一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒

文献发布时间：2023-06-19 10:44:55

技术领域

本发明涉及一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒，属于医学检测技术领域。

背景技术

人解脲脲原体是介于细菌与病毒之间的最小原核生物，是1954 年Shepard首次从非淋菌性尿道炎(UUU)患者的尿道分泌物中分离获得，在分类学上属支原体科脲原体属，因生长需要尿素而得名。主要寄居于人体的泌尿生殖道，是性传播疾病的重要病原体之一。解脲脲原体是人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，在特定环境下可致病。在人体的定植可有二次上升趋势，即分娩时由母体产道感染新生儿，以后迅速减少；从性生活开始又逐渐增多。近年来，解脲脲原体所致泌尿生殖道感染日益受到重视，是引起NGU的病原体之一，现已被列为性传播疾病的病原体。

目前，临床上检测脲原体的主要方法有液体培养法、固体培养法、免疫学方法和分子生物学方法等，相应方法特点如下：

液体培养法：目前国内临床实验室采用的主要检测方法是液体培养法。该法操作简单、仅靠肉眼判定结果。商业化的支原体培养、鉴定、计数及药敏一体化试剂盒可以对脲原体进行半定量的检测和对四环素类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素进行定性药敏检测。其主要原理是脲原体可以分解尿素产NH3，根据培养基内的酚红指示剂颜色变化来判断是否有脲原体生长。

固体培养法：固体培养法可以通过显微镜观察支原体特有的如“海胆型”或“油煎蛋样”菌落，可以同时鉴别多种支原体。

免疫学方法：免疫学方法可通过直接检测特异性抗原或抗体来判断是否感染脲原体，可对脲原体的感染做出早期、快速的诊断。其操作简单，快速，无需特殊设备，结果容易判断，在临床上可作为脲原体感染的辅助诊断指标。

分子生物学方法：分子生物学检测主要是根据脲原体的尿素酶基因、多带抗原基因和16S rRNA.23S rRNA基因进行扩增检测，应用较多的是聚合酶链反应技术(PolymeraseChain Reaction，PCR)，以及在此基础上的其他PCR技术。其具有快速、敏感的特点，已广泛用于解脲脲原体实验室诊断，具有广阔的应用前景。采用实时荧光PCR 方法，通过对等标本进行人解脲脲原体核酸检测，可对感染进行确诊。

采用上述方法的主要缺点。

1液/固体培养法：操作麻烦、培养时间长、成本较高以及有效期短等，上液体和固体法之间的阳性率也有一定的争议，而且存在支原体形态和菌落较难辨认以及存在异质性等问题。

2免疫学方法：由于健康人群中脲原体检出率也很高，所以用抗体滴度很难解释脲原体的感染，血清中抗体含量比较低也会出现假阴性，另外结果容易受到溶血、脂血等因素的影响，导致免疫学检测法的特异性不高，也未标准化，所以目前临床上未能广泛应用。

3常规的核酸检测采用实时荧光定量PCR方法：操作技能要求严格，需经专业培训，执PCR上岗证上岗，必须在PCR认证实验室开展，需要专门的实验室(3个分区)。人解脲脲原体核酸检测根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4-5小时，如果考虑到样本在院内的流转时间，则从患者取样到拿到检测结果一般需要6-8小时。绝大多数基层医院实验室并不具备上述专业人员和设备设施，只会将样本运送至有资质的实验室，而大部分情况下，有资质的实验室自己医院的样本都做不完，核酸确诊的难度可想而知。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对人解脲脲原体进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。

本发明的技术方案：一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，扩增反应液UU UreA基因的引物探针混合液；所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有Taq DNA聚合酶溶液；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。磁珠可以在使用时加入裂解腔。

上述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述DNA聚合酶溶液的体积为0.5-10μl，含有的酶为0.1-100个活性单位。

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，扩增反应所需的聚合酶溶液在可熔性材料内，使反应液体系的反应液与DNA聚合酶分离，有效保存DNA聚合酶的活性，延长卡盒的有效期。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃-95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述UU UreA基因的引物探针混合液包括：UU UreA基因上游引物和UU UreA基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及UU UreA基因探针和内标探针，具体为

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述裂解液包含 1-1000mM乙酸-乙酸钠、0.1-20％PEG(聚乙二醇)，0.1-10M GTC (异硫氰酸胍)，pH值为2.0-7.0，溶剂为ddH

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述所述第一清洗液包含1-1000mMTris-HCl、和0.1-10％PEG；第二清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、0.1-10％PEG和0.1-2％非蛋白封闭剂。溶剂为ddH

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述柱塞的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为0.01-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述疏水性液态封闭材料为硅油。

前述的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒中，所述反应腔为置于盒体外侧的锥管，锥管一侧设有平面，便于外部磁钢将磁珠拉回至上方的可熔性材料中(降温后凝固)，进而不会对光学检测产生干扰。

与现有技术相比，本发明的人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒，可对人解脲脲原体进行快速准确的检测。结合本发明经过反复研究试验而筛选出的引物与探针，使其在检测的时效性、特异性、灵敏性、便捷性和技术参数等多个方面都优于其它分子诊断试剂盒。

本发明涉及的人解脲脲原体一体化核酸快速检测卡盒具有以下优点：

1)全封闭式设计：1台AIGS设备，少量实验室基础小设备就能完成复杂的核酸检测实验。它采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭卡盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室。大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求。有助于条件有限地区的联防布控；

2)极简操作：以手工操作时间2-5分钟，上机30-90分钟出结果，核酸提取与扩增一体化技术设计及自动判断软件，真正实现从样本处理到结果报告的全自动化，大大降低了对检验人员专业技能的要求，适合于快速现场的床边诊断；

3)冷藏保存：2-8度冷藏保存，无需常规的-20度冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存。

此外，本发明使用柱塞结合疏水性液态封闭材料的方式对多个功能性腔体进行隔离，使各个腔体间的液体不会外溢，生物样本能够在各个腔体内分别进行裂解、清洗纯化和扩增反应，并可以利用磁珠以附着方式将核酸依次带入各个腔体，其中疏水性液态封闭材料能够对磁珠有个分散作用，它能够允许穿过磁珠和磁珠上的核酸，阻隔其它杂质，当磁珠穿过时，磁珠上附着的如一些非极性大颗粒的杂质会浸润在疏水性液态封闭材料内而被截留，可以降低杂质对检测结果的影响。

附图说明

图1是本发明卡盒的结构示意图；

图2是图1的侧向示意图。

附图中的标记为：1-盒体，2-盒盖，3-裂解腔，4-第一清洗腔， 5-第二清洗腔，6-反应腔，7-柱塞，8-磁珠。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒，如图1所示：包括顶部带盒盖2的盒体1，盒体1内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔3、带第一清洗液的第一清洗腔4和带第二清洗液的第二清洗腔5，其中裂解腔3连通至盒盖2，第二清洗腔5连通至盒体1外侧底部设置的反应腔6；所述裂解腔3、第一清洗腔4、第二清洗腔5 和反应腔6的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞7，柱塞7的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔 6内设有扩增反应液，扩增反应液包括UU UreA基因的引物探针混合液；所述反应腔6中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有Taq DNA聚合酶溶液；所述裂解腔3内设有能穿过柱塞7的柱塞孔的磁珠 8。所述反应腔6中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。所述DNA聚合酶溶液的体积为0.5-10μl，含有的酶为0.1-100个活性单位。所述UUUreA基因的引物探针混合液包括：UU UreA基因上游引物和UU UreA基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及UU UreA基因探针和内标探针，具体为

所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠、0.1-20％PEG，0.1-10 M GTC，pH值为2.0-7.0。所述所述第一清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、和0.1-10％PEG；第二清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、 0.1-10％PEG和0.1-2％非蛋白封闭剂。

所述柱塞7的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠8的直径为0.01-100 μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

所述反应腔6为置于盒体1外侧的锥管，锥管一侧设有平面,如图2的A部所示。

一、人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒的建立。每管PCR加入 30ul PCR扩增液及5ulDNA聚合酶液。并加入5ul模板DNA。

1分装PCR缓冲液：向扩增区底部分装30ul PCR缓冲液；PCR 缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L(NH

2包埋Taq DNA聚合酶：在PCR缓冲液上层用可熔性材料包埋2.5U Taq DNA聚合酶。

3封闭：用适量硅油封闭反应液；

4分装第二清洗液：向第二清洗腔分装140ul第二清洗液；

5封闭：用适量硅油封闭第二清洗液；

6分装第一清洗液：向第一清洗腔分装140ul第一清洗液；

7封闭：用适量硅油封闭第一清洗液；

8分装裂解液：向裂解液区分装800ul裂解液。

二、使用方法及快速鉴定。

样本的采集、保存和运输。

1.1样本类型：拭子；

1.2样本采集：

尿道拭子:对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内2cm～3cm，稍用力转动，保留5s～10s后取出。

女性生殖道拭子：用扩阴器扩张阴道，先用无菌棉球擦去宫颈口分泌物；用女性拭子于阴道深部或阴道后穹窿、宫颈口等处取材，取出拭子到采样管。

1.3运输保存。

临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，等待运输的样本储存在液氮或干冰中，如果不能确保≤-20℃的条件，可在4～8℃保存24h。此外，需根据世界卫生组织试剂感染运输法规进行包装运输。

检测卡盒的使用。

打开卡盒的盖子，再打开封口膜，加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)。再加入200μL样本，用移液器分吹打试剂混匀(建议至少吹打15次)，后盖紧盖子。

实时荧光定量PCR扩增及检测。

2.1样本检测

应用全自动核酸检测荧光定量PCR仪Life Ready K1000，采用全自动核酸检测分析系统对PCR扩增产物进行分析，综合扩增曲线与 Tm值判定结果。荧光通道设置如下表。

设置扩增程序如下：

2.2对照组设置。

本发明对人解脲脲原体UU序列进行分析和研究，设计了下表所示的引物探针组。

本发明引物探针

对照组1引物探针

对照组2引物探针

各组引物探针配置的反应液检测结果如下：

结果显示：对比对照组1-3，本发明的引物探针的检测敏感性和特异性最优。

2.3结果分析。

1.检测程序运行结束后，适用仪器自动报告检测结果。

2.结果显示人解脲脲原体(Ureaplasma)UreA基因(FAM)、内部质控(ROX)的检测结果。

3.人解脲脲原体(UU)UreA基因(FAM)基因结果应呈现典型S 型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤38，判为人解脲脲原体(Ureaplasma)阳性。

4.内部质控ROX荧光通道检测结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)。当靶标(FAM)阴性且内部质控Ct≤38时，实验结果有效。否则需要重新取样后检测。

2.4为检测本发明卡盒针对UU检测的准确性和有效性，我们对卡盒的灵敏度和特异性进行测试。

1)对不同浓度的UU质控品进行检测，来确认检测限；

2)对可能在相同取样部位取到的其他病原体(包括淋球菌、人型支原体、单纯疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、沙眼衣原体、人巨细胞病毒、肺炎支原体、生殖支原体以及克鲁斯假丝酵母、表皮葡萄球菌、粪链球菌、热带假丝酵母、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、乳酸乳球菌乳亚种、无乳链球菌(GBS)等均进行检测，来验证特异性。

结果：我们对不同浓度的UU质控品进行检测，如下表是Ure A 基因的结果。

确认本发明的检测卡盒对UU的检测限为250copies/ml。

3)可能在相同取样部位取到的其他病原体(包括解脲脲原体、人型支原体、单纯疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、沙眼衣原体、人巨细胞病毒、肺炎支原体、生殖支原体以及克鲁斯假丝酵母、表皮葡萄球菌、粪链球菌、热带假丝酵母、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、乳酸乳球菌乳亚种、无乳链球菌(GBS) 等均无非特异性扩增。

三、检测实例。

浙江邵逸夫医院验证结果。

样本类型：男性尿道拭子、女性生殖道拭子

样本数量：196例

临床样本检测结果如下表所示：

结果表明，95例阳性样本经对比方法确认后，检测结果一致。因此可以得出结论：201例样本检测结果中95例阳性样本符合率 100％。

以上所述实施例为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，其他的任何未背离本发明的实质原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州遂曾生物技术有限公司

<120> 一种人解脲脲原体一体化核酸检测卡盒

<130> 2021012904

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA