白含量。
图2为本申请实施例提供的不同浓度未复性蛋白干预下T淋巴细胞增殖率。
图3为本申请实施例提供的不同终浓度的羟丙基β-环糊精复性蛋白干预下T淋巴细胞增殖率。
图4为本申请实施例提供的不同反应时间复性蛋白干预下T淋巴细胞增殖率。
图5为本申请实施例提供的不同浓度的SDS分子沉淀波形蛋白前体电泳图；其中，A为终浓度1～20mM SDS分子引起波形蛋白前体的沉淀电泳胶图，B为终浓度25～50mM SDS分子引起波形蛋白前体的沉淀电泳胶图。
图6为本申请实施例提供的不同浓度的SDS分子沉淀波形蛋白前体Western Blot检测结果；其中，A中SDS分子终浓度1～20mM，B中SDS分子终浓度25～50mM。
图7为本申请实施例提供的精提波形蛋白前体与纯化后目的蛋白电泳图；其中，A为10％SDS-PAGE电泳图；B为Image Lab 4.0软件对A进行灰度值分析的结果。
图8为本申请实施例提供的吸光度随蛋白浓度变化的标准蛋白曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便描述的本申请实施例能够在除了此处图示或描述的顺序以外实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
术语“波形蛋白前体”是指通过如等电点法提取的波形蛋白的复合物(或复合体)，由于表面活性剂与波形蛋白形成复合物而丧失波形蛋白的天然构像，即特征性的折叠三维结构，使其不能像在天然条件下那样发挥功能。需要将采取将波形蛋白和如SDS分子的表面活性剂形成的复合物分离并去除表面活性剂从而实现蛋白质生物结构的恢复。
为了更好地理解本申请而不是限制本申请的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本申请提供了如下具体实施方式：
波形蛋白及制备方法
一种具备具有生物活性的波形蛋白，波形蛋白的分子量为53.6KD，其通过提取以及复性的步骤获得；其中，所述提取的步骤包括：
A.将新鲜猪脑剪碎；
B.加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，将匀浆溶液中加入聚乙二醇单辛基苯基醚，搅拌，离心，弃上清液，留沉淀物；所述第一盐溶液为100mmol/L KCl、2mmol/LMgCl
C.重复B步骤三次，将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，搅拌，离心，获得第一沉淀；
D.将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，搅拌，离心，获得第二沉淀；所述第二盐溶液为500mol/L NaCl、5mmol/L EDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl，pH为7.0的混合溶液；
E.将第二沉淀与PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠，搅拌，离心收集上清液；
F.向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液，搅拌、离心，获得第三沉淀，即所述波形蛋白前体。
在进一步的实施方案中，波形蛋白前体进行复性包括：
向波形蛋白前体加入复性缓冲液，所述复性缓冲液为100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mM EDTA，pH 7.4的混合溶液；室温下搅拌，获得混合溶液A；
向混合溶液A中加入羟丙基β-环糊精，使混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为4～10mM；在室温条件下反应，反应时间不低于40min，获得混合溶液B；
超滤离心混合溶液B，获得超滤浓缩液；
将超滤浓缩液收集于截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
在一些优选的实施方案中，混合溶液A中羟丙基β-环糊精终浓度为8～10mM；在一些更优选的实施方案中，混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为10mM。
在一些优选的实施方案中，反应时间不低于60min；在一些更优选的实施方案中，反应时间为60～100min。
在一些优选的实施方案中，波形蛋白前体中加入复性缓冲液的比例为1mg：10mL。
在一些实施方案中，E步骤中PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，十二烷基硫酸钠溶液的浓度为50mmol/L；F步骤中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1～50mmol/L，在一些优选的实施方案中，F步骤中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为10～20mmol/L。
在一些优选的实施方案中，新鲜猪脑加入第一盐溶液的比例为1g：10ml；第一沉淀重悬于第二盐溶液的比例为1g：5ml。
实施例1
(1)将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
(2)重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
(3)将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
(4)向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度15mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体；
(5)向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液(100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mM EDTA，pH 7.4)，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度4mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应100min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
实施例2
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液(100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mMEDTA，pH 7.4)，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度6mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应100min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
实施例3
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液(100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mMEDTA，pH 7.4)，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度8mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应100min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
实施例4
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液(100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mMEDTA，pH 7.4)，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度10mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应100min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
对比例1
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液(100mM Tris-HCl、2mM DTT、1mMEDTA，pH 7.4)，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度2mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应100min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后进行冻干保存。
蛋白含量测定
按照BCA法测定样品浓度。按照表1将标准蛋白溶液和待测蛋白样品溶液加入96孔板中，各孔再加入200μl BCA工作液，37℃孵育60min或60℃孵育30min。孵育后在酶标仪上测定各孔在562nm时的吸光度值。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
BCA工作液的配制：根据200μl BCA工作液/孔计算好所需BCA工作液总量，按BCA试剂A：BCA试剂B＝50：1，v/v，配制所需的BCA工作液，使用时现用现配。
表1
将实施例1～4、对比例1获得的复性的波形蛋白前体用PBS稀释至500μg/ml，加到96孔板中，使每孔待测样品总体积为20μl。根据样品数量，按50体积BCA试剂加1体积硫酸铜溶液(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀。每孔加入BCA工作液200μl，将酶标板放在振荡器上振荡30s充分混匀，37℃水域30min后，在562nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。根据所测样品的吸光值，带入标准曲线即可计算得蛋白实际浓度，利用公式蛋白含量＝实际浓度/稀释终浓度×100％计算得出蛋白含量。
蛋白含量测定结果如表2所示。
表2
将表2数据汇制成图1，从表2和图1可知，随着羟丙基β-环糊精的浓度逐渐增大，蛋白含量逐渐增加，但增加趋势随着浓度增大却趋于平缓。充分说明了在表面活性剂蛋白质复合物中添加羟丙基β-环糊精能够竞争性的与表面活性结合，将表面活性从复合物中剥离下来，从而使蛋白质重新折叠。
对比例2：取经过等电点法提取的，但未经过复性的波形蛋白，作为待检测蛋白。
分别针对实施例1～4，对比例1～2获得的波形蛋白进行淋巴细胞培养及增殖率测定。
淋巴细胞培养及增殖率测定
淋巴细胞培养：将小鼠脱颈处死，75％乙醇浸泡5分钟，在超净台中取出脾脏，将脾脏放入培养皿中，用少量PBS洗涤，去除脂肪。将200目筛架在50ml离心管上，使用PBS充分将其润湿。小心用镊子将脾脏转移到筛网上，用5ml无菌注射器的扁平端将脾脏充分研磨后，用适量PBS冲洗，借用重力的力量使细胞通过筛网，进入50ml离心管。过滤两次，使细胞成为单细胞悬液。在4℃下1500rpm离心10分钟，弃上清液留沉淀物，加入3ml红细胞裂解液，3分钟后在相同条件下离心。用PBS重悬两次，相同条件下离心，将沉淀物重悬于10％胎牛血清RPMI 1640培养液。在含5％CO
称取未复性的波形蛋白粉末(对比例2)按照上述方法进行T淋巴细胞增殖实验，增殖率如图2所示，从图中可知，经过超滤透析去除盐等物质后而未经过复性的波形蛋白几乎没有生物活性，这是由于等电点法所提取的波形蛋白构像丧失了其天然构像，即特征性的折叠三维结构，使其几乎无生物活性。
以SDS分子作为表面活性剂利用到等电点法提取波形蛋白为例说明其理由：SDS分子是一种广泛使用的阴离子表面活性剂，在重组蛋白形成的包涵体领域使用最为广泛，SDS分子与波形蛋白结合形成的复合物由沿多肽链聚集的胶束组成，SDS分子主要是通过电荷作用和疏水作用，构成复合物的核心，并被包含大部分多肽链的亲水壳包围，SDS分子在复合物中的特殊位置导致不能通过简单的稀释恢复波形蛋白的天然结构。为了提取纯化出具有生物活性的波形蛋白，因此需要将波形蛋白和表面活性剂形成的复合物分离并去除表面活性剂从而实现蛋白质生物结构的恢复。
图3显示的是不同终浓度羟丙基β-环糊精复性蛋白干预下T淋巴细胞增殖率，从图3可知，随着羟丙基β-环糊精的浓度逐渐增大，复性后的蛋白质对T淋巴细胞具有增殖作用，且随着波形蛋白浓度的增大，增殖率也增大。10mM浓度下羟丙基β-环糊精复性的波形蛋白在2
实施例5
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度6mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应60min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后冻干进行T淋巴细胞增殖实验，以SPSSAU医学统计软件对T淋巴细胞增殖率进行统计学分析，多组间数据以单因素方差合并t检验进行分析。
实施例6
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度6mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应80min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后冻干进行T淋巴细胞增殖实验，以SPSSAU医学统计软件对T淋巴细胞增殖率进行统计学分析，多组间数据以单因素方差合并t检验进行分析。
对比例3
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度6mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应20min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后冻干进行T淋巴细胞增殖实验，以SPSSAU医学统计软件对T淋巴细胞增殖率进行统计学分析，多组间数据以单因素方差合并t检验进行分析。
对比例4
按照实施例1中(1)～(4)步骤制备波形蛋白前体；
向波形蛋白前体中按照1mg：10ml加入复性缓冲液，室温下搅拌30min后向溶液中加入终浓度6mM的羟丙基β-环糊精，室温下反应40min。使用30k超滤离心管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集超滤浓缩液于30k截留量透析袋中，在4℃冰箱中透析24h，之后冻干进行T淋巴细胞增殖实验，以SPSSAU医学统计软件对T淋巴细胞增殖率进行统计学分析，多组间数据以单因素方差合并t检验进行分析。
分别对通过实施例2，实施例5、6，对比例2(空白对照)，对比例3、4获得的波形蛋白进行淋巴细胞培养及增殖率测定。
图4显示的为经过羟丙基β-环糊精处理的不同反应时间的复性蛋白干预下T淋巴细胞增殖率，从图中可知，随着加入羟丙基β-环糊精复性时间逐渐延长，复性后的蛋白质对T淋巴细胞具有明显的增殖作用，且随着波形蛋白浓度的增大，增殖率也增大。复性时间为60min时，2
本申请实施例中，羟丙基β-环糊精属于β-环糊精的衍生物，都具有共同的结构特征，其分子形状都是略呈锥形的圆环，其空腔内测其空腔内侧由两圈氢原子(H-3和H-5)及一圈处于C-H键屏蔽之下的糖苷键的氧原子组成。这种环糊精特有的结构特性导致其内腔为疏水环境，而其外侧边框由于羟基的聚集而呈亲水性。正是由于环糊精这种“内疏水”、“外亲水”的特殊分子结构，使得环糊精能作为“主体”包合不同的“客体”化合物，形成结构特殊的包合物。从复性之前和复性之后的蛋白含量测定就能很好说明在表面活性剂蛋白复合物中添加羟丙基β-环糊精后引发分子间竞争过程，从而竞争性的与如SDS分子的表面活性剂结合，使蛋白质具有重折叠的前提条件。后续进行的复性后的波形蛋白干预T淋巴细胞实验说明恢复其天然构像，具有了生物活性。
本申请还对不同提取条件下获得的波形蛋白前体的方法(即未经复性的波形蛋白)进行了验证。
实施例7
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度10mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
实施例8
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度15mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
实施例9
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度20mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例5
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度1mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例6
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度3mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例7
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度5mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例8
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度25mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例9
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度30mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例10
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度35mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例11
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度40mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例12
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度45mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
对比例13
将新鲜猪脑剪碎；加入第一盐溶液(100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl
重复上述操作三次，然后将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，进行第四次搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第一沉淀；
将所述第一沉淀按1g：5mL重悬于第二盐溶液(500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl；pH为7.0)，搅拌30min，离心(10000rpm、4℃、20min)，获得第二沉淀；将第二沉淀与0.01mol/L的PBS缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠(SDS),调节成SDS终浓度为50mmol/L、pH为5.1的混合溶液，搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心20min，用70μm细胞滤网收集上清液；
向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，调节成SDS终浓度50mmol/L、pH为5.0的混合溶液；搅拌60min，之后在9000rpm、4℃条件下离心10min，收集第三沉淀，所得沉淀即为波形蛋白前体。
分别通过实施例7～9、对比例5～13的方法提取的波形蛋白作为样品进行验证实验，具体的验证实验及结果如下：
10％SDS-PAGE及Western Blot验证
用移液枪吸取5mg/ml波形蛋白前体溶液16μl至1.5ml离心管，并按照4：1的比例加入5×蛋白上样，使其终浓度为1×蛋白上样缓冲液，离心30秒后100℃沸水中加热5分钟使蛋白变性。组装制胶装置，根据10％SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶)凝胶配方分别配置分离胶和浓缩胶并依次加入装置，待胶凝凝固后，轻轻的将10well 1.0mm梳子拔出。将装置放入电泳槽中，倒入1×电泳液500ml。以每孔10μl进行上样。先以90V电压分离40min，再以100V电压分离100min左右，待溴酚蓝至底则电泳结束。电泳完成后切去上层浓缩胶，以考马斯亮蓝染色液摇床漂染2h，脱色液(甲醇：乙酸：双蒸水＝4：2：4)摇床脱色至凝胶背景变浅，蛋白质条带清晰。
根据电泳结果，以免疫印迹法(Western Blot，WB)对需进一步验证的样品进行分析。按前述方法进行制胶、上样、电泳、切胶，凝胶于转膜缓冲液中浸润5min。裁剪比凝胶面积略大的PVDF(聚偏二氧乙烯膜)膜，于甲醇中活化3min，再放置于转膜缓冲液中浸泡。海绵垫和滤纸也置于转膜缓冲液中浸泡。按照顺序依次将海绵垫、转膜滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫放置于转膜夹板黑色面。玻璃棒轻赶气泡后合上转膜夹放入转膜槽，倒入转膜缓冲液，于80mA冰水浴下转膜2h。完成后取出PVDF膜并将蛋白面标记，标记面向下浸于封闭液中，水平摇床封闭1h；封闭完成后，以PBST(PBS：20％Tween-20＝200ml：1ml)于摇床上洗膜，每次20min，重复三次；将波形蛋白单克隆抗体(V9)与一抗稀释液按照1：1000(v/v)配成孵育液，于4℃冰箱内孵育PVDF膜15h；PBST洗膜，每次20min，重复三次洗净一抗孵育液；将二抗与二抗稀释液按1：9000(v/v)配制，常温下孵育PVDF膜1h后重复上述洗涤操作三次；将1ml ECL化学发光液和PVDF膜于避光处理后的培养皿中避光孵育5min，利用凝胶成像系统对膜进行显色成像。
图5显示的为波形蛋白前体10％SDS-PAGE验证结果，其中图5(A)为终浓度1～20mMSDS引起波形蛋白前体的沉淀电泳胶图，从图中可知，随着SDS浓度的增加，波形蛋白前体的纯度变高；图5(B)为终浓度25～50mM SDS引起波形蛋白前体的沉淀电泳胶图，从图中可知，随着SDS浓度的进一步增大，波形蛋白前体的纯度出现下降的趋势。
图6为不同浓度SDS沉淀波形蛋白前体的免疫印迹法实验结果，其中图6(A)为终浓度1～20mM SDS引起波形蛋白前体的沉淀免疫印迹法实验结果，其中图6(B)为终浓度25～50mM SDS引起波形蛋白前体的沉淀免疫印迹法实验结果；均鉴定为波形蛋白，分子量为53.6KD。
在本申请实施例中，猪脑经过第一盐溶液、第二盐溶液洗涤后，猪脑中大部分非蛋白质类物质被去除。调节溶液pH至5.1时，此时等电点大于5.1的蛋白质质子化带正电，在加入过量阴离子表面活性剂SDS后，SDS的带负电荷的极性头基团与蛋白质上的正电荷相互作用，中和了蛋白质所带的正电荷，净电荷减少，大大降低了水化能，并同时疏水区域通过排斥包裹在蛋白质分子周围的水分子而与蛋白质相对应的部分接触使蛋白质的疏水性增加，当这两种作用达到一定程度时，大量蛋白质便沉淀出来，通过离心后便可去除。此时波形蛋白等电点小于5.1的蛋白质因带负电荷，与SDS发生电性相斥，靠疏水吸附的SDS增加了复合体的净负电荷数，保留在上清液中，用细胞滤网收集上清液便得到了等电点小于5.1的蛋白溶液，调节溶液pH至5.0，加入浓度梯度的SDS引起等电点大于5.0的蛋白质沉淀，通过离心后收集沉淀，此时沉淀中便含有大量波形蛋白前体(即未经复性的波形蛋白)。
波形蛋白前体纯度分析
本申请实施例针对实施例7～9、对比例4～12不同提取条件下提取的波形蛋白前体样品透析冻干后用PBS溶解、10％SDS-PAGE电泳后，以Image Lab 4.0软件进行灰度值分析。
本申请实施例根据10％ SDS-PAGE和Western Blot分析结果对不同提取条件下提取的波形蛋白样品进行分别收集；0.45μm滤膜过滤，滤液装入10k透析袋置于透析缓冲液中，4℃下进行透析24h。透析完全后用30k超滤管在6000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集浓缩液进行冻干；冻干粉末经PBS溶解后按上述方法制胶、上样、电泳、切胶、染色、脱色。ImageLab 4.0软件进行灰度值分析。
图7显示为不同浓度SDS沉淀波形蛋白前体的纯度结果，其中图7(A)为10％SDS-PAGE电泳图；图7(B)为Image Lab 4.0软件对图7(A)进行灰度值分析的结果，从图可知，随着SDS的浓度不断增加，其波形蛋白前体的纯度随之升高，而后又逐渐下降，在SDS浓度10～20mM之间出现纯度最大值，达到(90.32±0.33)％。
本申请实施例中，在SDS浓度较低时，沉淀波形蛋白前体不充分，加之在去除等电点大于5.1的蛋白质时去除不完全，残留了少量杂蛋白质导致波形蛋白前体纯度下降，随着SDS浓度的增加，波形蛋白前体沉淀率增加，沉淀更加充分，纯度随即上升。而随着SDS浓度的进一步增加，波形蛋白前体纯度出现下降，因疏水吸附，表面活性剂被蛋白质大量吸附，复合体的净电荷增加(此时的电荷量主要由SDS的电荷决定)，故水溶性增加，沉淀又复溶解，波形蛋白前体在沉淀中的比例下降，即纯度又逐渐下降。
蛋白含量测定
按照BCA法测定样品浓度。按照表3将标准蛋白溶液和待测蛋白样品溶液加入96孔板中，各孔再加入200μl BCA工作液，37℃孵育60min或60℃孵育30min。孵育后在酶标仪上测定各孔在562nm时的吸光度值。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
BCA工作液的配制：根据200μl BCA工作液/孔计算好所需BCA工作液总量，按BCA试剂A：BCA试剂B＝50：1，v/v，配制所需的BCA工作液，使用时现用现配。
表3
将实施例8(SDS浓度为15mM)所得波形蛋白前体用PBS稀释至500μg/ml，加到96孔板中，使每孔待测样品总体积为20μl。根据样品数量，按50体积BCA试剂加1体积硫酸铜溶液(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀。每孔加入BCA工作液200μl，将酶标板放在振荡器上振荡30s充分混匀，37℃水域30min后，在562nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。根据所测样品的吸光值，带入标准曲线即可计算得蛋白实际浓度，利用公式蛋白含量＝实际浓度/稀释终浓度×100％计算得出蛋白含量。
图8为不同浓度标准蛋白按照BCA法测定获得吸光度值制得的标准蛋白曲线，根据标准蛋白曲线得出浓度和吸光度值的线性方程，将蛋白样品孔所测的吸光度值代入方程，得到在SDS浓度为15mM条件下纯化的波形蛋白前体实际浓度，利用公式蛋白含量＝实际浓度/稀释终浓度×100％计算得出，蛋白含量为(35.75±1.36)％。
本申请实施例中，用等电点法提取的波形蛋白前体的过程，也是蛋白质多步骤变性的过程，首先是带负电荷的硫酸盐基团与带相反电荷的碱性氨基酸侧链相互作用。SDS分子的疏水尾部埋在蛋白质的疏水核心中，开始破坏蛋白质的固有结构。最后，多肽链的很大一部分，独立于其在原生状态下的构象，采用α-螺旋构象，并被SDS分子胶束包围。冻干粉末经过超滤透析除去绝大多数盐等物质后，测定其蛋白含量仅为(35.75±1.36)％。等电点法所提取的波形蛋白构像丧失了其天然构像，即特征性的折叠三维结构，使其不能像在天然条件下那样发挥功能，因此，需要将波形蛋白和表面活性剂形成的复合物分离并去除表面活性剂从而实现蛋白质生物结构的恢复。而本申请提供的前述波形蛋白前体进行复性方法可以利用于蛋白质生物结构的恢复。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。