基于一组肿瘤相关抗原的早期食管鳞癌筛查试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及FCRL1蛋白或其特异性抗体在贲门癌筛查中的应用。

背景技术

食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，具有显著的地域分布差异和家族聚集现象，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，全世界每年心法食管癌患者约50万例，一半以上发生在中国。在中国，半数患者发生在河南、河北和山西三省交界的太行山地区，其中河南临县是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区，比西方国家高百倍。食管癌是极具中国人特色的疾病，在中国，食管癌的病理类型主要为鳞状细胞癌，所占比例达到97％，与西方主要的病理类型(80％为腺癌)有极大的区别。此外，在流行特征、发病危险因素等方面与西方国家人群也存在着巨大的差异。

食管癌的预后较差，中晚期患者术后5年生存率仅为10％左右；而早期食管癌(病灶局限于粘膜层和粘膜下层，不伴有淋巴结转移)5年生存率可高达95％，由此可见，食管癌早期诊断和早期治疗是食管癌预后的重要影响因素。但是由于早期患者无特异性症状，患者就诊时大多数患者已经处于中晚期，早期食管癌检出率不足2％，使得中国食管癌高发区人群该病死亡率无明显改善。内镜筛查时发现食管早期癌的重要方法，国家在食管癌高发地区把“40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”笼统的界定为“高危或者高风险人群”，对这些人群通过色素内镜和粘膜活检行早期筛查。然而内镜检查有创、费用高，且早期癌检出率仅为2％，超过90％的无症状人群为陪伴检查，这些因素严重阻碍的了食管癌早期筛查懂得进步。同时寻找侵入性低、花费少的检查方法，提高食管癌早期筛查的效率是食管癌防治工作的重要趋势。

肿瘤标志物是在在恶性肿瘤发生和增殖过程中，有肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。其存在于病人的血液、体液、细胞或组织中，可用生物化学、免疫学及分子生物学等方法测定，且对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价具有一定的价值。理想的肿瘤标志物灵敏度高，特异性好，能够明确的区分肿瘤患者与非肿瘤患者；针对每一种肿瘤，具有组织器官特异性，能对肿瘤进行定位，能预测肿瘤的预后。在肿瘤标志物中研究发展最为迅速的是肿瘤相关抗原(tumour-associated antigens，TAAs)。肿瘤相关抗原能激起人体免疫系统产生免疫应答，从而引发大量与肿瘤相关抗原对应的自身抗体释放至血清中，且在癌症患者临床症状出现前3-5年肿瘤相关抗原的自身抗体即可被检测到，这一发现，使得利用血清学方法早期诊断肿瘤成为一种可能。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，利用自身抗体组织芯片筛选出4中TAA，分别为P53、ZBTB20、ERICH3和C15orf57，并且发现在食管粘膜鳞状上皮发生癌变之前就能够检测到上述6种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于食管鳞癌和癌前病变患者具有较高的特异度和敏感性。然而，目前并没有这些TAA联合用于早期食管鳞癌筛查的报道。因此，本研究联合利用筛选的4种TAA，开发一种具有高敏感度和特异性的用于早期食管鳞癌筛查的ELISA试剂盒。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的组合在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用；本发明的目的之二是提供一种用于早期食管鳞癌筛查的试剂盒；本发明的目的之三是提供肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的组合的检测试剂在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的组合在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过酶联免疫吸附法检测样本中P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的抗体的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清。

根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

本发明第二方面提供了一种用于早期食管鳞癌筛查的试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白组成。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒用于检测血清样本中P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白、C15orf57蛋白的自身抗体。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的硫酸；洗涤液为含0.2％吐温20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

根据上述的试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

根据上述的试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

根据上述的试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平均为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明P53抗原在食管鳞癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且P53抗体在食管鳞癌患者血清中具有较高的表达。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，P53抗体阴性血清作为阴性对照，阳性对照血清和阴性对照血清是经过精心筛选出来的血清，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述酶标板为96孔酶标板(共8行12列)，所述96孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图2)包被P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白这4种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于11个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入该96孔酶标板同一列的连续4个孔内(如第1列中的A-D孔、第1列中的E-H孔、第2列中的A-D孔、第2列中的E-H孔，以此类推)，该ELISA测试剂盒可同时用于检测22个待测血清样品中4种肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平，可进行大规模的样品检测。所述96孔酶标板第12列中设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

上述的应用是将肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白作为检测试剂，通过检测血清中五种肿瘤相关抗原的自身抗体来进行食管鳞癌的筛查。由于人体免疫系统可针对肿瘤相关抗原产生体液免疫应答，产生抗肿瘤相关抗原的自身抗体(简称肿瘤相关抗原自身抗体)，肿瘤相关抗原自身抗体释放至血液中，能够在血液中循环；而且，血液中肿瘤相关抗原自身抗体的浓度与其对应的肿瘤相关抗原的丰度成正比，较高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体指示肿瘤相关抗原的较高表达，因此，通过检测试剂来检测人体血清中肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的含量可以用来实现食管鳞癌的筛查和诊断。

本发明第三方面提供了一种肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的组合的检测试剂在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫组织化学、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附或蛋白芯片检测样本中肿瘤相关抗原P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为核酸或蛋白质。更加优选地，所述检测试剂为蛋白质。

根据上述的应用，优选地，所述蛋白质为与P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白相结合的特异性抗体。

本发明中四种肿瘤相关抗原的基本信息如下：

P53基因作为一种转录因子，是最早发现的抑癌基因之一，其所表达的P53蛋白在调节细胞凋亡的过程中起到了重要的作用，不同的研究均发现，P53突变与多种肿瘤的发生发展有关。ERICH3蛋白的表达与多种癌症(如神经胶质瘤和皮肤肉瘤)之间存在联系。有研究指出，ERICH3在复发的白血病中有特异性突变。有学者指出通路分析显示，ERICH3突变可引起药物靶点的改变或通过细胞膜影响药物的摄入，这种耐药相关通路突变可能影响肿瘤患者的生存。ZBTB20蛋白在很多方面如肿瘤和淋巴谱系分化上起转录抑制的作用，近年来的研究表明，多种免疫细胞中检测到ZBTB20蛋白的表达，参与机体的免疫调节作用。ZBTB20蛋白表达于多种免疫细胞，如单核细胞、DC细胞、T细胞和B细胞等，说明其可能参与固有免疫和适应性免疫的调节作用。C15orf57蛋白又名CCDC32蛋白，是CCDC家族的一员，有研究报道CCDC家族蛋白可参与细胞内的信号传导、遗传信号转录、分子识别及细胞周期调控、细胞分化、凋亡等生物学过程；近年来，关于CCDC家族蛋白在恶性肿瘤组织及肿瘤细胞系中的表达，逐步得到了人们广泛的关注，有研究表明CCDC蛋白的表达异常可通过调节细胞骨架的重排，激活细胞内信号磷脂酶C与丝裂原活化蛋白没的活化，从而促进肿瘤细胞的运动与迁移。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白这4种TAA作为一个组合，联合检测人血清中上述4种TAA的抗体表达水平，可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌，其检测灵敏度高达82％(即早期食管鳞癌患者中应用这4种肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管鳞癌的比率为82％)，特异度(特异度又称真阴性率，即实际无病按该诊断标准被正确的判为无病的百分比，较高的特异度意味着较低的误诊率)达到了84％(即非食管鳞癌患者用这4种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管鳞癌者的比率为84％)。

因此，本发明试剂盒通过将P53蛋白、ZBTB20蛋白、ERICH3蛋白和C15orf57蛋白进行组合使用，在保证检测灵敏度的基础上，极大地提高了检测的特异度，保证低漏诊率的同时大大降低了误诊率，在最大程度上筛查出早期食管鳞癌，又能极好地避免误诊给病人带来身心痛苦、给国家带来医疗资源的浪费，为有效判断早期食管鳞癌提供了更加精准、平衡性强的科学依据。

(2)本发明的试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管鳞癌的检出率，可用于食管鳞癌高发区无症状人群的大规模筛查，而且，本发明试剂盒对食管鳞癌的检出率远高于现有临床内镜筛查贲门腺癌的检出率，有利于无症状食管鳞癌高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明制备的试剂盒可同时检测血清样品中4种TAA抗体的表达水平，与4种TAA抗体的单独检测相比，4种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床食管鳞癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用，有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明试剂盒中96孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)；

图2为4种TAA自身抗体在食管鳞癌血清中的分布图；

图3为4种TAA自身抗体在对照组血清中的分布图；

图4为4种TAA自身抗体在食管癌组和对照组中的阳性率结果图；

图5为4种TAA自身抗体检测食管鳞癌的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于早期食管鳞癌筛查和诊断的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

1、实验材料及试剂：

(1)4种肿瘤相关抗原蛋白(P53、ZBTB20、ERICH3和C15orf57)，购买于武汉艾美捷科技有限公司；

(2)96孔酶标板：3590(costar.美国)；

(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(8)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清；

(10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲素，配制：取柠檬酸4.665g、Na2HPO418.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：2mol/L的硫酸；

(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备4种肿瘤相关抗原溶液：

将4种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成浓度均为0.5μg/μL的4种抗原溶液。

(2)包被酶标板：

将制备好的4种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：

向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥，包装：

将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的96孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)步骤2制备的抗原包被的96孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：2mol/L的硫酸；

(7)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成试剂盒。

实施例2：试剂盒的使用方法

1.血清样本孵育：

将待检测的血清样本用样品稀释液按1：500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

2.酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：40000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育50min，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

3.显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止反应，于20分钟内用酶标仪器读取OD450光密度值，并用空白对照孔调零。

4.试剂盒检测结果判定：

以阴性对照孔所测OD值的平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

实施例3：本发明试剂盒的诊断价值分析

本实施例采用实施例1制备的试剂盒按照实施例2所述的使用方法检测早期食管鳞癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期食管鳞癌筛查和诊断的价值。

1.样本来源

收集来自郑州大学第一附属医院食管癌防治国家重点实验室200份血清样本，其中正常人血清100份(对照组)，早期食管鳞癌患者血清100份(食管鳞癌组)。100例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。100例正常人中，男性61例，女性39例，平均年龄58.9±6.3岁，年龄范围40-70岁。100份早期食管鳞癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管鳞癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。100例食管鳞癌患者中，男性57例，女性43例，平均年龄58.5±7.0岁，年龄范围45-75岁。所有受试者按性别，年龄和临床分期匹配随机分组。

血清制备：抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

2.实验方法

采用本发明实施例1制备的试剂盒和实施例2所述试剂盒的使用方法对100例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)和100例正常人血清(对照组)中4种肿瘤相关抗原自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制4种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图2和图3)

以实施例2步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算食管鳞癌组和对照组中4种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并应用Excel软件绘制4种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管鳞癌组和对照组中阳性率的柱形图(结果见图4)。应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较食管鳞癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测食管鳞癌的诊断价值(结果参见表2和图5)。

同时，为了与本发明试剂盒的诊断效果作对比，发明人还制备了不同抗原组合的对比试剂盒。对比试剂盒的制作过程与实施例1基本相同，其不同之处在于：对比试剂盒固相载体——酶标板上包被的肿瘤抗原组合不同；其中，第一种对比试剂盒酶标板点样孔上包被的肿瘤相关抗原仅有ERICH3；第二种对比试剂盒酶标板点样孔上包被的肿瘤相关抗原为ERICH3和C15orf57(ERICH3和C15orf57分别包被不同的点样孔)；第三种对比试剂盒酶标板点样孔上包被的肿瘤相关抗原为ERICH3、C15orf57和P53(ERICH3、C15orf57和P53分别包被不同的点样孔)。

3.结果分析

图2为4种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，4种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组中平均表达水平较高平均OD值在0.5附近浮动。图3为4种肿瘤相关抗原自身抗体在150例对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，这4种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值在0.08附近浮动。由2和图3可知，食管鳞癌组患者血清中4种TAA自身抗体的平均水平均明显高于对照组，说明4种TAA自身抗体可以用于食管鳞癌的诊断。

图4为4种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和对照组中的阳性率结果图，由图4可知，早期食管鳞癌组患者血清中P53、ZBTB20、ERICH3和C15orf57这4种TAA自身抗体的阳性表达率在35％-54％的范围内，而在对照组中4种TAA自身抗体的阳性表达率仅为3％-6％。而且，经统计学检验，这4种TAA自身抗体在食管鳞癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明，这4种TAA自身抗体可以作为食管鳞癌早期诊断的检测指标，用于食管鳞癌的早期诊断。

表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合试剂盒的检测结果

由表1知，随着抗原组合数目的增加，早期食管鳞癌诊断的灵敏度也随之增加；当4种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度高达82％，也就是说食管鳞癌患者中应用该方法能够正确的诊断为食管鳞癌的比率为82％；虽然随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当4种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到84％，这一结果表明非食管鳞癌患者采用4种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患食管鳞癌的百分比为84％；因此，使用P53、ZBTB20、ERICH3和C15orf57这4种肿瘤相关抗原组合进行早期食管鳞癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明4种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期食管鳞癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用P53、ZBTB20、ERICH3和C15orf57这4种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患食管鳞癌的风险具有很好的诊断和应用价值，是较为理想的早期食管鳞癌的筛查方法和手段。

图5为4种肿瘤相关抗原自身抗体检测食管鳞癌的ROC曲线图。由图5可知，采用单一TAA检测时，ROC曲线下面积均较低，最高仅有0.75(ERICH3)；2种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积为0.79，3种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积为0.81，4种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积达到了最大，为0.83。由此说明，使用本发明ELISA试剂盒对于食管癌具有较高的判定正确性和较高的诊断价值，进一步证实了本发明ELISA试剂盒是较为理想的食管癌早期诊断和筛查方法和手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。