一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，特别是涉及一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法。

背景技术

N-糖基化是较为常见的蛋白质修饰方式，对蛋白质的结构稳定性和功能多样性起到重要作用。蛋白质的N-糖基化起始于内质网上多萜醇寡糖前体的合成，该过程由一系列的糖基转移酶(Alg)催化完成。人体中Alg蛋白的异常表达会导致先天性糖基化疾病。因此Alg蛋白的性质解析和活性分析在生物学和医学领域都具有重要的意义。多萜醇乙酰壳二糖和多萜醇N-乙酰葡糖胺是多萜醇寡糖前体合成途径中的重要中间体，但是由于其含量极少，提取和分离难度大，迄今没有大量提取天然多萜醇乙酰壳二糖的报道。目前为止，科学家们解析DLO途径及研究相关Alg蛋白的活性都是通过体外合成的多萜醇寡糖类似物进行。

1992年，Flitsch小组报道了多萜醇乙酰壳二糖类似物植烷醇乙酰壳二糖的合成。但本课题组发现人源Alg1蛋白不识别该底物，推测原因为人源Alg1蛋白对天然底物中的多萜醇具有较高的特异性。为研究人源Alg的活性和性质，需要获得其天然底物多萜醇寡糖。

为了开发结构简化的多萜醇寡糖结构类似物，为后续系统的在体外进行内质网内糖基转移酶活性测试打下基础。因此开发一条合成天然底物多萜醇乙酰壳二糖和多萜醇N-乙酰葡糖胺在内的脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的合成途径具有重要的意义

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺制备过程中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，克服现有脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法的不足，提供一种新型脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，其包括如下步骤：

脱保护1：将全乙酰化的壳二糖或N-乙酰葡糖胺1溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入二甲胺溶液，反应生成中间体2；

磷酸化1：将中间体2溶于无水四氢呋喃中与二异丙基氨基锂反应，接着与焦磷酸四苄基酯反应得到中间体3；

脱保护2：将中间体3溶于无水甲醇与无水二氯甲烷的混合溶液中，在钯碳与氢气的作用下，得到中间体4；

脱保护3：在聚戊烯醇乙酸酯5中加入氢氧化钾乙醇溶液加热反应，得到中间体6；

不对称加氢：将中间体6或8与氢氧化钾溶于无水异丙醇溶液中，在钌盐催化下，加热反应生成中间体7或9；

磷酸化2：将中间体10，磷酸二氢四叔丁基氨和三氯乙腈溶于无水二氯甲烷反应，接着溶于四氢呋喃与氨水反应，最后加入甲醇甲苯混合溶液中，得到中间体11；

耦合：将中间体4与N,N-羰基二咪唑溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中反应，接着加入中间体11的二氯甲烷溶液，得到中间体12；

脱保护4：将中间体12溶于甲醇溶液，加入碱性试剂反应得到脂肪醇乙酰壳二糖或脂肪醇N-乙酰葡糖胺13。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，脱保护1中二甲胺溶液为2M的二甲胺四氢呋喃溶液，反应温度0～50℃，反应时间1～24h。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，磷酸化1中反应温度为-60～-80℃，反应时间1～12h，所述中间体2、二异丙基氨基锂与焦磷酸四苄基酯的摩尔比为1:1～2:1～2。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，脱保护2中反应温度为0～50℃，反应时间1～12h，所述中间体3与钯碳的摩尔比为1：0.1～5。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，脱保护3中中间体5从银杏叶中以石油醚萃取获得，反应温度为50～100℃，反应时间1～12h，氢氧化钾乙醇溶液浓度为5～20％。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，不对称加氢中反应温度为20～100℃，反应时间1～12h，钌盐选自(S)-Ru(OAc)

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，磷酸化2中反应温度为0～60℃，反应时间1～12h，反应中间体10、磷酸二氢四叔丁基氨和三氯乙腈的摩尔比是1：1～3：1～10。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，耦合中反应温度为0～60℃，反应时间12～48h，反应中间体4、N,N'-羰基二咪唑和反应中间体11的摩尔比为1：3～10：1～1.5。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括，脱保护4中反应温度为0～60℃，反应时间1～12h，碱性试剂选自氨水和甲醇钠。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，包括如下步骤：

脱保护1：将全乙酰化的壳二糖或N-乙酰葡糖胺1溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入二甲胺溶液，反应生成中间体2，所述脱保护1中二甲胺溶液为2M的二甲胺四氢呋喃溶液，反应温度0℃，反应时间19h；

磷酸化1：将中间体2溶于无水四氢呋喃中与二异丙基氨基锂反应，接着与焦磷酸四苄基酯反应得到中间体3；磷酸化1中反应温度为-72℃，反应时间4h，所述中间体2、二异丙基氨基锂与焦磷酸四苄基酯的摩尔比为8:11:11；

脱保护2：将中间体3溶于无水甲醇与无水二氯甲烷的混合溶液中，在钯碳与氢气的作用下，得到中间体4；脱保护2中反应温度为25℃，反应时间3h，所述中间体3与钯碳的摩尔比为2:1；

脱保护3：在聚戊烯醇乙酸酯5中加入氢氧化钾乙醇溶液加热反应，得到中间体6；脱保护3中中间体5从银杏叶中以石油醚萃取获得，反应温度为80℃，反应时间1h，氢氧化钾乙醇溶液浓度为10％；

不对称加氢：将中间体6或8与氢氧化钾溶于无水异丙醇溶液中，在钌盐催化下，加热反应生成中间体7或9；不对称加氢中反应温度为83℃，反应时间4h，钌盐选自(S)-Ru(OAc)

磷酸化2：将中间体10，磷酸二氢四叔丁基氨和三氯乙腈溶于无水二氯甲烷反应，接着溶于四氢呋喃与氨水反应，最后加入甲醇甲苯混合溶液中，得到中间体11；磷酸化2中反应温度为25℃，反应时间85min，反应中间体10、磷酸二氢四叔丁基氨和三氯乙腈的摩尔比是1：2：6.2；

耦合：将中间体4与N,N-羰基二咪唑溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中反应，接着加入中间体11的二氯甲烷溶液，得到中间体12；耦合中反应温度为25℃，反应时间12～48h，反应中间体4、N,N'-羰基二咪唑和反应中间体11的摩尔比为28:150:31.55；

脱保护4：将中间体12溶于甲醇溶液，加入碱性试剂反应得到脂肪醇乙酰壳二糖或脂肪醇N-乙酰葡糖胺13，脱保护4中反应温度为25℃，反应时间12h，碱性试剂选自氨水。

本发明提供一种脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备方法，能够使用常见、便宜的原料进行脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺的制备，制备的反应条件温和、操作简单且具有较高的收率，是一种适应于工业生产的化合物合成方法。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺按照如下合成路线进行合成：

实施例1

在氮气下，向100mL烧瓶加入全乙酰壳二糖或N-乙酰葡糖胺1(1.48mmol)，将其溶于7mL的无水N,N-二甲基甲酰胺，并加入10mL的2M的二甲胺的四氢呋喃溶液。0℃环境下反应1.5h，移至室温。补加10mL的2M的二甲胺的四氢呋喃溶液，室温搅拌19h，用TLC检测反应进程。反应结束后，减压除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化得到中间体2，白色粉末，收率95％。

在氮气下，向25mL的烧瓶中加入中间体2(0.16mmol)，将其溶于5mL无水THF中。将烧瓶移至装有干冰/丙酮的杜瓦罐中，冷却至-72℃，逐滴加入111μL的2M的溶于复合溶剂[V(庚烷)/V(四氢呋喃)/V(乙苯)＝1:1:1]的二异丙基氨基锂,反应45min。将焦磷酸四苄基酯(119mg,0.221mmol)溶于2mL无水的THF中，加入反应体系，-72℃反应4h，用TLC检测反应进程。待反应结束后，烧瓶缓慢恢复至室温，减压除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化得到中间体3，白色粉末，收率87％。

在氢气下，向25mL烧瓶中加入中间体3(0.14mmol)与10％的碳负载钯(7.60mg,0.07mmol),将其溶于6mL无水的混合溶剂[V(甲醇)/V(二氯甲烷)＝2:1]中,室温搅拌3h，用TLC检测反应进程。待反应结束后，过滤，用大量甲醇洗脱。减压浓缩得到中间体4，白色粉末，收率87％。

取干燥银杏叶粉末20g置于索氏提取器的提取管中，于提取瓶中加入300mL石油醚(60～90℃)，80℃加热6h，提取液减压浓缩，得到墨绿色油状物。通过硅胶柱层析纯化得到聚戊烯醇乙酸酯5。聚戊烯醇乙酸酯样品加入5mL10％氢氧化钾乙醇溶液，80℃水解1h，TLC检测反应进程。反应结束后，缓慢恢复至室温，加5mL水，用混合溶液[V(乙醚)/V(正己烷)＝1:1]等体积萃取三次，合并有机相，无水Na

所得聚戊烯醇6的表征数据：

在氮气环境下，向10mL茄形瓶中加入脂肪醇6或8(79.36μmol)，并溶于0.8mL无水异丙醇中。随后加入[(S)-tol-binap-RuCl

所得多萜醇7的表征数据：[α]

所得(S)-茄尼醇9的表征数据:

在氮气下，脂肪醇10(0.16mmol)与磷酸二氢四叔丁基氨(100mg,0.32mmol)溶于1.8mL的无水二氯甲烷中，快速加入0.1mL三氯乙腈。室温搅拌20min,TLC检测反应进程，减压浓缩。复溶于0.8mL四氢呋喃中。加80μL的25％的氨水，反应45min。再加入1.8mL的混合溶液[V(甲醇)/V(甲苯)＝1:1]，搅拌20min，过滤，取清液。减压浓缩后用石油醚(5×10mL)萃取得到粗产物。用硅胶柱层析纯化得到粗产物。用离子交换色谱纯化，得到白色固体11。

所得茄尼醇磷酸11

所得(S)-茄尼醇磷酸11

所得聚戊烯醇磷酸11

所得多萜醇磷酸11

中间体4(28μmol)溶于0.4mL的无水N,N-二甲基甲酰胺，再加入0.4mL N,N'-羰基二咪唑(25mg,0.15mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌2h，用TLC检测反应进程。待反应结束后，加甲醇(10.6μL,0.26mmol)，室温搅拌30min。再加入0.2mL脂肪醇磷酸胺盐11(31.55μmol)的无水二氯甲烷，室温搅拌2d，用TLC检测反应进程。待反应结束后，硅胶柱层析纯化得到12，白色粉末。

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

中间体12(18.62μmol)溶于2mL甲醇，逐滴加入0.5mL 25％氨水。在氮气下，室温搅拌12h，用TLC检测反应进程。待反应结束后，减压除去溶剂，得到脂肪醇乙酰壳二糖或脂肪醇N-乙酰葡糖胺，白色粉末。

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

所得焦磷酸-P

本发明通过上述实验方法实现了脂肪醇寡糖的半合成，通过多萜醇乙酰壳二糖或多萜醇N-乙酰葡糖胺这种天然产物的增加实现了脂肪醇乙酰壳二糖和脂肪醇N-乙酰葡糖胺及其类似物的半合成，实现了N-糖基化产物的合成，采用的原料简单易得，反应过程中各反应条件温和可控，制备难度低，同时反应收率较高，具有一定的经济价值。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。