产生一氧化氮的四氧化三铁磁性纳米材料、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种产生一氧化氮的四氧化三铁磁性纳米材料、制备方法及应用。

背景技术

氧化铁磁性纳米颗粒介导的磁热肿瘤治疗具有良好的临床应用前景，通过再体外交变磁场作用有效靶向定位肿瘤组织，局部升温后，肿瘤细胞和正常细胞热敏感不同，利用生物热效应，诱导肿瘤细胞的杀伤。撤去外磁场后，磁性纳米颗粒可通过血液循环被内皮网状系统所清除。该疗法在大量的前期临床试验中显示了良好的疗效及较低的副作用，被国际医学界定义为新兴的“绿色疗法”。但是其有效性很大程度取决于氧化铁纳米颗粒在肿瘤部位的聚集浓度和深度。目前被动的EPR效应聚集的纳米粒效率很低，且达到肿瘤深部的纳米粒更少，极大减弱了氧化铁磁性纳米颗粒介导的磁热肿瘤治疗效果。肿瘤内部无序非正常结构的新生血管不利于纳米颗粒的深入递送和积累。如董洪明，吴琳，沈松，两种粒径磁性Fe

发明内容

本发明提供一种可在肿瘤微环境响应条件下产生一氧化氮的四氧化三铁磁性纳米材料、制备方法及应用。

本发明采用的技术方案是：一种产生一氧化氮的四氧化三铁磁性纳米材料，纳米材料包括四氧化三铁内核，四氧化三铁内核表面连接带有氨基的第一反应基团；第一反应基团连接一个或两个精氨酸；精氨酸表面连接催化剂；催化剂可催化肿瘤细胞内过量小分子产生过氧化氢。

进一步的，所述第一反应基团为3-(3,4-二羟基苯基)丙酸和多巴胺中的一种。

进一步的，所述催化剂为葡萄糖氧化酶、β-拉帕酮中的一种及以上以任意比例构成的混合物。

进一步的，所述第一反应基团通过肿瘤微环境响应的化学键连接氨基；化学键为二硫键、二硒键、酸敏感的缩醛键、缩酮键、腙键、原酸酯键中的一种及以上。

进一步的，所述精氨酸为L型精氨酸。

纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：在四氧化三铁表面连接带有氨基的第一反应基团，得到表面氨基化的四氧化三铁；

步骤2：第一反应基团连接一个精氨酸；

步骤3：在表面连接精氨酸的材料表面连接催化剂，即可得到所需纳米材料。

纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：在四氧化三铁表面连接带有氨基的第一反应基团，得到表面氨基化的四氧化三铁；

步骤2：制备双保护精氨酸；

步骤3：采用步骤2中的精氨酸制备双精氨酸脱甲酯；

步骤4：采用步骤1得到的表面氨基化的四氧化三铁和步骤3得到的双精氨酸脱甲酯得到表面氨基化四氧化三铁连接两个精氨酸；

步骤5：在步骤4得到的材料表面连接催化剂，即可得到所需纳米材料。

纳米材料的应用，所述纳米材料在制备肿瘤治疗辅助制剂中的用途。

本发明的有益效果是：

本发明通过催化剂可催化肿瘤细胞内过量小分子(葡萄糖、NADPH等)产生过氧化氢，过氧化氢与分布在四氧化三铁内核表面的L型精氨酸反应生成一氧化氮，从而提高肿瘤部位一氧化氮的浓度，增加肿瘤部位血管舒张，促进肿瘤血管的正常化，增强纳米颗粒在肿瘤部位的递送和积累，进而增强肿瘤磁热治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中表面氨基化的四氧化三铁制备示意图。

图2为本发明实施例1中第一反应基团连接精氨酸的制备示意图。

图3为本发明实施例2中双保护精氨酸的制备示意图。

图4为本发明实施例2中双精氨酸脱甲酯的制备示意图。

图5为本发明实施例2中四氧化三铁连接两个精氨酸的制备示意图。

图6为本发明实施例3中第一反应基团中巯基化的制备示意图。

图7为本发明实施例3中巯基化的四氧化三铁纳米粒子连接精氨酸的制备示意图。

图8为本发明实施例3中连接催化剂的制备示意图。

图9为本发明实施例4中第一反应基团中硒基化的制备示意图。

图10为本发明实施例4中双保护精氨酸的制备示意图。

图11为本发明实施例4中双精氨酸脱甲酯的制备示意图。

图12为本发明实施例4中硒基化的四氧化三铁纳米粒子连接两个精氨酸的制备示意图。

图13为本发明实施例4中连接催化剂的制备示意图。

图14为实施例1为得到的纳米材料注射建立的小鼠乳腺癌原位肿瘤模型得到的磁共振显影结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种产生一氧化氮的四氧化三铁磁性纳米材料，纳米材料包括四氧化三铁内核，四氧化三铁内核表面连接带有氨基的第一反应基团；第一反应基团连接一个或两个L型精氨酸；精氨酸表面连接催化剂；催化剂可催化肿瘤细胞内过量小分子产生过氧化氢。第一反应基团为3-(3,4-二羟基苯基)丙酸(DPA)和多巴胺DA中的一种(通过第一反应基团提供氨基)。催化剂为葡萄糖氧化酶、β-拉帕酮中的一种及以上以任意比例构成的混合物。第一反应基团通过肿瘤微环境响应的化学键连接氨基；化学键为二硫键、二硒键、酸敏感的缩醛键、缩酮键、腙键、原酸酯键中的一种及以上。肿瘤细胞内过量小分子为葡萄糖、NADPH等。

下面通过具体实施例对制备方法进行进一步说明。

实施例1

表面带一个L型精氨酸和葡萄糖氧化酶修饰的磁性纳米材料(Fe-Arg-GOX)的制备方法包括以下步骤：

步骤1：在四氧化三铁表面连接带有氨基的第一反应基团，得到表面氨基化的四氧化三铁(Fe-NH

过程如图1所示，将50mg的Fe

过程如图2所示，将50mg表面氨基化的四氧化三铁(Fe-NH

将30mg Fe-Arg分散在纯水中，然后分别加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、100mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mg的葡萄糖氧化酶，在机械搅拌下反应24h，然后通过磁分离的方法分离出修饰上葡萄糖氧化酶的Fe-Arg 50mg，命名为Fe-Arg-GOX。

图14为本实施例得到的纳米材料注射建立的小鼠乳腺癌原位肿瘤模型得到的磁共振显影结果示意图。

首先建立小鼠乳腺癌原位肿瘤模型，尾部静脉注射含Fe

实施例2

表面带两个L型精氨酸和葡萄糖氧化酶修饰的磁性纳米材料的制备方法包括以下步骤：

步骤1：在四氧化三铁表面连接带有氨基的第一反应基团，得到表面氨基化的四氧化三铁(Fe-NH

步骤2：制备双保护精氨酸(Dual-BOC-Arg(Pbf)-OMe)；

过程如图3所示，称取L-赖氨酸甲酯盐酸(H-Lys-OMe.2HCl)1.00g(4.3mmol，1eq)溶于20mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。充分搅拌后将1.67g(12.9mmol，3.0eq)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)加入L-赖氨酸甲酯盐酸盐溶液中。

将5.00g(9.5mmol,2.2eq)化合物Boc-Arg(Pbf)-OH溶于20mL DMF中，充分溶解后，与上述L-赖氨酸甲酯盐酸盐溶液混合搅拌。称取4.14g(12.9mmol,3eq)O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)溶于20mL DMF，充分溶解后，再加入到上述混合溶液中。

氮气保护下，30℃反应过夜。反应结束后，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入200mL二氯甲烷(DCM)重新溶解。有机相分别依次用饱和NaHCO

步骤3：采用步骤2中的精氨酸制备双精氨酸脱甲酯(Dual-BOC-Arg(Pbf))；

过程如图4所示，将3.00g(2.5mmol)双保护精氨酸(Dual-BOC-Arg(Pbf)-OMe)溶于10mL甲醇，称取0.6g NaOH固体溶于5mL去离子水中并将其缓慢滴加入双精氨酸的甲醇溶液中。称取0.6g NaOH终浓度为1M。30℃反应过夜，反应结束后，先用旋转蒸发仪除去有机相，然后再重新分散在去离子水中，用浓度为1M的HCl缓慢调节溶液pH至2～3，搅拌2min后，用DCM萃取并收集有机相。有机相经无水硫酸镁干燥后，用旋转蒸发仪除去有机相，得脱甲酯的双精氨酸(Dual-BOC-Arg(Pbf))。

步骤4：采用步骤1得到的表面氨基化的四氧化三铁和步骤3得到的双精氨酸脱甲酯得到表面氨基化四氧化三铁连接两个精氨酸(Fe-dual-Arg)。

过程如图5所示，将50mg表面氨基化的Fe-NH

干燥完成后将干燥的产品分散在10mL的DCM中，在机械缓慢搅拌下慢慢滴加5mL的三氟乙酸TFA，继续搅拌24h，反应完成后用磁分离除去上清液。再用DCM洗涤3次后真空干燥12h，得到94mg产物Fe-dual-Arg。

步骤5：在步骤4得到的材料表面连接催化剂(葡萄糖氧化酶)，即可得到所需纳米材料(Fe-dual-Arg-GOX)。

将30mg的Fe-dual-Arg分散在超纯水中，然后分别加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、100mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mg的葡萄糖氧化酶。在机械搅拌下反应24h，然后通过磁分离的方法分离出修饰上葡萄糖氧化酶的Fe-dual-Arg55mg，命名为Fe-dual-Arg-GOX。

实施例3

表面通过二硫键连接一个L型精氨酸和β-拉帕酮修饰的磁性纳米材料的制备方法包括以下步骤：

步骤1：表面带羧基四氧化三铁的巯基化(Fe-SS)。

将50mg的Fe

过程如图6所示，将得到的表面带羧基的四氧化三铁(Fe-COOH)50mg分散在DMF中，并加入300mg的O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，300mg的DIEA和500mg的胱胺(DD)，氮气保护下，机械搅拌反应24h。反应完成后，磁分离去除DMF，得到的沉淀用DMF反复洗涤3次，真空干燥12h，得到表面巯基化的四氧化三铁(Fe-SS)61mg。

步骤2：巯基化四氧化三铁接一个精氨酸(Fe-SS-Arg)的制备

过程如图7所示，将40mg表面巯基化的四氧化三铁(Fe-SS)分散在DMF中，将500mg化合物Boc-Arg(Pbf)-OH，800mg的TBTU和800mg的DIEA加入到分散好的Fe-SS中，常温条件下搅拌24h，然后用磁分离除去上清液，用DMF洗涤3次，真空干燥12h。

干燥完成后将干燥的产品分散在10mL的DCM中，在机械缓慢搅拌下慢慢滴加5mL的三氟乙酸(TFA)，继续搅拌24h，反应完成后用磁分离除去上清液，再用DCM洗涤3次后真空干燥12h，得到黑色产物Fe-SS-Arg 51mg。

步骤3：表面通过二硫键连接一个L型精氨酸和β-拉帕酮修饰的磁性纳米材料的制备(Fe-SS-Arg-Lap)。

过程如图8所示。将30mg Fe-SS-Arg分散在无水干燥的甲醇中，然后将200mg的β-拉帕酮(β-Lap)加入到分散好的Fe-SS-Arg溶液中，氮气保护下，常温反应48h，反应完成后，采用磁分离的方式反复洗涤3次，最后进行磁分离收集沉淀，最后将沉淀进行真空干燥得到产物Fe-SS-Arg-Lap 40mg。实施例4

表面通过二烯键连接两个L型精氨酸和β-拉帕酮修饰的磁性纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：表面带羧基四氧化三铁的硒基化(Fe-SeSe)

将50mg Fe

过程如图9所示，将得到的表面带羧基的四氧化三铁(Fe-COOH)50mg分散在DMF中，并加入300mg O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，300mg DIEA和500mg二硒胱胺(DeDe)，氮气保护下，机械搅拌反应24h。反应完成后，磁分离去除DMF，得到的沉淀用DMF反复洗涤3次，真空干燥12h，得到表面硒基化的四氧化三铁(Fe-SeSe)59mg。步骤2：双保护精氨酸(Dual-BOC-Arg(Pbf)-OMe)的合成

过程如图10所示，称取L-型赖氨酸甲酯盐酸(H-Lys-OMe.2HCl)1.00g(4.3mmol，1eq)溶于20mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。充分搅拌后将1.67g(12.9mmol，3.0eq)N，N-二异丙基乙胺(DIEA)加入L-赖氨酸甲酯盐酸溶液中。将5.00g(9.5mmol，2.2eq)化合物Boc-Arg(Pbf)-OH溶于20mL DMF中，充分溶解后，与上述L-赖氨酸甲酯盐酸溶液混合搅拌。

称取4.14g(12.9mmol，3eq)O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)溶于20mLDMF，充分溶解后，再加入到上述混合溶液中。氮气保护下，30℃反应过夜。反应结束后，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入200mL二氯甲烷(DCM)重新溶解。有机相分别依次用饱和NaHCO

步骤3：双精氨酸脱甲酯(Dual-BOC-Arg(Pbf))的合成。

过程如图11所示，将3.00g(2.5mmol)双保护精氨酸(Dual-BOC-Arg(Pbf)-OMe)溶于10mL甲醇，称取0.6g NaOH固体溶于5mL去离子水中并将其缓慢滴加入双精氨酸的甲醇溶液中，NaOH终浓度为1M，30℃反应过夜。反应结束后，先用旋转蒸发仪除去有机相，然后再重新分散在去离子水中，用浓度为1M的HCl缓慢调节溶液pH至2～3，搅拌2min后，用DCM萃取并收集有机相。有机相经无水硫酸镁干燥后，用旋转蒸发仪除去有机相，得脱甲酯后的双精氨酸Dual-BOC-Arg(Pbf)。

步骤4：硒基化四氧化三铁接两个精氨酸(Fe-SeSe-dual-Arg)的制备

过程如图12所示，将40mg表面硒基化的四氧化三铁(Fe-SeSe)分散在DMF中，将化合物500mg的Dual-BOC-Arg(Pbf)900mg TBTU和900mg DIEA加入到分散好的Fe-SeSe中，常温条件下搅拌24h，然后用磁分离除去上清液，用DMF洗涤3次，真空干燥12h。

干燥完成后将干燥的产品分散在10mL的DCM中，在机械缓慢搅拌下慢慢滴加5mL的三氟乙酸TFA中，继续搅拌24h，反应完成后用磁分离除去上清液，再用DCM洗涤3次后真空干燥12h，得到产物Fe-SeSe-dual-Arg 57mg。

步骤5：表面连接两个L-精氨酸的巯基化四氧化三铁和β-拉帕酮修饰的磁性纳米材料的制备(Fe-SeSe-dual-Arg-Lap)。

过程如图13所示，将30mg Fe-SeSe-dual-Arg分散在无水干燥的甲醇中，然后将200mgβ-拉帕酮(β-Lap)加入到分散好的Fe-SeSe-dual-Arg溶液中，氮气保护下，常温反应48h，反应完成后，采用磁分离的方式反复洗涤3次，最后进行磁分离收集沉淀，最后将沉淀进行真空干燥得到产物Fe-SeSe-dual-Arg-Lap 51mg。本发明精氨酸表面连接的催化剂可催化肿瘤细胞内过量小分子产生过氧化氢，过氧化氢与精氨酸可以生成一氧化氮。一氧化氮的释放的增强可促使肿瘤血管周细胞覆盖和血管关注，减少缺氧从而促进血管正常化，进而增强纳米颗粒在肿瘤部位的递送和积累，增强肿瘤磁热治疗效果。