一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法

技术领域

本发明涉及饲料制备技术领域，具体为一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法。

背景技术

卵形鲳鲹是鲹科、鲳属鱼类。体高而侧扁；尾柄细短，侧扁。头小，高大于长，枕骨嵴明显。吻钝，前端几截形，吻长大于眼径。眼小，前位。脂眼睑不发达。鼻孔每侧2个，紧相邻。口小，前下位，位于眼下缘水平线上，微倾斜。前颌骨能伸缩。鳃孔大。前鳃盖骨和鳃盖骨后缘光滑。鳃盖条7。头部除眼后部有鳞外，余均裸露；体和胸部鳞片多少埋于皮下。第二背鳍与臀鳍有一低的鳞鞘。侧线前部稍呈波状，直线部始于第二背鳍第十鳍条的下方。侧线上无棱鳞，仅有感觉管。第一背鳍具一向前平卧棘(成鱼则埋于皮下)和6短棘，幼鱼棘间有膜相连，成鱼的膜渐退化，成为游离棘；第二背鳍基底长，前部鳍条延长呈镰状。臀鳍与第二背鳍相对，同形，前方有2短棘。胸鳍较宽，短于头长。尾鳍分叉。背部蓝青色，腹部银色。体侧无黑点，奇鳍边缘淡黑色。

鱼粉是卵形鲳鲹的优质饲料蛋白源，被大量用于卵形鲳鲹配合饲料，我国肉食性鱼类配合饲料中鱼粉添加量高达35-50％。随着水产养殖业规模化和产业化的发展，我国每年需要进口100多万吨的鱼粉用于生产水产动物配合饲料。

由于鱼粉的来源受海洋渔业资源限制，因此供应量有限且价格昂贵。利用廉价蛋白原料替代水产动物配合饲料中的鱼粉已经成为水产养殖产业发展中的一个趋势。国内外迄今已进行了30多年的研究，分别探索了利用动物性蛋白原料(如鸡肉粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉等)和植物性蛋白原料(如豆粕、菜粕和棉粕等)替代饲料中鱼粉的可行性。羽毛粉蛋白质含量超过80％(90％为角蛋白)，由于角蛋白分子间含有大量的二硫键、氢键以及疏水作用，使其难以被包括鱼类在内的水产动物消化利用。当配方中添加大于5％羽毛粉时往往导致养殖鱼类的生长性能和饲料利用效率下降。因此，尽管羽毛粉廉价易得，但很少被用作水产动物配合饲料中鱼粉的替代蛋白源，所以需要设计一种羽毛粉饲料的制备方法来制备适用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法，解决了目前的羽毛粉饲料不适合卵形鲳鲹食用的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法，包括以下步骤：

S1.在市场购买新鲜羽毛，然后用自来水将羽毛清洗干净，再将羽毛放入烘干箱内烘干；

S2.采用完整羽毛制备羽毛培养基，摇瓶作为培养基的基体，采用羽毛中的绒毛作为测酶活用羽毛，同时将绒毛剪碎；

S3.选择枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，将枯草芽孢杆菌与培养基内的羽毛进行发酵反应；

S4.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵时长对菌株产酶的影响；

S5.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵温度对菌株产酶的影响；

S6.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵初始pH值对菌株产酶的影响；

S7.以鱼粉和羽毛粉为蛋白源设计6种试验饲料，研究使用发酵羽毛粉替代卵形鲳鲹饲料中的鱼粉对其生长性能、体组成和非特异性免疫功能的影响，从而得出最适合卵形鲳鲹的羽毛粉饲料。

优选的，所述步骤S1中羽毛烘干时，烘干温度控制在70℃。

优选的，所述步骤S4中的具体步骤为取发酵菌株分别与培养基中的羽毛发酵反应24、48、76、96和120h的发酵液进行酶活测定。

优选的，所述步骤S5中的具体步骤为分别设置摇瓶温度为34、37、40、43和46℃，然后在反应24h后取不同温度的摇瓶内的发酵液进行酶活测定。

优选的，所述步骤S6中的具体步骤为设置初始pH值分别为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的五组不同羽毛培养基，然后在反应24h后取不同初始pH值的培养基内的发酵液进行酶活测定。

优选的，所述步骤S7中的具体步骤为制作6组等蛋等能的饲料，分别是0％、20％、40％、60％、80％和100％鱼粉蛋白水平替代组，每个梯度设置3个重复，每个重复40尾，初始体质量为30-50g,养殖试验在规格为1.5m x 1.0m x 2.0m的海水网箱中进行，饲养期56天，MS-222深度麻醉取样，每个重复取6尾鱼，保证充足的氧气，减少人为干扰，保持安静，防止额外应激。

优选的，所述步骤S7中的生长性能、体组成的测定指标具体包括：增重率、特定生长率、饲料系数、肥满度、蛋白质效率、肝体比和脏体比，全鱼、胴体和肌肉中蛋白、脂肪和灰分的含量及氨基酸组成；血液生化和非特异性免疫指标包括血糖、甘油三酯、胆固醇、皮质醇、胰岛素、甲状腺激素、生长激素、溶菌酶、补体3和补体4等；肠道和肝脏酶活性包括，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和刷状缘酶等；肠道抗氧化酶包括，超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、MDA等；蛋白代谢相关基因表达包括，蛋白合成相关基因(TOR信号途径的基因)、蛋白质分解相关基因(泛素－蛋白酶体通路基因)、转运相关基因(PepT1和PepT2)表达；卵形鲳鲹的肠道组织结构是否发生改变。

优选的，所述各项测定指标的测定方法为：蛋白代谢相关基因表达采用荧光定量RT-PCR方法测定，血液指标采用生化分析仪测定；血液皮质醇、胰岛素等采用放免测定法测定；肠道和肝脏酶活性采用化学比色法测定；粗蛋白采用凯氏定氮法测定、水分采用常压干燥法测定、粗脂肪采用索氏抽提法测定、灰分采用灼烧法测定；肠道微绒毛的组织病理结构采用HE染色法和扫描电镜检测。

(三)有益效果

本发明提供了一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法。具备以下有益效果：

本发明设计的制备方法通过微生物发酵法来制备羽毛粉饲料，在制备过程中通过设置对比试验找出制备不同蛋白质浓度的羽毛粉饲料的工艺参数，然后通过设定对比试验，对比相同蛋白质浓度下使用发酵羽毛粉替代卵形鲳鲹饲料中的鱼粉对其生长性能、体组成和非特异性免疫功能的影响，从而根据对比数据得出最适合卵形鲳鲹生长的羽毛粉饲料的工艺参数。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

本发明实施例提供一种用于卵形鲳鲹的羽毛粉饲料的制备方法，包括以下步骤：

S1.在市场购买新鲜羽毛，然后用自来水将羽毛清洗干净，再将羽毛放入烘干箱内烘干，烘干温度控制在70℃；

S2.采用完整羽毛制备羽毛培养基，摇瓶作为培养基的基体，采用羽毛中的绒毛作为测酶活用羽毛，同时将绒毛剪碎，酶活测定时参照蔡成岗，郑晓冬测定角蛋白酶活的方法:取5ml发酵液，5000rpm，离心10min,取1ml上清液加入盛有10mg羽毛与2ml pH 7.5的0.05mol/L Tris-HCl离心管中，其余上清液以备测定可溶性蛋白，50℃,100rpm条件下反应1小时后，加入2ml 10％TCA终止反应，5000rpm，离心10min,然后在280nm处测定吸光度，空白组同实验组，在加上清液前加入2ml 10％TCA，酶活单位定义为实验组对空白组每增加0.01吸光度所需要的酶量；

S3.选择枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，将枯草芽孢杆菌与培养基内的羽毛进行发酵反应；

S4.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵时长对菌株产酶的影响，取发酵菌株分别与培养基中的羽毛发酵反应24、48、76、96和120h的发酵液进行酶活测定；

S5.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵温度对菌株产酶的影响，分别设置摇瓶温度为34、37、40、43和46℃的五个实验组，然后在反应24h后取不同温度的摇瓶内的发酵液进行酶活测定；

S6.以羽毛粉为唯一有机碳氮源，体外蛋白消化率为指标，测定发酵初始pH值对菌株产酶的影响，设置初始pH值分别为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的五组不同羽毛培养基，然后在反应24h后取不同初始pH值的培养基内的发酵液进行酶活测定；

S7.以鱼粉和羽毛粉为蛋白源设计6种试验饲料，研究使用发酵羽毛粉替代卵形鲳鲹饲料中的鱼粉对其生长性能、体组成和非特异性免疫功能的影响，从而得出最适合卵形鲳鲹的羽毛粉饲料，首先制作6组等蛋等能的饲料，分别是0％、20％、40％、60％、80％和100％鱼粉蛋白水平替代组，每个梯度设置3个重复，每个重复40尾，初始体质量为30-50g,养殖试验在规格为1.5m x 1.0m x 2.0m的海水网箱中进行，饲养期56天，MS-222深度麻醉取样，每个重复取6尾鱼，保证充足的氧气，减少人为干扰，保持安静，防止额外应激，取样测试时测定指标具体包括增重率、特定生长率、饲料系数、肥满度、蛋白质效率、肝体比和脏体比，全鱼、胴体和肌肉中蛋白、脂肪和灰分的含量及氨基酸组成；血液生化和非特异性免疫指标包括血糖、甘油三酯、胆固醇、皮质醇、胰岛素、甲状腺激素、生长激素、溶菌酶、补体3和补体4等；肠和肝脏道酶活性包括，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和刷状缘酶等；肠道抗氧化酶包括，超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、MDA等；蛋白代谢相关基因表达包括，蛋白合成相关基因(TOR信号途径的基因)、蛋白质分解相关基因(泛素－蛋白酶体通路基因)、转运相关基因(PepT1和PepT2)表达；卵形鲳鲹的肠道组织结构是否发生改变。

其中上述测试项目的测定方法为:蛋白代谢相关基因表达采用荧光定量RT-PCR方法测定，血液指标采用生化分析仪测定；血液皮质醇、胰岛素等采用放免测定法测定；肠道和肝脏酶活性采用化学比色法测定；粗蛋白采用凯氏定氮法测定、水分采用常压干燥法测定、粗脂肪采用索氏抽提法测定、灰分采用灼烧法测定；肠道微绒毛的组织病理结构采用HE染色法和扫描电镜检测，最后根据测定数据得出羽毛粉饲料的最适蛋白质浓度，从而确定适用于卵形鲳鲹的羽毛粉的生产工艺参数。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。