一种利用南药植物提取物制备的水稻穗萌抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于种子生产技术领域，具体涉及一种利用南药植物提取物制备的水稻穗萌抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

穗萌是一些禾谷类作物成熟后期且尚未脱离母株之前遇到连续高温、阴雨天气时其籽粒在穗上萌发的现象。全球每年因农作物穗萌造成的损失接近10亿美元(Nonogakietal.,2018；Xu et al.,2019)。我国主要粮食作物水稻、小麦、玉米、高粱等在成熟后期往往伴有穗萌的发生，给制种和粮食生产带来巨大的威胁。据统计，华南地区因受夏秋季节长期高温阴雨气候影响，超过6％的水稻种植区出现穗萌现象，杂交稻穗萌率最高可达20％，严重影响了稻米的产量和品质(Guo et al.,2004；Zhu et al.,2019)。然而，目前有关水稻穗萌的发生机理仍不清楚，尚缺乏高效、低成本的穗萌抑制技术体系。

水稻穗萌既是遗传性状，又是受多种生理生化因素调节的生理性状。长期以来，生产上对穗萌的控制主要依赖于抗穗萌品种的选择，然而这种基于表型性状的选择是一个相当复杂的过程。一些抗穗发芽的基因如OsVP1和OsPhs1/7近年来也逐渐被发掘(Xu et al.,2019)，然而这些基因大规模应用于水稻制种和粮食生产仍需假以时日。应用具有一些植物生长延滞类物质，如青鲜素、多效唑、烯效唑、矮壮素、ABA等具有一定的穗萌抑制效果，其中以青鲜素和ABA抑制效果最强。然而，由于青鲜素的毒性以及ABA应用后导致种子过度休眠等问题，生产上也逐渐被淘汰。

公告号为CN103975921B专利文献公开了一种穗萌抑制剂及抑制水稻穗萌的方法，所述穗萌抑制剂以水为溶剂，含有1000～2000mg/kg的丁香酚。但丁香酚极难溶于水，且该化学试剂对于水稻种子的品质产生一定的影响以及食用安全存在一定的隐患，而且不利于环保。

公告号为CN106106548B专利文献公开了一种复合型水稻穗萌抑制剂及其制备方法和应用。该水稻穗萌抑制剂由以下按质量百分比计的原料制成：香豆素类提取物17.00～18.00％、苦杏仁提取物15.00～16.00％、桑根提取物10.00～11.00％、水杨酸提取物15.00～16.00％、青梅提取物14.50～16.00％、杨梅提取物20.00～22.50％、多效唑3.00～3.50％、脱落酸1.50～2.00％。该复合型制剂尽管能有效抑制水稻籽粒早萌，但由于脱落酸的影响，所收获的子代种子依然存在较强程度的休眠，播种后出现萌发迟缓、成苗不齐的问题。

公告号为CN106172523B专利公开了一种绿色水稻穗萌抑制剂及其制备方法和应用。该水稻穗萌抑制剂由以下按质量百分比计的原料制成：杨梅提取物29.00～30.00％、苦杏仁提取物25.00～25.50％、桑根提取物24.00～25.00％、水杨酸提取物10.00～11.00％、青梅提取物10.00～10.50％。该配方最大的特点是均来自天然植物提取物，避免了化学试剂对水稻种子品质的影响。目前为止，此类运用植物天然提取物作为抑制水稻穗萌的技术和产品仍寥寥无几，远远满足不了水稻制种和粮食生产上的需求。

综合上述的研究，当育种途径和普通的栽培措施都不能较好地抑制水稻穗萌的情况下，应用化学试剂控制这一现象是当前农业生产中最常使用的措施之一。但是由于化学试剂和生长激素对土壤、空气、水体等环境因子以及种子活力及毒性物质的影响还有待于进一步探讨，存在安全性问题。因此，从天然植物中提取有效成分作为水稻穗萌抑制剂是最为安全且稳妥的，也将为水稻穗萌抑制提供更加安全有效的技术和产品。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种利用南药植物提取物制备的水稻穗萌抑制剂及其制备方法与应用。该穗萌抑制剂可以通过单独使用或者通过与水稻成熟后期的田间管理措施结合一起来控制水稻籽粒穗萌的发生。

本发明的水稻穗萌抑制剂，按质量百分比计由以下组分组成：大阿米芹种子提取物44％～45％，龙血竭叶片提取物25％～26％，苏木花提取物20％～21％和铁力木花提取物9％～10％。

优选，所述的水稻穗萌抑制剂，按质量百分比计由以下组分组成：大阿米芹种子提取物44.5％，龙血竭叶片提取物25.5％，苏木花提取物20.5％和铁力木花提取物9.5％。

所述的大阿米芹种子提取物是按以下步骤制备得到：将当年收获的大阿米芹种子，在温度35～45℃条件下干燥10～15天得到干燥大阿米芹种子，采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到大阿米芹种子提取物；所述的乙醇提取法中干燥大阿米芹种子与乙醇溶液的质量比例为1：10～12，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；

所述的龙血竭叶片提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的龙血竭老树，摘取当年生的新叶或1～2年生的老叶，于温度15℃、相对空气湿度15％条件下干燥得到干燥的龙血竭叶片原料；将干燥的龙血竭叶片原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到龙血竭叶片提取物；所述的乙醇提取法中干燥的龙血竭原料与乙醇溶液的质量比例为1：10～12，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；

所述的苏木花提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的苏木老树，于春季摘取带花的鲜嫩枝梗，于温度15℃、相对空气湿度15％条件下干燥得到干燥的苏木花原料；将苏木花原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到苏木花提取物；所述的乙醇提取法中干燥的苏木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：8～10，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；

所述的铁力木花提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的铁力木老树，于春季摘取带花的鲜嫩枝梗，于温度15℃、相对空气湿度15％条件下干燥得到干燥的铁力木花原料；将铁力木花原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到铁力木花提取物；所述的乙醇提取法中干燥的铁力木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：8～10，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液。

优选，所述的大阿米芹种子提取物的制备，其中干燥的大阿米芹种子与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液；

所述的龙血竭叶片提取物的制备，其中干燥的龙血竭原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液；

所述的苏木花提取物的制备，其中干燥的苏木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液；

所述的铁力木花提取物的制备，其中干燥的铁力木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液。

所述的大阿米芹种子提取物中，呋喃香豆素的质量百分含量≥40％，佛手内脂的质量百分含量≥10％；

所述的龙血竭叶片提取物中，以查尔酮、二氢查耳酮等黄酮类物质计，质量百分含量≥30.0％；酸类、脂类、芳香性化合物等挥发油百分含量≥10％；

所述的苏木花提取物中，苏木酮质量百分含量≥20％；

所述的铁力木花提取物中，铁力木素质量百分含量≥5％，铁力木酮百分含量≥2％。

本发明还提供所述的水稻穗萌抑制剂的制备方法，按质量份，称取大阿米芹种子提取物44～45份，龙血竭叶片提取物25～26份，苏木花提取物20～21份和铁力木花提取物9～10份，混合均匀，得到水稻穗萌抑制剂。

本发明还提供所述的水稻穗萌抑制剂在抑制种子萌发中的应用。

优选，为在抑制水稻种子萌发和抑制水稻穗萌中的应用。

优选，所述的应用，将所述的水稻穗萌抑制剂溶于水中配制成质量分数0.1％～0.5％的穗萌抑制剂水溶液后施用。

本发明的原理是：

大阿米芹种子提取物：伞形科植物大阿米芹的种子提取物；主要活性成分为呋喃香豆素、花椒毒素、佛手内脂、黄酮类和植物甾醇类等。大阿米芹种子中含有的凯琳成分可用于治疗冠状动脉型疾病，如狭心症、冠状血栓症等。欧洲民间用本植物医治泌尿系统疾病。种子也含有卵磷脂，有抑制胆固醇的作用，具有保护心脏、缓解心绞痛的作用。此外，大阿米芹种子中含有大量的呋喃香豆素，可用于治疗白癜风和牛皮藓等皮肤疾病。在本配方中主要是利用大阿米芹种子中含有大量的香豆素，而香豆素已经被证实具有抑制种子内源脱落酸分解，增加种子内源脱落酸含量的功能，因此对水稻种子萌发和穗上发芽具有强烈的抑制作用。

龙血竭叶片提取物：天门冬科植物龙血竭叶片的提取物；主要活性为查尔酮类、二氢查耳酮类、黄酮和二氢黄酮类、黄烷类、聚合黄酮类、色原酮类以及烷烃、酸类、脂类、芳香性化合物等挥发油成分。医药上常将龙血竭用于跌打损伤、淤血作痛、妇女气血凝滞、外伤出血以及慢性结肠炎所致的腹痛、腹泻等症。由于龙血竭叶片提取物中含有大量的黄酮类化合物，在本配方中主要是利用其抑制水稻穗发芽过程中种子内源活性氧的产生，减缓籽粒中糖类化合物的水解从而达到抑制籽粒早萌的效果。

苏木花提取物：豆科植物苏木的花及花序提取物；主要成分为苏木酮、苏木酚、鼠李素、懈皮素、苏木查尔酮等化合物。该提取物在医药上主要用于活血祛瘀、消肿定痛。对于妇女血滞经闭，痛经，产后瘀阻心腹痛，血晕，跌打损伤和破伤风等有疗效。本配方中主要是利用其含量大量的苏木酮和苏木酚，可有效抑制水稻种子和籽粒中的α-淀粉酶活性，从而减少种子中可溶性糖的积累，达到抑制萌发防止穗发芽的效果。此外，该提取物对种子表面和内部的病原菌也具有一定的抑制效果，不仅可以抑制萌发，经过该化合物处理的种子其种子寿命也得到了延长，有助于种子的安全保存。

铁力木花提取物：藤黄科植物铁力木花的提取物；主要成分为曼蜜苹果素、铁力木精、曼蜜苹果精、铁力木苦素、铁力木双黄酮等。该南药具有止咳化痰、解毒消肿，调水补血、消火解毒、收敛生肌的功效。临床上已经证实铁力木花提取物具有超强的抗氧化活性，具有维生素C的抗氧化功效，对超氧阴离子自由基等表现出较强的清除能力。在本配方中主要是利用其抑制水稻穗发芽过程中种子内源活性氧等自由基的产生，减缓籽粒中糖类化合物的水解从而抑制萌发起作用。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明配方合理，充分利用了各原料特性，合理组配使其发挥水稻穗萌抑制综合作用和最佳效果，经实验验证对水稻种子萌发和穗萌抑制效果非常明显，达到了既安全健康又防止穗萌的目的；(2)本发明水稻穗萌抑制剂加工制作简单，使用方便。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

各原料来源如下：

1、大阿米芹种子提取物是按以下步骤制备得到：将当年收获的大阿米芹种子，在温度35～45℃条件下干燥10～15天得到干燥大阿米芹种子，采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到大阿米芹种子提取物；所述的乙醇提取法中干燥的大阿米芹种子与乙醇溶液的质量比例为1：10～12，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；所述的大阿米芹种子来自广西南宁。

以下实施例1～4中所用的大阿米芹种子提取物的制备方法同上，其中干燥的大阿米芹种子与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液。具体为：将1质量份的干燥的大阿米芹种子粉碎后，加入到10质量份的体积分数70％的乙醇水溶液中，搅拌条件下室温浸提1小时，分离提取液，再经喷雾干燥得到大阿米芹种子提取物。所得大阿米芹种子提取物中，呋喃香豆素的质量百分含量≥40％，佛手内脂的质量百分含量≥10％。

2、龙血竭叶片提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的龙血竭老树，摘取当年生的新叶或1～2年生的老叶，采用低温低湿(温度15℃，相对空气湿度15％)干燥法得到干燥的龙血竭叶片原料；将干燥的龙血竭叶片原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到龙血竭叶片提取物；所述的乙醇提取法中干燥的龙血竭叶片原料与乙醇溶液的质量比例为1：10～12，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；所述龙血竭树来自广西钦州。

以下实施例1～4中所用的龙血竭叶片提取物的制备方法同上，其中干燥的龙血竭叶片原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液。具体为：将1质量份的干燥的龙血竭叶片粉碎后，加入到10质量份的体积分数70％的乙醇水溶液中，搅拌条件下室温浸提1小时，分离提取液，再经喷雾干燥得到龙血竭叶片提取物。所得龙血竭叶片提取物中，以查尔酮、二氢查耳酮等黄酮类物质计，质量百分含量≥30.0％；酸类、脂类、芳香性化合物等挥发油百分含量≥10％。

3、苏木花提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的苏木老树，于春季摘取带花的鲜嫩枝梗，采用低温低湿(温度15℃，空气湿度15％)干燥法得到干燥的苏木花原料；将苏木花原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到苏木花提取物；所述的乙醇提取法中干燥的苏木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：8～10，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；所述苏木花来自广东或广西。

以下实施例1～4中所用的苏木花提取物的制备方法同上，其中干燥的苏木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液。具体为：将1质量份的干燥的苏木花粉碎后，加入到10质量份的体积分数70％的乙醇水溶液中，搅拌条件下室温浸提1小时，分离提取液，再经喷雾干燥得到苏木花提取物。所得苏木花提取物中，苏木酮质量百分含量≥20％。

4、铁力木花提取物是按以下步骤制备得到：选取10年以上的铁力木老树，于春季(3～5月)摘取带花的鲜嫩枝梗，采用低温低湿(温度15℃，空气湿度15％)干燥法得到干燥的铁力木花原料；将铁力木花原料采用乙醇提取法得到提取液，再经喷雾干燥法得到铁力木花提取物；所述的乙醇提取法中干燥的铁力木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：8～10，所述的乙醇溶液为体积分数65％～95％的乙醇水溶液；所述铁力木花来自广东或广西。

以下实施例1～4中所用的铁力木花提取物的制备方法同上，其中干燥的铁力木花原料与乙醇溶液的质量比例为1：10，所述的乙醇溶液为体积分数70％的乙醇水溶液。具体为：将1质量份的干燥的铁力木花粉碎后，加入到10质量份的体积分数70％的乙醇水溶液中，搅拌条件下室温浸提1小时，分离提取液，再经喷雾干燥得到铁力木花提取物。所得铁力木花提取物中，铁力木素质量百分含量≥5％，铁力木酮百分含量≥2％。

实施例1：

按质量份称取以下各组分：44.5质量份的大阿米芹种子提取物、25.5质量份的龙血竭叶片提取物、20.5质量份的苏木花提取物和9.5质量份的铁力木花提取物，置于调配罐中，搅拌均匀，制备得到水稻穗萌抑制剂，用复合铝袋包装或罐装。

实施例2：

按质量份称取以下各组分：44质量份的大阿米芹种子提取物、25.5质量份的龙血竭叶片提取物、21质量份的苏木花提取物和9.5质量份的铁力木花提取物，置于调配罐中，搅拌均匀，制备得到水稻穗萌抑制剂，用复合铝袋包装或罐装。

实施例3：

按质量份称取以下各组分：45质量份的大阿米芹种子提取物、26质量份的龙血竭叶片提取物、20质量份的苏木花提取物和9质量份的铁力木花提取物，置于调配罐中，搅拌均匀，制备得到水稻穗萌抑制剂，用复合铝袋包装或罐装。

实施例4：

按质量份称取以下各组分：44.2质量份的大阿米芹种子提取物、25质量份的龙血竭叶片提取物、20.8质量份的苏木花提取物和10质量份的铁力木花提取物，置于调配罐中，搅拌均匀，制备得到水稻穗萌抑制剂，用复合铝袋包装或罐装。

实施例5：

粳型常规稻“日本晴”和籼型常规稻“桂禾丰”、“桂华占”种子在实施例1水稻穗萌抑制剂处理后发芽率与发芽势的变化情况。

称取实施例1配制的水稻穗萌抑制剂1g，加入到1L水中加热、搅拌溶解，获得质量分数0.1％的穗萌抑制剂水溶液(即其中含0.0445％大阿米芹提取物、0.0255％龙血竭叶片提取物、0.0205％苏木花提取物、0.0095％铁力木花提取物)。分别将上述水稻日本晴、桂禾丰、桂华占种子放入发芽盒(12*12cm)中，盒子内铺2层滤纸。每个盒子100粒种子，设置四个重复。取上述质量分数0.1％的穗萌抑制剂水溶液20ml加入发芽盒内，对照组为20ml清水。发芽条件设置为光照10h，30℃，无光照14h，25℃。将吸胀第四天的发芽率作为发芽势，第七天的发芽率作为最终发芽率。发芽率的计算公式：发芽率％＝萌发种子数/供试种子数×100％。

表1粳型常规稻“日本晴”和籼型常规稻“桂禾丰”、“桂华占”种子在0.1％穗萌抑制剂中吸胀过程中的萌发率变化

实施例6：

粳型常规稻“日本晴”和籼型常规稻“桂禾丰”、“桂华占”在温室中经实施例1水稻穗萌抑制剂处理后穗萌率的变化情况

称取实施例1配制的穗萌抑制剂500g，加入到用100kg水中加热、搅拌溶解，用塑料桶灌装后即得质量分数0.5％的穗萌抑制剂水溶液(即其中含0.2225％的大阿米芹种子提取物，0.1275％龙血竭叶片提取物，0.1025％苏木花提取物，0.0475％铁力木花提取物)。在可控温控湿的温室(温度32℃±2；湿度98％±2)中种植粳型常规稻“日本晴”、籼型常规稻“桂禾丰”和“桂华占”三个品种的水稻，每个品种各种植两个区域(每个种植区为1分地，分对照组和穗萌抑制剂处理组)。于黄熟期喷施上述的质量分数0.5％的穗萌抑制剂水溶液，每分地喷施5L，对照组喷施同样体积的清水。15天后水稻基本上已经达到完熟，此时统计三个品种的穗萌发生率。每个品种的对照组和处理组分别随机选取2000粒种子统计穗萌种子数。从表2可以看出，穗萌抑制剂对水稻的穗萌抑制效果非常明显。穗萌发生率的计算公式：穗萌发生率％＝芽谷数/总谷粒数×100％。

表2粳型常规稻“日本晴”和籼型常规稻“桂禾丰”、“桂华占”经穗萌抑制剂处理后穗萌率的变化情况

此外，喷施过上述的质量分数0.5％的穗萌抑制剂水溶液的水稻品种，其种子在收获后于4℃条件贮藏两个月，之后再用于发芽试验，发现种子的发芽率均能达到85％以上。因此，该穗萌抑制剂不存在对种子正常发芽的抑制现象，有别于其他含有脱落酸成分的穗萌抑制剂。

对比例1

称取实施例1配制的穗萌抑制剂500g，加入到用100kg水中加热、搅拌溶解，用塑料桶灌装后即得质量分数0.5％的穗萌抑制剂水溶液(即其中含0.2225％的大阿米芹种子提取物，0.1275％龙血竭叶片提取物，0.1025％苏木花提取物，0.0475％铁力木花提取物)。另外，称取香豆素，加水加热搅拌溶解配制5mM的香豆素水溶液共100kg。称取用于实施例1-4的大阿米芹种子提取物，加水加热搅拌溶解配制质量分数0.2％的大阿米芹种子提取物水溶液共100kg。

在可控温控湿的温室(温度32℃±2；湿度98％±2)中种植籼型常规稻“桂华占”品种的水稻。于黄熟期喷施上述的(1)质量分数0.5％的穗萌抑制剂水溶液或(2)5mM的香豆素水溶液或(3)质量分数0.2％的大阿米芹种子提取物水溶液，作为三个处理，每分地喷施5L，对照组喷施同样体积的清水。15天后水稻基本上已经达到完熟，此时统计穗萌发生率。不同处理和对照组分别随机选取2000粒种子统计穗萌种子数，结果如表3。穗萌发生率的计算公式：穗萌发生率％＝芽谷数/总谷粒数×100％。

表3不同试验组对籼型常规稻“桂华占”穗萌作用效果比较

结果表明，香豆素是大阿米芹种子提取物抑制水稻穗萌的主要功能成分，单独使用5mM的香豆素水溶液(质量分数为0.073％)或质量分数0.2％的大阿米芹种子提取物水溶液均能够显著抑制水稻穗萌。香豆素浓度过高时会出现水稻枝梗枯萎，稻穗发黑等现象，而5mM浓度的香豆素对种子无产生此负面作用，可以认为该浓度为抑制水稻穗萌的较适浓度。

然而就穗萌抑制效果而言，5mM香豆素、0.2％的大阿米芹种子提取物与本发明实施例1的穗萌抑制剂的抑制效果相差甚远。说明，本发明穗萌抑制剂中通过复配大阿米芹种子提取物与另外3种南药提取物(龙血竭叶片提取物、苏木花提取物和铁力木花提取物)，大大提升了在水稻穗萌抑制上的效果，穗萌发生率降低至1.26％，可见四种南药提取物的组合物与单一组分相比，能够相互促进其药效的发挥，对于水稻穗萌抑制具有提质增效的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。