一种利用磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。

背景技术

目前传统的提取血液DNA的方法源自于《分子克隆实验指南》的“新鲜抽取或冻存血细胞的裂解”，该方法主要利用酚/氯仿对DNA进行抽提，但此方法提取DNA的纯度低，容易受到血浆蛋白的污染，实验操作时间长，此外，使用到的试剂对人体和环境均有毒害作用；离心柱法虽然能提高DNA的纯度，但是由于亲和柱的亲和力问题，离心法只能吸附大的DNA片段。

发明内容

本发明的的目的是为了提供一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，克服了现在常用方法中有害溶剂对人体危害的影响，省时省力，节约成本，且提取的基因组DNA纯度高的问题。本发明提供了一种利用磁珠技术提取血液DNA的试剂盒，所述试剂盒的成分由红细胞裂解液、磁珠漂洗液、DNA洗脱液、结合液和磁珠组成，所述结合液由SDS、Tris-HCl和EDTA组成，所述磁珠漂洗液为乙醇水溶液，所述DNA洗脱液为Tris-HCl和EDTA，所述红细胞裂解液由Tris-HCl、NaCl和MgCl

进一步地限定，所述红细胞裂解液中Tris-HCl浓度为0.01mol/L，PH＝7.6，NaCl浓度为0.01mol/L，MgCl

进一步地限定，所述磁珠漂洗液中乙醇溶液的体积分数为70％。

进一步地限定，所述DNA洗脱液中Tris-HCl浓度为10mM，PH＝7.5，EDTA浓度为0.1mM。

进一步地限定，所述磁珠的浓度为300nM。

进一步地限定，所述结合液中Tris-HCl的浓度为10mM，PH＝8，EDTA浓度为14mM，SDS质量分数为0.4％。

本发明还提供了上述的利用磁珠技术提取血液DNA试剂盒在提取血液DNA中的应用。

进一步地限定，所述应用的具体步骤如下：

(1)取全血100μL-400μL加入到1.5mL的离心管中，加入20μL蛋白酶K，然后加入300μL结合液，混匀后65℃静置15分钟，每隔1分钟-3分钟进行一次混匀，总共进行5次；

(2)向步骤(1)得到的溶液中加入350μL异丙醇，混匀后加入50μL磁珠溶液，混匀后在室温静止7分钟，每隔1分钟进行一次混匀，总共进行5次；

(3)将步骤(2)得到的溶液进行瞬时离心，收集管底液体，然后将收集的液体放置在磁力架上静止2分钟，吸弃所有溶液，然后加入700μL磁珠漂洗液，重悬磁珠，洗涤磁珠2次后，吸弃所有溶液；

(4)将磁珠放置在空气中干燥10分钟-15分钟，待磁珠表面无明显水珠光泽且没有残留液体后，加入50～100μLDNA洗脱液，重悬磁珠后，置于58℃条件下孵育5分钟，然后放置在磁力架上静止1分钟-2分钟，将上清液至新的离心管中，完成提取全血中的DNA。

有益效果：1.操作简单快速，无需对全血进行预处理，1h即可快速完成提取操作，大大缩短了全血基因组DNA提取时间。

2.本试剂盒不使用氯仿、苯酚等有机溶剂，可大幅降低对实验人员的身体伤害。

3.本试剂盒的提取方法可有效减少提取过程中核酸的损失，大大增加提取效率，基因组DNA产物纯度高，片段更完整。

4.样本适用性广：可从新鲜或冻存的抗凝血(EDTA、肝素等)、白膜层、血凝块、唾液、口腔拭子等样品中直接提取基因组DNA。

附图说明

图1为本发明提取的人类全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳条带，其中，M是Marker，100uL为提取100uL人全血DNA的样本，200uL为提取200uL人全血DNA的样本，300uL为提取300uL人全血DNA的样本，400uL为提取400uL人全血DNA的样本；

图2为本发明提取白膜层、血凝块、唾液和口腔拭子基因组DNA的结果图，其中，横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度。

具体实施例

实施例1.

利用磁珠技术提取血液DNA的试剂盒，所述试剂盒的成分由红细胞裂解液、磁珠漂洗液、DNA洗脱液、结合液和磁珠组成。

(1)结合液：0.4％SDS，10mMTris-HCl(pH8.0)，14mM的EDTA(pH8.0)。

(2)红细胞裂解液：0.01mol/LTris-HCLpH7.6；0.01mol/LNaCl；0.005mol/LMgCl2。

(3)磁珠漂洗液：体积分数为70％的乙醇溶液。

(4)DNA洗脱液：10mMTrisHCL和0.1mMEDTA配制，最终PH是7.5。

(5)磁珠的规格：300nM的羟基磁珠。

实施例2.利用磁珠法提取血液基因组DNA的方法

使用实施例1中的试剂盒提取3份人类冷冻抗凝血液基因组DNA。

1.准备干净的1.5mL离心管，按顺序加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，100μL人全血样本，最后加入300μL裂解/结合液GAL，涡旋震荡30s以混匀；65℃放置15min，每隔1～3min上下颠倒5次混匀。

2.将上一步溶液从水浴锅取出，室温放置约3min，加入350μL异丙醇，涡旋混匀约10s；再加入50μLDNA结合磁珠，涡旋或上下颠倒混匀20s，室温静置7min，上下颠倒5次混匀。

3.瞬时离心2s，收集管底液体。

4.将离心管转移至磁力架上，放置2min吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。

5.加入700μL洗涤液(已加入无水乙醇)，涡旋混匀，将管壁磁珠完全悬浮于溶液中，瞬时离心2s收集管壁液体，转移至磁力架上静置1min，或待溶液完全澄清时，小心吸弃所有溶液。

6.重复步骤5一次。

7.加入700μL漂洗液(已加入无水乙醇)，涡旋混匀，将管壁磁珠完全悬浮于溶液中，瞬时离心2s收集管壁液体，转移至磁力架上静置1min，或待溶液完全澄清时，小心吸弃所有溶液。

8.重复步骤7一次。

9.将离心管从磁力架上取下，瞬时离心3s收集管壁残留液体，置于磁力架上十几秒吸附磁珠，用200μL移液器吸头移去所有残留液体，保持离心管盖打开状态，于空气中干燥10～15min。注意：干燥时间与磁珠加入量、空气湿度和环境温度有关，实际干燥时间应灵活增减，以磁珠表面无明显水珠光泽，离心管无残留液体为宜，磁珠过度干燥会造成DNA难以洗脱而影响得率。

10.加入50～100μL洗脱液，涡旋1min重悬磁珠，将离心管置于58℃水浴锅中孵育5min，期间可每隔2～3min摇动离心管加速DNA溶解。

11.瞬时离心2s收集管壁磁珠及液体，将离心管转移至磁力架上，静置1～2min，小心转移DNA溶液至新的1.5mL离心管中。DNA溶液可于2～8℃中暂时保存1～2天，长时间保存请将DNA溶液置于-20℃。

实施例3.利用磁珠法提取血液基因组DNA的方法

使用实施例1中的试剂盒提取3份人类冷冻抗凝血液基因组DNA：方法参照实施例2，200μL人全血样本。

实施例4.利用磁珠法提取血液基因组DNA的方法

使用实施例1中的试剂盒提取3份人类冷冻抗凝血液基因组DNA：方法参照实施例2，300μL人全血样本。

实施例5.利用磁珠法提取血液基因组DNA的方法

使用实施例1中的试剂盒提取3份人类冷冻抗凝血液基因组DNA：方法参照实施例2，400μL人全血样本。

利用以下实验验证实验效果：

提取不同人全血血液体积(100μL、200μL、300μL、400μL)基因组实验结果。琼脂糖凝胶浓度为1％，样本上样3.0μL，M为15KbDNAMarker，上样5μL，电压130V，电泳时间20min。结果如图1所示，所获得全基因组DNA产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组DNA完整性好，且无其它DNA污染，DNA产物含量高且纯度良好。

分别提取人的细胞，白膜层、血凝块、唾液、口腔拭子的总DNA，稀释适当稀释后扩增内参基因ACTB，细胞样本：10^6293T细胞，血凝块：1g血凝块，抗凝血：1mL，唾液稀释液：5mL，咽拭子浸出液：1mL可得到有效扩增条带，结果如图2所示。