作为安全的骨替代物的哺乳动物源性基质

技术领域

本发明涉及一种制造用作骨移植物或骨替代物的基质的方法。特别地，对哺乳动物牙齿或哺乳动物骨骼进行加工以在再生医学中提供安全的异种移植物。

背景技术

骨移植是一种可以替代缺失的骨骼的手术过程，并且广泛用于再生医学中，例如在牙科手术中、在治疗骨折中或在切除骨肿瘤后使用(例如，参见The Merck Manual,第19版,2011,第364页)。骨可以再生，但需要移植物作为支架。移植物可来自患者自身的身体-自体移植物-或者其可来自其他供体或尸体骨骼-同种异体移植物；移植物可以是合成的。移植材料优选应该是骨传导性的，即应支持新骨骼在其表面上的生长；该材料优选还应该是骨诱导性的，即它应该诱导成骨过程。由于牙本质与骨骼非常相似，因此考虑将拔出的牙齿用于制备骨移植物；例如，EP 2 462 899涉及一种由患者自己的牙齿制备的牙槽骨移植物，其工序包括在醇中脱水，在醚中脱脂以及在盐酸中脱钙。非常需要将牙齿支架材料用于有需要的任何受试者并且不仅用于牙齿供体作为自体移植物，但是强烈的免疫应答或病毒和其他感染的危险限制了这种移植物在相同物种的其他受试者中的使用(同种异体移植物)，更何况在不同物种的受试者中的使用(异种移植物)。US 9,610,383试图通过在减压下用超声波照射拔出的牙齿或骨骼，然后进行化学处理(包括用盐酸处理)来克服该问题。更加严格的安全法规要求开发用于自体移植应用以外的新基质。因此，本发明的目的是提供一种作为骨替代物的基质，以用于骨替代应用。

本发明的另一个目的是提供一种用于制造骨移植用的支架基质的方法，所述支架基质基于哺乳动物牙齿并且可替代同种异体移植物应用。

本发明的又一个目的是提供一种用于制造骨移植用的支架基质的方法，所述支架基质基于哺乳动物牙齿并且可用作异种移植物。

本发明的另一个目的是提供一种基于哺乳动物牙齿的基质，所述基质可在同种异体移植应用和异种移植应用中安全地用作骨替代物。

随着描述的进行，本发明的其他目的和优点将显现。

发明内容

本发明提供一种骨移植物或骨替代物，包括压碎的哺乳动物牙齿或骨骼或其部分的非细胞粉末，所述非细胞粉末被用醇的氢氧化物提取并被加热至110℃至190℃的温度。在一个实施方式中，本发明提供一种骨移植物或骨替代物，包含压碎的哺乳动物牙齿或骨骼或其部分的非细胞粉末，所述非细胞粉末被用醇的氢氧化物提取并与抗RGD抗体阳性反应。本发明还提供一种骨移植物或骨替代物，包含压碎的哺乳动物牙齿或骨骼或其部分的非细胞粉末，所述非细胞粉末被用醇的氢氧化物提取，被加热至110℃至190℃的温度，并优选与抗RGD抗体阳性反应。在一个实施方式中，本发明的骨移植物或骨替代物用作自体移植物或同种异体移植物。在一个重要的实施方式中，本发明的骨移植物或骨替代物被安全地用作异种移植物。

本发明涉及一种制造骨移植物或骨替代物的方法，包括以下步骤：i)提供哺乳动物牙齿或骨骼或其一部分；ii)将所述哺乳动物牙齿或骨骼或其一部分浸入碱金属氢氧化物的醇溶液中；iii)在浸入所述醇的氢氧化物中后，用盐水溶液洗涤所述牙齿或骨骼或其一部分；iv)在110℃至190℃的温度加热并干燥所述洗涤过的牙齿或骨骼或其一部分；和v)压碎所述牙齿或骨骼或其一部分，其中在步骤i)至iv)中的任一个之后执行所述压碎步骤；从而提供压碎的哺乳动物牙齿或其部分的非细胞粉末，以用作安全的骨移植物。在本发明的优选实施方式中，所述方法包括：i)提供哺乳动物牙齿或骨骼或其一部分，洗涤并压碎所述牙齿或骨骼或其一部分；ii)将所述压碎的哺乳动物牙齿或骨骼或其一部分浸入碱金属氢氧化物的醇溶液中持续0.25小时至5小时的时间段；iii)在步骤ii)的所述浸入之后，用盐水溶液洗涤所述压碎的材料；和iv)将步骤iii)的所述压碎和洗涤过的材料在110℃至190℃温度下加热0.1小时至3小时的时间段。

在本发明的优选实施方式中，牙齿的所述部分包括牙本质。在本发明的一个优选的实施方式中，将哺乳动物牙齿进行加工以分离含有牙本质的级分以用于进一步的步骤。本发明的方法可以包括以下步骤：在进一步加工之前去除软组织或在进一步加工之前去除牙釉质，或去除两者并且在没有这些组分的情况下执行步骤ii)至iv)。在本发明的优选实施方式中，该方法还包括γ照射。所述醇包括低级醇，优选乙醇。所述碱金属氢氧化物可包括氢氧化钠。

所述醇优选是50-90体积％，例如约70％体积的乙醇水溶液，并且所述氢氧化物是以在环境温度下在所述乙醇水溶液中至多饱和的浓度的氢氧化钠。将所述浸入步骤优选进行0.3小时至3小时，例如0.5小时至1小时，并且将所述加热步骤进行0.2小时至2小时。所述洗涤步骤可以包括盐水溶液，例如0.15MNaCl，其可能被缓冲。洗涤可需要0.75小时至1.5小时，例如1小时。所述加热步骤可需要在150℃进行0.3小时至1小时，例如约0.5小时。

本发明的目的在于提供一种安全的骨移植物或骨替代物，其基本上是压碎的哺乳动物牙齿或骨骼或其部分的非细胞粉末，所述非细胞粉末被用醇的氢氧化物提取并在高于105℃且低于200℃的温度，优选地在110℃至190℃，例如在120℃至180℃的温度下被加热，用于在牙科手术中、在治疗骨折中或在切除骨肿瘤之后替换缺失的骨骼。

在一个重要的实施方式中，本发明提供了包含哺乳动物牙齿或骨骼或其部分的材料在制备骨骼同种异体移植物或异种移植物中的用途，所述材料被用醇的氢氧化物处理并被加热至110℃至190℃的温度。

具体实施方式

已经表明，骨形态发生是由例如在脱矿骨骼或牙齿中发现的殊肽诱导的(参见，例如，US 6,677,306)。因此，许多工作试图提供源自脱矿骨骼或牙齿或源自用盐酸处理的材料的骨移植物(参见已经引用的EP 2 462 899和US 9,610,383)。现已发现，如果将哺乳动物牙齿或其部分用醇的氢氧化物处理并加热到110℃或更高(例如150℃)的温度，那么从所述哺乳动物牙齿或其部分得到的包含牙本质并不含细胞的粉末可有利地用作安全的骨移植物；这看起来令人惊讶，因为即时条件不会使牙齿脱矿，而且此外，所述条件按照推测会破坏和/或去除特殊的生长肽。发明人认为，不希望受到任何特定理论的限制，本发明的牙齿源性材料包括残余的牙本质，其支持骨再生。特别地，发明人认为，牙齿源性材料含有羟磷灰石和残余胶原，所述胶原即使通过醇的氢氧化物和热处理改性，也会表现出骨诱导作用，并且与羟磷灰石一起也表现出骨传导作用，所述作用是由改性的胶原蛋白和无机基质的结合的结构性质产生的。在本发明的一个实施方式中，当提供与针对Arg-GlyAsp(RGD)序列的抗体的阳性反应时，牙齿源性材料特别有效；已知RGD序列包含在细胞粘附分子的受体中以及作为牙本质一部分的胶原蛋白I中。在本发明的另一方面，本发明的方法被应用于哺乳动物骨骼或其部分，从而提供优异的骨移植物或骨替代物。

基于以上发现，本发明涉及一种组合物，其用于治疗骨折，或用于在牙科手术中替代缺失的骨骼，或用于在切除骨肿瘤之后提供骨骼。该组合物没有毒性、免疫原性低，并且不含传染原。特别地，该组合物绝对不含任何感染原或毒性原(toxic agent)，包括真核微生物、孢子、细菌、病毒、蛋白质、脂多糖或核酸。

本发明的组合物包含牙质源性牙本质或骨骼源性基质，其被用醇的氢氧化物处理并被加热至110℃至190℃，例如约150℃的温度。在一个实施方式中，将牙齿源性材料或骨骼源性材料在两个不同的温度在两个步骤中加热。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种用作骨移植物的组合物，其源自哺乳动物牙齿或骨骼或其部分，例如源自不含牙釉质和细胞组分的牙齿，所述牙齿暴露于在醇溶液中的碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)，所述溶液包含低级醇(任选地与另一种有机溶剂或水混合)。所述醇包括例如乙醇。在一个实施方式中，本发明的组合物与抗RGD抗体阳性反应。

在以下实施例中将进一步描述和说明本发明。

在泡罩包装阶段之前，所有步骤均在清洁的通风橱中进行。该过程包括研磨牙齿(例如猪牙齿)，并在300μm进行筛分，然后再次研磨较大的颗粒。将将牙齿浸入溶于70体积％乙醇的氢氧化钠，70重量％NaOH+30重量％乙醇(70体积％)中持续40分钟，同时用蠕动泵不时搅拌以释放非牙本质物质，使其漂浮并除去所述漂浮材料。除去醇的氢氧化物，并用蒸馏水将压碎的牙齿洗涤十次，并将其浸入PBS中持续5分钟。除去PBS，并重复浸入直至洗涤液的pH为7.5至8.5。将压碎并洗涤过的牙齿放在不锈钢托盘上，呈不高于1cm的层，并在烘箱中在180℃加热10分钟，并在130℃加热90分钟。如果干燥损失高于5％，则将在130℃的加热时间延长30分钟。

将所需的部分包装到玻璃或塑料瓶或其他医疗级材料中。如果需要，将部分转移到γ照射。在最终包装中未观察到微生物生长。进行了生物相容性测试和体外细胞毒性测试，产品符合要求。

尽管已经根据一些具体实施例描述了本发明，但是许多修改和变化是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内，可以以与具体描述不同的方式实现本发明。