一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物缓释制剂领域，具体涉及一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球及其制备方法和应用。

背景技术

在现代社会中，癌症是对人类生命造成威胁的主要因素之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)2014年发布的《世界癌症报告》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，将逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。在如此严峻的形势下，寻找出对癌症疾病的有效治疗方法显得非常重要。在临床医学领域中，传统的抗癌药物注射疗法虽然方便快捷，有一定的治疗效果，但是会导致体内局部药物浓度过大而造成伤害，由于人体对药物分子代谢较快，有效药物浓度在体内留存时间较短，只能暂时性减缓疾病痛苦，需要对患者进行长期重复给药，这样会导致人体内药物分子累积残留量不断增加，从而对患者引起一定的毒副作用。为了对药物进行控制释放，通过药物载体携载特定药物进行缓释性能研究已受到国内外研究学者的广泛关注。在构建药物缓释系统(Drug Delivery System)的过程中，药物载体作为药物缓释系统的重要组成部分，其形貌粒径、化学成分、孔隙结构等理化因素既能影响载体的载药性能，还能影响药物缓释系统的药物缓释性能，使之达到理想缓释效果和治疗效果。因此，对药物载体的材料制备方法不断研究创新已成为近年来新的研究热点。

羟基磷灰石(HAP)是人体骨骼和牙齿的主要无机组成成分，因其具有良好的生物相容性和生物安全性而被广泛应用于药物缓释载体研究中。目前已有研究表明HAP具有良好生物相容性以及对正常细胞几乎无毒性。同时，HAP具有良好的生物可降解性，其降解周期与材料的理化性能具有密切关联。多孔中空HAP由于具有中空结构和多孔结构，其具有比表面积大、生物相容性良好等优点，将其用作药物缓释载体时，具有载药率大、包封率高、副作用小等优势，使得药物缓释系统具有良好的载药性能以及药物缓释性能等优点，能够安全、缓慢、高效的控制药物按需释放。瑞戈非尼作为一种新型的抗癌药物，其化学结构为脂溶性大分子，在水中溶解度不高，不利于羟基磷灰石的负载。本发明通过对羟基磷灰石进行改性，制备了一种载药量高、释药时间长的包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球。

发明内容

本发明提供了一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球及其制备方法和应用。通过对纳米多孔羟基磷灰石进行聚氨基酸修饰，能够有效控制活性成分瑞戈非尼的释放速率，提高了药物释药率和治疗效果，还能够显著降低药物对患者的副作用，在药物缓释载体领域具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，所述缓释微球含有如下重量份的组分：瑞戈非尼5-10份，纳米多孔羟基磷灰石10-20份；所述纳米多孔羟基磷灰石是经聚氨基酸修饰的。

优选的，所述聚氨基酸为聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚赖氨酸。

进一步的，本发明还提供了包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)多孔球形碳酸钙的制备：将表面活性剂溶解在浓度为0.5％的甲苯中，取70ml甲苯与表面活性剂的混合溶液于30ml、1mol/L的碳酸钠溶液中，超声波乳化10-12min；将乳化液倒入浓度为0.2mol/L的CaCl

(2)多孔羟基磷灰石的制备：称取1g多孔球形碳酸钙粉末加入200ml水中制备悬浊液，在搅拌条件下将0.03mol/L的Na

(3)包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备：称取氨基酸单体10.0g置于250ml圆底烧瓶中，加入1.0ml的85％磷酸溶液和2.0ml蒸馏水并充分混合均匀，将混合物于油浴条件下逐渐升温至180-220℃，同时抽真空，反应1-2h，反应结束后，冷却至油浴温度为80℃，加入30ml80％的乙醇水溶液，使产物完全溶解；在室温和搅拌条件下，将溶解后的溶液10ml缓慢滴入到250ml含有1.0g瑞戈非尼与2.0g多孔羟基磷灰石的混悬液中，将生成物过滤，干燥，即得缓释微球。

优选的，所述步骤(1)中的表面活性剂为吐温-80或卯磷脂。

优选的，所述步骤(1)、(2)中的烘箱干燥时间为10h。

优选的，所述步骤(3)中的油浴加热温度为200℃。

进一步的，本发明还提供了包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球在制备治疗癌症药物中的用途。

优选的，所述癌症为结直肠癌或肝癌。

瑞戈非尼是由拜耳制药公司研制的一种口服多激酶抑制剂，药物结构与索拉非尼相似，区别仅为瑞戈非尼的中央苯环上增加了一个氟原子，这使得两个药物既相似却又有不同的生化特性。体外生化分析显示，相对于索拉非尼，瑞戈非尼对VEGFR-2、PDGFR-β、FGFR-1和c-Kit的抑制作用更强。同时，瑞戈非尼还能抑制Tie-2，具有更广泛的抗血管生成作用。在抑制肿瘤细胞增殖方面，瑞戈非尼和索拉非尼均靶向c-RAF、野生型BRAF和BRAFV600E，并干扰肿瘤发生时异常激活的MAP激酶胞内信号传导通路。其中，抑制MAP激酶p38是瑞戈非尼独有的特征。由此可见，与索拉非尼相比，瑞戈非尼靶向的激酶范围更广，在药理学上具有更强的作用，是一个颇有前景的抗肿瘤药物。瑞戈非尼的化学结构如下：

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明利用纳米多孔羟基磷灰石作为药物载体与临床抗肿瘤药物瑞戈非尼进行负载结合得到药物载体系统。纳米技术有助于提高难溶性药物瑞戈非尼的溶解度，提高药物利用率。纳米药物递送系统可以提高药物的膜穿透能力和稳定性，也有利于提高病变位点药物的浓度。羟基磷灰石负载药物分子是一个复杂的过程，有物理吸附和化学吸附，如氢键、范德华力、化学键等，物理吸附相较于化学吸附容易被洗掉。羟基磷灰石表面存在羟基，可以与瑞戈非尼分子间形成氢键，也可以靠范德华力吸附瑞戈非尼，还可以靠表面改性剂与瑞戈非尼分子间形成化学键紧密结合，将瑞戈非尼负载于羟基磷灰石表面，提高瑞戈非尼在肿瘤细胞膜上的通透性，将其带入肿瘤细胞内。然后在细胞内将药物释放，可以提高细胞内药物浓度，降低有效药物浓度，这可以降低对正常组织的损伤。

(2)本发明制备的纳米羟基磷灰石复合材料是将球形多孔羟基磷灰石与药物瑞戈非尼充分混合制备混悬液，利用羟基磷灰石的多孔性初步吸附药物，再进一步利用氨基酸单体在聚合形成高分子过程中的成膜性质和蜷缩性，对溶液中的游离药物与含药羟基磷灰石制剂进行修饰，最终形成以载药多孔羟基磷灰石为核心，高分子聚合物为膜衣的纳米缓释制剂。负载于高分子膜衣中、羟基磷灰石内核以及表面上的药物在释放介质存在时，可随着高分子的溶胀特性，不同时间缓慢释放。该缓释微球一方面通过有机高分子的加入改善了无机载体羟基磷灰石粒子的易聚集性，降低了羟基磷灰石粒子的粒径，使其达到纳米级别，更易于进入肿瘤细胞的内部；另一方面，通过修饰，减缓了吸附于羟基磷灰石粒子表面药物的释放，从而避免了纳米粒子的药物突释现象。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1

一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，所述缓释微球的制备方法包括以下步骤：

(1)多孔球形碳酸钙的制备：将吐温-80溶解在浓度为0.5％的甲苯中，取70ml甲苯与吐温-80的混合溶液于30ml，1mol/L的碳酸钠溶液中，超声波乳化11min；将乳化液倒入浓度为0.2mol/L的CaCl

(2)多孔羟基磷灰石的制备：称取1g多孔球形碳酸钙粉末加入200ml水中制备悬浊液，在搅拌条件下将0.03mol/L的Na

(3)包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备：称取谷氨酸单体10.0g置于250ml圆底烧瓶中，加入1.0ml的85％磷酸溶液和2.0ml蒸馏水并充分混合均匀，将混合物于油浴条件下逐渐升温至200℃，同时抽真空，反应1.5h，反应结束后，冷却至油浴温度为80℃，加入30ml80％的乙醇水溶液，使产物完全溶解；在室温和搅拌条件下，将溶解后的溶液10ml缓慢滴入到250ml含有1.0g瑞戈非尼与2.0g多孔羟基磷灰石的混悬液中，将生成物过滤，干燥，即得缓释微球。经测定，微球载药量为7.86％。

实施例2

一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，所述缓释微球的制备方法包括以下步骤：

(1)多孔球形碳酸钙的制备：将吐温-80溶解在浓度为0.5％的甲苯中，取70ml甲苯与吐温-80的混合溶液于30ml，1mol/L的碳酸钠溶液中，超声波乳化11min；将乳化液倒入浓度为0.2mol/L的CaCl

(2)多孔羟基磷灰石的制备：称取1g多孔球形碳酸钙粉末加入200ml水中制备悬浊液，在搅拌条件下将0.03mol/L的Na

(3)包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备：称取天冬氨酸单体10.0g置于250ml圆底烧瓶中，加入1.0ml的85％磷酸溶液和2.0ml蒸馏水并充分混合均匀，将混合物于油浴条件下逐渐升温至200℃，同时抽真空，反应1.5h，反应结束后，冷却至油浴温度为80℃，加入30ml80％的乙醇水溶液，使产物完全溶解；在室温和搅拌条件下，将溶解后的溶液10ml缓慢滴入到250ml含有1.0g瑞戈非尼与2.0g多孔羟基磷灰石的混悬液中，将生成物过滤，干燥，即得缓释微球。经测定，微球载药量为7.10％。

实施例3

一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，所述缓释微球的制备方法包括以下步骤：

(1)多孔球形碳酸钙的制备：将吐温-80溶解在浓度为0.5％的甲苯中，取70ml甲苯与吐温-80的混合溶液于30ml，1mol/L的碳酸钠溶液中，超声波乳化11min；将乳化液倒入浓度为0.2mol/L的CaCl

(2)多孔羟基磷灰石的制备：称取1g多孔球形碳酸钙粉末加入200ml水中制备悬浊液，在搅拌条件下将0.03mol/L的Na

(3)包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备：称取赖氨酸单体10.0g置于250ml圆底烧瓶中，加入1.0ml的85％磷酸溶液和2.0ml蒸馏水并充分混合均匀，将混合物于油浴条件下逐渐升温至200℃，同时抽真空，反应1.5h，反应结束后，冷却至油浴温度为80℃，加入30ml80％的乙醇水溶液，使产物完全溶解；在室温和搅拌条件下，将溶解后的溶液10ml缓慢滴入到250ml含有1.0g瑞戈非尼与2.0g多孔羟基磷灰石的混悬液中，将生成物过滤，干燥，即得缓释微球。经测定，微球载药量为8.09％。

对比例1

一种包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，所述缓释微球的制备方法包括以下步骤：

(1)多孔球形碳酸钙的制备：将吐温-80溶解在浓度为0.5％的甲苯中，取70ml甲苯与吐温-80的混合溶液于30ml，1mol/L的碳酸钠溶液中，超声波乳化11min；将乳化液倒入浓度为0.2mol/L的CaCl

(2)多孔羟基磷灰石的制备：称取1g多孔球形碳酸钙粉末加入200ml水中制备悬浊液，在搅拌条件下将0.03mol/L的Na

(3)包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球的制备：将250ml含有1.0g瑞戈非尼与2.0g多孔羟基磷灰石的混悬液在室温下进行搅拌，将生成物过滤，干燥，即得缓释微球。经测定，微球载药量为6.69％。

在50ml塑料离心管中准确移入20ml磷酸盐缓冲液(PBS)，精密称量实施例1-3、对比例1制备的缓释微球10mg置于PBS溶液中，将试剂放入水浴恒温摇床中固定好，调节恒温摇床工作条件为37.3℃。另取50ml离心管1只，移入PBS 20ml，放入水浴恒温摇床中备用。在样品投入时开始计时，分别于1、2、4、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108和120h时取出样品，用蒸馏水清洗，放入备用离心管中，将不同时段取出的标本分别用紫外分光光度计检测，计算出药物瑞戈非尼的累积释放率(％)。实验设定3个平行样。实验结果如表1所示。

表1.瑞戈非尼的体外累积释放过程

由表1的实验结果可知，在开始阶段的0-4h内，瑞戈非尼从纳米多孔羟基磷灰石表面突然释放，这些可能是物理性吸附的药物分子，因为物理吸附不紧密，容易被洗脱；在4-96h范围内，药物释放速率有不同程度减少，在96h时实施例1-3的药物累积释放率均超过90％；在96-120h范围内，药物释放水平基本达到平衡，瑞戈非尼不能从纳米多孔羟基磷灰石中完全释放，这主要是因为纳米多孔羟基磷灰石与瑞戈非尼分子之间具有较强的吸附作用。具体来讲，实施例1的经聚谷氨酸修饰的缓释微球累积释放率达到92.7％，实施例2的经聚天冬氨酸修饰的缓释微球累积释放率达到93.3％，实施例3的经聚赖氨酸修饰的缓释微球累积释放率达到96.6％。可见，经聚赖氨酸修饰的缓释微球累积释放率最优。此外，与未经聚氨基酸修饰的缓释微球相比，本发明的包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球释放速率更加平稳，可以在120h时间内持续稳定地供给药物活性分子。

将90只结直肠癌荷瘤鼠随机分为6组，每组15只。其中，I、II组瘤周注射实施例3中制备的包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，瑞戈非尼剂量分别为200mg/kg和100mg/kg；III、IV组瘤周直接注射瑞戈非尼注射液，瑞戈非尼剂量分别为200mg/kg和100mg/kg；V组瘤周注射纳米多孔羟基磷灰石缓释微球，剂量为500mg/kg；VI组为空白组，不做任何处理。I、II、III、IV、V组分别在第0d、5d时注射给药，给药时均距肿瘤边缘5mm环绕肿瘤边缘进行注射。微球在注射前先用碘油悬溶，注射量为0.2ml。

于0d、5d、10d观察裸鼠生存状况，测量肿瘤大小。肿瘤体积计算公式：V＝(A×B

表2包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球对结直肠癌荷瘤鼠肿瘤生长的影响

由表2的实验结果可以看出，注射包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球在10d时间内能持续显著抑制结直肠癌荷瘤鼠肿瘤的生长，降低肿瘤体积和瘤重，且呈现剂量正相关性，剂量为200mg/kg的载药缓释微球的肿瘤抑制率可达到69.7％。与此相比，直接注射瑞戈非尼注射液的肿瘤抑制率较低，这与抑瘤作用时间短、药物活性成分被快速代谢直接相关。本发明实验结果证实，包覆瑞戈非尼的纳米多孔羟基磷灰石缓释微球瘤周注射缓释化疗对癌移植瘤具有可靠的治疗作用，具有重要的临床应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对技术方案做出若干修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。