用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒。

背景技术

华法林是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗，如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但其临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。

CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。CYP2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均导致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。CYP2C9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。

维生素k氧化还原酶是抗凝药物华法林的作用靶点。维生素K环氧化物还原酶复合物1的编码基因VKORC1的遗传变异可通过影响VKORC1表达，从而影响华法林的敏感性。位于该基因启动子区(-1639G>A)的单核苷酸突变rs9923231可影响VKORC1的表达，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639GA和GG基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，VKORC1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。VKORC1-1639A等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％(根据千人数据库的结果：在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为92％、40％和7％)，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。VKORC1多态性同时也影响华法林用药的临床后果。

大量研究表明，在我国华法林代谢酶基因CYP2C9*2和CYP2C9*3位点多态性和华法林靶点基因VKORC1-1639G>A位点多态性与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。美国FDA于2010年对华法林的说明书进行更新，建议结合VKORC1和CYP2C9基因型考虑华法林的初始用药剂量，从而达到辅助优化华法林的使用目的，并降低出血危险。

目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

发明内容

本发明的目的首先在于提供3组用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示；或者在SEQ IDNO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰；

其中修饰基团为：5′的修饰基团为荧光基团，如FAM、HEX、CY5；3′的修饰基团为淬灭基团，如BHQ1、BHQ2；

具体的说，本发明提供的用于检测CYP2C9*2(rs1799853，C430T)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:1HEX-CGAGCATTGAGGAC

其中N为变异碱基，具体为C>T；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～26bp(5′-ATTGAGGAC

本发明提供的用于检测CYP2C9*3(rs1057910，A1075C)基因多态性的探针为：SEQID NO.:4FAM-CCAGAGATAC

其中N为变异碱基，具体为A>C；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～18bp(5′-GATAC

本发明提供的用于检测VKORC1(-1639G>A)(rs9923231)基因多态性的探针为：SEQID NO.:7CY5-CCACCGCACC

其中N为变异碱基，具体为G>A；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～18bp(5′-GCACC

探针的设计原理为：根据CYP2C9基因多态性rs1799853和rs1057910，VKORC1基因多态性rs9923231分别设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如HEX，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45bp大小，PCR产物长度100-150bp。

本发明还提供了3组用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的的引物，该引物的序列如SEQ ID NO.:2、5、8(引物1)和SEQ ID NO.:3、6、9(引物2)所示：

CYP2C9*2(rs1799853，C430T)

SEQ ID NO.:2 5′-AGGTGACACTATAGAATATCAGCTTCCTCTTTCTTGCC-3′

SEQ ID NO.:3 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCACCCTTGGTTTTTCTCAA-3′。

CYP2C9*3(rs1057910，A1075C)

SEQ ID NO.:5 5′-AGGTGACACTATAGAATAGAACGTGTGATTGGCAGAAA-3′

SEQ ID NO.:6 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGTCACAGGTCACTGCATGG-3′。

VKORC1(-1639G>A)(rs9923231)

SEQ ID NO.:8 5′-AGGTGACACTATAGAATACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3′

SEQ ID NO.:9 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCTCTGGGAAGTCAAGCAAG-3′。

本发明还提供了一种用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的试剂盒，该试剂盒包含如上所述的探针和/或引物；

该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg

本发明还提供一种了用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采集样本，抽提DNA；

(2)应用上述探针和引物进行荧光定量PCR反应；

(3)应用PCR仪配套软件分析结果，根据扩增曲线，规定合适基线和阈值，基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。

其中PCR反应的总体系为15ul(包括PCR Mix 7.5ul、三组正向引物溶液各0.5ul及三组反向引物溶液各0.5ul，3组探针各0.1ul，样本DNA 2ul，灭菌重蒸馏水2.2ul)；在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为92-97℃预变性5-15分钟；92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，40-50个循环；72℃延伸10分钟；92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

本发明对CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1基因多态性进行检测，可实现对CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1基因多态性的快速筛查，有利于建立对个体华法林用药量进行评估，从而达到辅助优化华法林的使用目的，并降低出血危险。

本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，2-3小时可以完成96例检测，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，且荧光标记探针可以在不同位点使用不同的荧光基团，可实现多重检测，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。

附图说明

图1、探针茎环结构示意图

图2、rs1799853位点的三种峰型(CC型、TT型、CT型)

图3、rs1057910位点的三种峰型(CC型、AA型、AC型)

图4、rs9923231位点的三种峰型(GG型、AA型、AG型)

图5、多样本的熔解曲线图

具体实施方式

实施例1：探针及引物设计

本发明是针对CYP2C9*2C>T、CYP2C9*3A>C、VKORC1-1639G>A SNP位点设计探针及引物序列。具体原理是利用荧光探针与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图及Tm值判断基因分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。

设计探针和引物，实现在退火温度下模板不存在时，探针呈茎环状态。以CYP2C9*2为例如图1，包括环序列及其两侧呈反向互补的茎序列，总长度为31bp，其中环序列为21bp(5′-ATTGAGGAC

CYP2C9*2(rs1799853，C430T)引物和探针序列如下：

引物1的序列：5′-AGGTGACACTATAGAATATCAGCTTCCTCTTTCTTGCC-3′；

引物2的序列：5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CCACCCTTGGTTTTTCTCAA-3′；

探针的序列：5′-HEX-CGAGCATTGAGGAC

其中N为变异碱基，具体为C>T；

CYP2C9*3(rs1057910，A1075C)引物和探针序列如下：

引物1的序列：5′-AGGTGACACTATAGAATAGAACGTGTGATTGGCAGAAA-3′；

引物2的序列：5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGTCACAGGTCACTGCATGG-3′；

探针的序列：5′-FAM-CCAGAGATAC

其中N为变异碱基，具体为A>C

VKORC1(-1639G>A)(rs9923231)引物和探针序列如下：

引物1的序列：5′-AGGTGACACTATAGAATACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3′

引物2的序列：5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCTCTGGGAAGTCAAGCAAG-3′；

探针的序列：5′-CY5-CCACCGCACC

其中N为变异碱基，具体为G>A。

上述探针和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2：检测不同基因型标准品

1、用质粒CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1构建并制备含有目的基因rs1799853、rs1057910、rs9923231位点的野生型标准品质粒和突变型标准品质粒(质粒来源，以及含目的基因质粒的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过sanger测序确定序列的准确性，野生型标准品质粒rs1799853基因型为CC、rs1057910基因型为AA；rs9923231基因型为GG；突变型标准品质粒rs1799853基因型为TT、rs1057910基因型为CC、rs9923231基因型为AA。标准品质粒DNA浓度标化到10ng/ul。

2、采用实施例1中的探针及引物。

3、PCR反应体系：

1)在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，3组正向引物溶液0.5uM及3组反向引物溶液各0.5uM，3组探针个0.1uM，然后在3个不同的PCR反应孔中分别加入野生型标准品质粒DNA、突变型标准品质粒DNA、混合型DNA(野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合)各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；

2)在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟；95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

4、应用PCR仪配套软件SLAN分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs1799853位点峰出现在63℃为CC基因型，出现在57℃为TT基因型，两个位置都有峰为CT基因型(图2)。rs1057910位点峰出现在54℃为AA基因型，出现在60℃为CC基因型，两个位置都有峰为AC基因型(图3)。rs9923231位点峰出现在68℃为GG基因型，出现在63℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型(图4)。

实施例3：使用华法林个体化用药相关基因(CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1)检测试剂盒双盲实验考察

1、采用硅胶吸附法抽提50例上海地区健康志愿者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本DNA浓度标化到10ng/ul。

2、检测方法如下：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，正向引物溶液各0.5uM及反向引物溶液各0.5uM，探针各0.1uM，同时进行弱阳性对照(rs1057910基因型为AC和rs9923231基因型为AG)、阴性对照(rs1057910基因型为AA、rs1799853基因型为CC和rs9923231基因型为GG)和待测样本的检测，每个反应孔加入DNA2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在荧光定量PCR检测仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟；95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

3、应用配套软件分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs1799853位点峰出现在63℃为CC基因型，出现在57℃为TT基因型，两个位置都有峰为CT基因型(图2)。rs1057910位点峰出现在54℃为AA基因型，出现在60℃为CC基因型，两个位置都有峰为AC基因型(图3)。rs9923231位点峰出现在68℃为GG基因型，出现在63℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型(图4)。如图5所示为多样本的熔解曲线图，分型成功率达到100％。

4、将50例口腔上皮细胞基因组DNA同时进行sanger测序，检测结果与本发明的检测结果完全相符，由此说明，本发明的方法用于CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1基因多态性结果准确度高。

序列表

<110> 上海中优精准医疗科技股份有限公司

<120> 用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n=c或t

<400> 1

cgagcattga ggacngtgtt caagaggctc g 31

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtgacact atagaatatc agcttcctct ttcttgcc 38

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaagccctc acgtagcgaa ccacccttgg tttttctcaa 40

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n=a或c

<400> 4

ccagagatac nttgaccttc tgg 23

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtgacact atagaataga acgtgtgatt ggcagaaa 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaagccctc acgtagcgaa tgtcacaggt cactgcatgg 40

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n=g或a

<400> 7

ccaccgcacc nggccaatgg tgg 23

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtgacact atagaatact cctgacctca agtgatcca 39

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaagccctc acgtagcgaa cctctgggaa gtcaagcaag 40