一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法

技术领域

本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法。

背景技术

脂联素(Adiponectin，APN)亦称Acrp30、GBP28或AdipoQ，是一种由脂肪细胞合成和分泌细胞因子，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为3.0-30.0mg/L，约占血浆蛋白的0.01％。人类脂联素含244个氨基酸，包括3个区域：氨基末端信号序列、胶原结构域和羧基末端的球形结构域。脂联素以三聚体(65kb)、六聚体(150kb)和高分子量聚合体(18-36 个多体，>280kb)三种亚型存在于血液中。临床研究显示，脂联素与肥胖、II型糖尿病、冠心病、胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和血管损伤后抗内膜增生的特性。

脂联素的测定方法有多种，例如放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)(人脂联素ELISA试剂盒，CN102517256A)。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，操作时间长、自动化程度低。放射免疫法(RIA)灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。

发明内容

本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法，具有检测简单、灵敏度高、线性范围宽的特点。

本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法，包括R1试剂、R2试剂、脂联素质控品、脂联素校准品，其中：

所述R1试剂包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂；

所述的R2试剂包括偶联有脂联素抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂、电解质、防腐剂；

所述胶乳微球是含有聚苯乙烯的多聚物，表面含有羧基基团，粒径在70-200nm之间；

所述的脂联素质控品包括脂联素和质控品稀释液；

所述的脂联素校准品包括脂联素和校准品稀释液。

所述脂联素抗体通过化学交联的方法与6-氨基己酸柔性“手臂”链偶联到胶乳微球表面，所述化学交联的方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行，所述化学交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾一种或两种以上的混合物，所述交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，为2-(N- 吗啉代)乙磺酸MES、PB、HEPES、MOPSO缓冲液其中的一种，pH在6.0-8.0。

所述脂联素校准品是高浓度单点校准品，或者用校准品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的校准品，浓度为0-200mg/L。

所述脂联素质控品是高浓度单点质控品，或者用质控品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的质控品，浓度为10-100mg/L。

所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上的混合物，浓度在 0.5％-5％之间。

所述稳定剂选自酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、牛血清白蛋白中一种或两种以上的混合物，浓度在1‰-5‰。

所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚乙二醇醚、辛基苯基聚氧乙烯醚中一种或两种以上的混合物，浓度在0.5‰-3‰。

所述防腐剂选自叠氮钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin系列其中的一种，浓度在0.5‰-4‰。

所述缓冲液选自MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，浓度为10～500mmol/L，pH在5～9。

所述电解质为氯化钠，浓度为1％-4％。

所述稳定剂为牛血清白蛋白。

所述表面活性剂为辛基苯基聚氧乙烯醚。

制备方法包括如下步骤：

A)R1试剂的制备：取100ml且pH为7.2的100mmol/L磷酸缓冲液、加入1g氯化钠、4g牛血清白蛋白、0.2g辛基苯基聚氧乙烯醚，0.1g对羟基苯甲酸，充分混合；

B)R2试剂的制备：取1ml空白的胶乳微乳原液用MES缓冲液0.1M，pH5.0 4ml稀释，向上述溶液中加入1mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2ml，室温下搅拌反应15min后加入0.025M的6-氨基己酸溶液2ml，室温下搅拌反应1.25 ±0.25小时，离心去上清，沉淀用MES缓冲液(0.1M，pH5.0)稀释至8ml，向上述收集的溶液中加入1mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2ml，室温搅拌反应17.5±2.5min后加入1mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液2ml，室温下搅拌反应1.25±0.25h，然后离心去上清保留沉淀，然后用10ml硼酸缓冲液0.05M， pH8.0悬浮，超声200w，2s*15次，间隔4s，分散均匀，取10mg脂联素抗体，加入到复溶的胶乳微球，室温搅拌2h，离心，获得偶联抗脂联素抗体的胶乳微球，取偶联抗脂联素抗体的胶乳微球，加入40mL的100mmol/L的甘氨酸溶液、3％的氯化钠、1‰对羟基苯甲酸充分混合获得R2试剂；

C)脂联素质控品的制备：用质控品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的脂联素质控品，浓度为10-100mg/L；

D)脂联素校准品的制备：用校准品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的脂联素校准品，浓度为0-200mg/L。

本发明的有益效果：

本发明制备的试剂，灵敏度可达0.5mg/L，线性上限可达200mg/L，灵敏度和线性范围提升明显。

附图说明

图1为本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法的脂联素试剂现行范围示意图。

图2为本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法的脂联素相关性分析示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明

本发明提供的一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法，包括R1试剂、R2试剂、脂联素质控品、脂联素校准品，其中：

所述R1试剂包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂；

所述的R2试剂包括偶联有脂联素抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂、电解质、防腐剂，

所述胶乳微球是含有聚苯乙烯的多聚物，表面含有羧基基团，粒径在70-200nm之间；

所述的脂联素质控品包括脂联素和质控品稀释液；

所述的脂联素校准品包括脂联素和校准品稀释液。

优选的，所述脂联素抗体通过化学交联的方法与6-氨基己酸柔性“手臂”链偶联到胶乳微球表面，所述化学交联的方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行，所述化学交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾一种或两种以上的混合物，所述交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，为2-(N-吗啉代)乙磺酸MES、PB、HEPES、MOPSO缓冲液其中的一种，pH在6.0-8.0。

优选的，所述脂联素校准品是高浓度单点校准品，或者用校准品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的校准品，浓度为0-200mg/L。

优选的，所述脂联素质控品是高浓度单点质控品，或者用质控品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的质控品，浓度为10-100mg/L。

优选的，所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上的混合物，浓度在0.5％-5％之间。

优选的，所述稳定剂选自酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、牛血清白蛋白中一种或两种以上的混合物，浓度在1‰-5‰。

优选的，所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚乙二醇醚、辛基苯基聚氧乙烯醚中一种或两种以上的混合物，浓度在0.5‰-3‰。

优选的，所述防腐剂选自叠氮钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin系列其中的一种，浓度在0.5‰-4‰。

优选的，所述缓冲液选自MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，浓度为10～500mmol/L，pH在5～9。

优选的，所述电解质为氯化钠，浓度为1％-4％。

优选的，所述稳定剂为牛血清白蛋白。

优选的，所述表面活性剂为辛基苯基聚氧乙烯醚。

实施例1

A)R1试剂的制备：取100ml且pH为7.2的100mmol/L磷酸缓冲液、加入1g氯化钠、4g牛血清白蛋白、0.2g辛基苯基聚氧乙烯醚，0.1g对羟基苯甲酸，充分混合；

B)R2试剂的制备：取1ml空白的胶乳微球原液用MES缓冲液0.1M，pH5.0 4ml稀释，向上述溶液中加入1mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2ml，室温下搅拌反应15min后加入0.025M的6-氨基己酸溶液2ml，室温下搅拌反应1.25 ±0.25小时，离心去上清，沉淀用MES缓冲液0.1M，pH5.0稀释至8ml，向上述收集的溶液中加入1mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2ml，室温搅拌反应17.5±2.5min后加入1mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液2ml，室温下搅拌反应1.25±0.25h，然后离心去上清保留沉淀，然后用10ml硼酸缓冲液0.05M， pH8.0悬浮，超声200w，2s*15次，间隔4s，分散均匀，取10mg脂联素抗体，加入到复溶的胶乳微球，室温搅拌2h，离心，获得偶联抗脂联素抗体的胶乳微球，取偶联抗脂联素抗体的胶乳微球，加入40mL的100mmol/L的甘氨酸溶液、3％的氯化钠、1‰对羟基苯甲酸充分混合获得R2试剂；

C)脂联素质控品的制备：用质控品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的质控品，浓度为10-100mg/L；

D)脂联素校准品的制备：用校准品稀释液梯度稀释，直接制备出不同浓度的校准品，浓度为0-200mg/L。

实施例2

最低检出限(灵敏度)的检测

使用实施例1中制备的试剂，用企业自制的零浓度参考品作为样本进行检测，重复测定 20次，计算20次测量浓度值结果的平均值

表1实施例1制备试剂的最低检出限

实施例3

线性范围的检测

使用实施例1中制备的试剂，用零值参考品稀释液，稀释浓度为200mg/L的高浓度脂联素标准品，得到7个不同的稀释浓度x

表2实施例1制备试剂的线性范围的检测

实施例4

临床相关性分析

使用实施例1中制备的试剂，对127份血清(包括正常样本和异常样本)。对照试剂为国内某知名厂家脂联素免疫比浊试剂。按照各自的参数进行测试，对测定结果进行相关性分析。分析结果见图2，R值大于0.95，符合临床要求。

本发明的工作原理

本发明在胶乳微球表面引入6-氨基己酸进行修饰，首先在空白胶乳微球的表面通过碳化二亚胺(EDC)的作用下活化，在pH5.0MES缓冲体系中连接含有6个碳原子的氨基己酸柔性“手臂”链，该“手臂”的作用一方面在于消除或减小抗体连接到空白胶乳微球表面过程中产生的空间位阻效应，另一方面还在胶乳微球的表面保留了羧基基团，以便用于下一步连接脂联素抗体,本发明的试剂盒具有检测简单、灵敏度高、线性范围宽的特点。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。