人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用。

背景技术

黑色素沉积是异常增多的黑色素在皮肤的某些部位过量沉着，进而形成色素斑、老年斑等。紫外线照射、内分泌失调、不良生活习惯等可导致皮肤弹性减退、色素沉着以及整体肤色偏黑偏暗，严重影响人体皮肤美观，特别是在“以白为美”的亚洲文化影响下，肤色白皙在审美中占有非常重要的位置。因此，全球美白护肤市场巨大，在功效型护肤品上，美白淡斑的比例是最高的，很多跨国公司仅销售美白产品，年收益就可达数亿美元。所以，寻找具有抑制黑色素沉积和美白功效的成分已成为科学研究和产品开发的热点。

黑色素形成是一个复杂的生物化学过程，黑色素合成与降解的不平衡是导致色素沉着的主要原因。酪氨酸酶在黑色素合成过程中发挥着至关重要的作用，因此，抑制酪氨酸酶的表达和活性已成为抑制黑色素沉积的最有效方法。目前，市面上最常见的美白剂有曲酸、熊果苷和维生素C等酪氨酸酶抑制剂，它们可以减少黑色素中间体被氧化的数量。此外，α-羟基酸也常被用于皮肤美白。然而，这些化合物均存在如下明显的缺点：曲酸具有致敏性和潜在的致癌风险，熊果苷为氢醌衍生物，氢醌在酪氨酸酶的作用下被氧化成有毒性的半醌物质，会引起皮肤红斑、脱屑、瘙痒、刺痛、过敏，甚至引起皮肤永久性损害，并具有致癌性；维生素C衍生物仅在高浓度下有效果，并且其在化妆品配方中很难稳定存在；α-羟基酸具有很强的刺激性。相比较，目前上没有促进黑色素降解的制剂产品。

综上所述，目前亟需寻找一种可应用于美白护肤产品中且安全有效的新型美白制剂。

发明内容

基于以上问题，本发明提供人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用，本发明无免疫排斥及致瘤作用，弥补了市面上美白产品致敏性高、致癌风险大的缺陷，填补了美白市场空缺，明显优于市面上护肤品中的美白添加剂，优势突出。

为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

人羊膜干细胞培养物的制备方法，具体制备方法如下：

a.将人羊膜干细胞接种在含有完全培养基的细胞培养皿中培养，待细胞汇合度为90％时，弃掉完全培养基；

b.用PBS清洗3次，然后加入DMEM无血清培养基继续培养48h；

c.收集上清，即初获人羊膜干细胞培养物，在4℃、1000rpm条件下离心3min去除细胞碎片；

d.将上清置于蛋白浓缩管中，在4℃、4500g、70min的条件下，离心浓缩，获得的最终浓缩物即为人羊膜干细胞培养物，放置于-80℃保存、待用。

进一步的，步骤c中收集上清时，DMEM无血清培养基中的细胞密度至少为2x 10

进一步的，所述人羊膜干细胞为人羊膜上皮干细胞或人羊膜间充质干细胞。

为解决以上技术问题，本发明还提供了人羊膜干细胞培养物在制备美白护肤产品中的应用。

进一步的，所述美白护肤产品可用于抑制由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积，其抑制机制为抑制黑色素合成和促进黑色素降解。

进一步的，所述化学物质为α-促黑色素细胞激素，所述物理方法为紫外线照射。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的干细胞培养物中的活性成分具有美白皮肤、提亮肤色、保持皮肤健康自然的功效，对由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积具有很好的预防和治疗效果，且成分安全，无免疫排斥及致瘤作用，对人体无明显毒副作用，弥补了市面上美白产品致敏性高、致癌风险大的缺陷，填补了美白市场空缺，明显优于市面上护肤品中的美白添加剂，优势突出，且制备方法简单，操作过程可控，具有重要的产业化价值。

附图说明

图1为本发明的实施例的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞抑制黑色素分泌量的平板对照图和柱状图；

图2为本发明的实施例的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞抑制黑色素含量的示意图和柱状图；

图3为本发明的实施例的人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基(细胞密度为2×10

图4为本发明的实施例的不同浓度的人羊膜间充质干细胞条件培养基和上皮干细胞条件培养基对黑色素分泌量的抑制作用结果图；

图5为本发明的实施例的不同浓度的人羊膜间充质干细胞条件培养基和上皮干细胞条件培养基对黑色素含量的抑制作用结果图；

图6为本发明的实施例的人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基对酪氨酸酶活性抑制率测试结果图；

图7为本发明的实施例的表观色度对照图；

图8为本发明的实施例的表观亮度(L值)对照图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例从人分娩后的羊膜中分离、纯化获得人羊膜干细胞，包括人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞，经体外培养后收集含有多种干细胞分泌因子的上清，并经过适当浓缩及其它处理后得最终的人羊膜干细胞培养物。

人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞的分离提取方法如下：

1)在无菌条件下，将人羊膜从分娩后的人胎盘组织中剥离，并用含有1％双抗(青霉素/链霉素)的D-Hank's液进行清洗，去除羊膜上的血丝和粘稠物；

2)将清洗后的羊膜剪碎，加入胰酶，在37℃条件下消化45分钟至羊膜变白；

3)取上清，离心1500rpm，5分钟；

4)取沉淀，用人羊膜上皮细胞培养基重悬，清洗，离心1500rpm，5分钟；

5)重复步骤(4)；

6)取沉淀，即人羊膜上皮干细胞(hAESCs)；

7)剩余的羊膜经胰酶继续消化45分钟，彻底清除残余的人羊膜上皮干细胞；

8)剩余的羊膜经胶原酶4继续消化至组织融化，呈粘稠状；

9)用200目的筛网过滤，收集滤液，离心3000rpm，5分钟；

10)取沉淀，用羊膜间充质干细胞培养基重悬、清洗，离心1000rpm，3min；

11)重复步骤(10)；

12)取沉淀，用羊膜间充质干细胞培养基重悬，铺板，根据分离原代人羊膜间充质干细胞的贴壁速率，选择在6小时进行换液清洗，即弃掉上清(含未贴壁的细胞)，剩余的贴壁细胞为人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。

所使用到的羊膜间充质干细胞培养基配方如下：

所使用到的羊膜上皮干细胞培养基配方配方如下：

人羊膜干细胞表面标志物的鉴定：本实施例通过上述方法获得的人羊膜上皮干细胞体外培养呈卵圆形，人羊膜间充质干细胞呈长梭形。本实施例通过RT-PCR、流式及免疫荧光检测人羊膜上皮干细胞和人羊膜间充质干细胞的结果显示，人羊膜上皮干细胞和人羊膜间充质干细胞均可表达胚胎干细胞生物标志物SSEA-4、Nanog、OCT-4，间充质干细胞生物标志物CD73、CD105、CD29、CD90，不表达造血干细胞标志物CD34、CD45，表达主要组织相容性蛋白HLA-ABC，不表达主要组织相容性蛋白HLA-DR。鉴定结果说明本实施例获得了健康的人羊膜上皮干细胞和人羊膜间充质干细胞。

本实施例对本实施例所获得的人羊膜上皮干细胞和人羊膜间充质干细胞的美白效果进行了测试：用人羊膜间充质干细胞、人羊膜上皮干细胞分别与小鼠黑色素瘤细胞B16-F10共培养，48小时后，在α-促黑色素细胞激素(α-MSH)刺激的病理条件下，检测加入hAMSCs和hAESCs后小鼠黑色素瘤细胞B16-F10中黑色素的含量和分泌量的变化。测试结果见附图1和附图2，图中Control为对照组，hAMSCs为人羊膜间充质干细胞，hAESCs为人羊膜上皮干细胞，α-MSH为α-促黑色素细胞激素，*代表具有显著性。结果显示hAMSCs和hAESCs两者均可明显降低细胞内的黑色素含量及显著抑制其分泌，说明hAMSCs和hAESCs的培养物适合作为护肤品中的美白活性剂。

人羊膜上皮干细胞培养物和人羊膜间充质干细胞培养物的美白效果测试及最佳有效浓度的筛选实验如下：收集人羊膜间充质干细胞和上皮干细胞培养后的培养基，浓缩10倍，再进行适度稀释，将稀释液分别加入小鼠黑色素瘤细胞B16-F10中，检测黑色素含量和分泌量的变化。结果见附图3、附图4和附图5，其中0.1代表培养基浓度为2x 10

根据上述筛选试验，本实施例利用上述获得的人羊膜干细胞制备人羊膜干细胞培养物的制备方法如下：

a.将人羊膜干细胞包括人羊膜上皮干细胞或人羊膜间充质干细胞接种在细胞培养皿(所用培养基为上述相应的培养基，也可为其他培养基)中培养，待细胞汇合度约为90％时，弃掉完全培养基；

b.用PBS清洗3次，然后加入DMEM基础培养基(即无血清培养基)继续培养48h；

c.收集上清(即初获人羊膜干细胞培养物)，在4℃、1000rpm条件下离心3min去除细胞碎片；

d.将上清置于蛋白浓缩管中，在4℃、4500g、70min条件下进行浓缩，获得的最终浓缩物即为人羊膜干细胞培养物，放置于-80℃保存、待用。

本实施例对初获人羊膜干细胞培养物进行浓缩的目的是方便后续应用，应用时选择相应的溶剂或培养基进行稀释即可。本实施例的上述步骤c中收集上清时，无血清培养基中的细胞密度至少为2x 10

本实施例利用上述获得的人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基对酪氨酸酶活性抑制率进行了测试：将人羊膜间充质干细胞条件培养基或人羊膜上皮干细胞条件培养基加入小鼠黑色素瘤细胞B16-F10中，48小时后，测定蘑菇酪氨酸酶的活性，总反应体系为300μL，依次在96孔板中加入酪氨酸酶溶液50μL，磷酸盐缓冲液90μL，受试溶液60μL，左旋多巴溶液100μL，用紫外分光光度计测定475nm波长处的吸光度值。结果见附图6，结果显示人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基的酪氨酸酶活性抑制率分别为70％和53％。

本实施例还在动物水平上对人羊膜间充质干细胞条件培养基的美白效果进行了测试：利用20W UVB灯管照射C57BL/6小鼠耳朵，剂量为150mJ/cm

3D黑色素皮肤模型是一种有效检测被试药物对人体皮肤黑色素影响的工具，适当的刺激因素可诱导3D黑色素皮肤模型的黑色素沉积(模仿皮肤应激过程中的黑色素沉积)。自模型出厂当天(定义为第0天)，每天进行50mJ/cm

见附图7和附图8，结果显示，人羊膜间充质干细胞条件培养基可明显抑制UVB照射导致的3D黑色素人皮肤模型的黑色素沉积，表现为人皮肤模型的表观色度及表观亮度明显改善，提示其具有显著的美白亮肤效果。

本实施例显示本实施例的人羊膜干细胞培养物可应用于制备美白护肤产品中，所述美白护肤产品可用于抑制由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积，抑制机制为抑制黑色素合成和促进黑色素降解，但不限于上述所述引起黑色素沉积的原因。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。