与地中海水牛优良泌乳性状相关的分子标记与应用

技术领域

本发明属于水牛分子标记筛选和辅助选择技术领域。具体涉及与地中海水牛优良泌乳性状相关的SNP标记及其单倍型组合与应用。

背景技术

水牛是世界第二大产奶家畜，占全球牛奶总产量的12％(Zicarelli 2020)。水牛奶营养价值丰富，所含总蛋白、中链脂肪酸、共轭亚油酸、视黄醇和维生素E含量均高于荷斯坦奶牛乳，是加工生产多种高档乳制品的优质原料，如奶酪、酸奶和奶油等(Mahmood andSumaira 2010)。因此，近二十年内，水牛业受到了越来越多的国家重视，水牛存栏量以每年2％的速度增长(Ahmad et al 2013)。

国内外水牛品种丰富，但目前尚无专门化泌乳品种/品系，即便是平均单产水平较高的摩拉、尼里-拉菲、地中海水牛等品种，其平均产奶量也仅为荷斯坦奶牛的1/5-1/8，从而导致水牛养殖经济效益低下(Jiang et al 2010)。因此，改良水牛产奶性状，培育高产奶量和奶品质的专门化水牛品种/系，对于水牛产业发展极为重要。由于缺乏结构合理的参考群体，水牛全基因组选择技术尚未建立，分子标记辅助选择对现阶段水牛遗传改良仍具有重要意义。

载脂蛋白B(ApoB)属于载脂蛋白家族，是构成脂蛋白的主要成分，能修饰和稳定脂蛋白结构且调节脂蛋白和胆固醇代谢，同时作为配体与脂蛋白和细胞表面脂蛋白受体结合(Deng et al 2020)。本发明将在地中海水牛群体中分析ApoB基因多态性，并与泌乳性状进行关联分析，以期筛选水牛的泌乳性状相关的分子标记，为水牛产奶性状分子标记辅助选择提供技术支撑。

发明内容

本发明的第一个目的是提供多个地中海水牛泌乳性状相关基因ApoB SNP。

本发明的第二个目是提供与地中海水牛泌乳性状关联的单倍型模块。

本发明的第三个目的是提供ApoB基因与地中海水牛产奶性状相关的SNP及单倍型的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先提供克隆自ApoB基因的单独使用或组合使用的与水牛泌乳性性状相关的SNP标记，所述的SNP标记选自SNP1～6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示。

所述的SNP标记的核苷酸序列如下：

(1)SEQ ID NO:1(g.-1718A>G)

GAGAGCCTTGGGCAAAGTTTCCTGTGGGCAAAGTTTCCTGTGGGACATGGACAGGACCTAGAGAGGAAGGGACGGATTCATGGAGAAGGTTCTGGGATGT[A/G]TTAGGAGAAATATTCTGCGTCCACCCACTACTCCACTTCTCCTCACTGGCCTCCCCTGTCCCTGAGGAAACCCAAAGGCAGTTCCTATAGAGAAAAGCCT

上述序列中第101位处的碱基是A或G，导致ApoB基因的多态性。

(2)SEQ ID NO:2(g.-1823G>C)

GAGAAATATTCTGCGTCCACCCACTACTCCACTTCTCCTCACTGGCCTCCCCTGTCCCTGAGGAAACCCAAAGGCAGTTCCTATAGAGAAAAGCCTCCTC[G/C]TCTCAACTTCCCAAGAAGAAATTGGACCTTTGGGGTGGGCAGAGGAGAACAGGGAGGAAGTTTGCCTTTTCCAAAGGCCCCTCCTCACTGGGGCTTCCAC

上述序列中第101位处的碱基是G或C，导致ApoB基因的多态性。

(3)SEQ ID NO:3(g.-2063A>C)

GGTCCCTCGGGTCAAGAAGGGGTCAGTCCCTCTCCAGACCCCTCTCTCCTTCTCTTCTCTCTCGGCTTCCTCCAGATGGACTGAGTCCAGGGCAGGTGAC[A/C]CAGAGCCTTGGGTACTGATCTGGGTTAGAGGCCCCTAGGCAACCTCAAAGTCCACCAGGTAAGAAGGAAGTGGGGGTCGGGGCGAAGGTCTTCACCTAGA

上述序列中第101位处的碱基是C或A，导致ApoB基因的多态性。

(4)SEQ ID NO:4(g.5903G>A)

AGCAAGTTCTACTTTATCCAGAGAAAGAAGAGCCTAAACACATCCTCAACATCAAGAGGGGCATCATCTCTGCCCTCCTGCTTCCCCCAGAAACGGAAGA[G/A]GCTAAGCAAGTGTTATTTCTGGTGAGAATTTTAAAAGCTGGTAATAGTGGTCCTTTGAACTCCTCTTCATATAGTGGAGCTGGGTTCCACTTATACATCA

上述序列中第101位处的碱基是G或A，导致ApoB基因的多态性。

(5)SEQ ID NO:5(g.37375G>A)

ATATACCAAAAACCCCAATGGTTATCTTGTTTCTATCCCCGTGCAAGAATTGAATGATAAATTCATTATTCCTGGACTGAAACGAAATAATCAAAATTCC[G/A]TTCATGTCACACCTACATTCCAAGTCCCCTTTACAGATCTTCAGGTTCCATCCTACACACTTGACCTTAGTGAAATAAAAATCTACAAGAAGCTAAGTAC

上述序列中第101位处的碱基是G或A，导致ApoB基因的多态性。

(6)SEQ ID NO:6(g.40787A>G)

ATACTGTTTTCCTATTTACTATACCTGATGGAGGAGTCTGAGTTATACAAGGACCTAAACAATAAATTTTCTTTTACATCAATGTGCAATCAACTAATAG[A/G]TATGGTCTTGGAGTGTATGAAAACGTTTCTATTTTTCTCACAAGAGATCCAAAAGGCACTTAGTTACCTCCAATCTACCATGATGACAGAGATGCTAAGT

上述序列中第101位处的碱基是G或A，导致ApoB基因的多态性。

进一步本发明提供用于检测上述SNP标记的DNA引物。具体地，所述引物的DNA序列如下：

1)检测突变位点R1(g.-1718A>G)、R2(g.-1823G>C)、R3(g.-2063A>C)的引物序列：

SEQ ID NO:7F：5'CTGCGTCCACCCACTACTC 3'

SEQ ID NO:8R：5'TCCCTCCCGCCTGCTGTCTA 3'

2)检测突变位点R4(g.5903G>A)的引物序列：

SEQ ID NO:9F：5'CCTCGGTGACCATACTCT 3'

SEQ ID NO:10R：5'GCAATGCTGATGTGAAAC 3'

3)检测突变位点R5(g.37375G>A)的引物序列：

SEQ ID NO:11F：5'AATGGTTATCTTGTTTCTATC 3'

SEQ ID NO:12R：5'AAAGAAATACATCCTGGG 3'

4)检测突变位点R6(g.40787A>G)的引物序列：

SEQ ID NO:13F：5'CGTCCTTTTCTGCTGGTC 3'

SEQ ID NO:14R：5'AGAGCCTGCACGTACTGA 3'。

进一步，本发明提供含有上述引物的检测试剂盒。其还可以包含用于DNA扩增相关的试剂。

进一步，本发明还提供所述的SNP标记或所述的引物或所述的试剂盒在水牛泌乳性状辅助选择或水牛泌乳性状辅助育种中的应用。

具体地，检测所述SNP标记，选择水牛泌乳性状优势基因型，其中，SNP1选择AA基因型，SNP2选择GG基因型，SNP3选择AA基因型，SNP4选择GG基因型，SNP5选择GG基因型，或SNP6选择GG基因型。

本发明还进一步筛选得到优势单倍型模块组合。具体地，得到以SNP1、SNP2和SNP3组成的单倍型模块1，其与地中海水牛泌乳性状性相关的优势单倍型组合H2H2，该单倍型组合的DNA序列为AGA/AGA；以及得到SNP5和SNP6组成单倍型模块2，其与地中海水牛泌乳性状性相关的优势单倍型组合H2H2，该单倍型组合的DNA序列为GG/GG。

本发明还提供一种水牛泌乳性状辅助育种方法，该方法通过检测所述的SNP标记选择优势基因型用于辅助育种。

本发明还提供一种筛选地中海水牛泌乳性状相关分子标记的方法，包括下列步骤：

(1)从NCBI上查找水牛ApoB基因核苷酸序列

(2)设计引物对50头水牛DNA混合池样本进行PCR扩增

(3)扩增产物进行测序

(4)利用chromes软件观察测序结果，筛选出6个ApoB基因的SNP位点

(5)根据测序结果，选择初步筛选得到的6个SNPs位点，用Sequenom SNP分型检测技术对350头地中海水牛群体进行SNP基因分型。

(6)将6个SNP位点与地中海水牛6个泌乳性状(高峰奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d泌乳量、乳脂量、乳蛋白量)进行关联分析。

(7)用Haploview软件对6个SNP位点进行单倍型分析，检测到2个单倍型模块。

(8)利用Phase软件将上述连锁的单倍型Block与350头地中海水牛个体对应，得到不同的单倍型组合。

(9)将单倍型组合进一步与6项地中海水牛产奶性状关联分析。

本发明SNP标记与水牛产奶性状紧密关联，通过检测分子标记可以快速确定被检对象的产奶性状，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。

附图说明

图1是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP1(g.-1718A>G)位点；

图2是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP2(g.-1823G>C)位点；

图3是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP3(g.-2063A>C)位点；

图4是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP4(g.5903G>A)位点；

图5是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP5(g.-434C>T)位点；

图6是ApoB基因质谱分型的检测结果，其为ApoB_SNP6(g.40787A>G)位点；

图7是ApoB基因SNP位点连锁不平衡分析。

具体实施方式

实施例1：地中海水牛泌乳性状关联的ApoB_SNP1至ApoB_SNP6标记的鉴定及检测ApoB_SNP1至ApoB_SNP6位点上基因型的引物设计

1.试验对象

试验选择350头地中海水牛，其DNA样本来自意大利牧场；所有泌乳记录由意大利育种协会(AIA)和意大利农业研究委员会(CAR)提供。

2.引物设计

根据GenBank中水牛ApoB基因序列(登录号:NC_037556.1)为模板，利用Primer5.0引物设计软件，分别设计如SEQ ID NO：7-14片段所示的引物对，并委托北京擎科生物科技有限公司(武汉)合成。

3.PCR扩增反应

以地中海水牛基因组DNA为模板，按如下程序进行PCR扩增反应：PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

表1PCR反应体系

表2PCR反应条件

4.PCR产物测序

将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定，北京擎科生物科技有限公司(武汉)完成。经Blast比对分析，发现ApoB基因上存在6个SNP标记，分别是ApoB_SNP1为g.-1718A>G，ApoB_SNP2为g.-1823G>C，ApoB_SNP3为g.-2063A>C，ApoB_SNP4为g.5903G>A，ApoB_SNP5为g.37375G>A，ApoB_SNP6为g.40787A>G。这些突变引起ApoB基因的多态性。本发明在水牛ApoB基因中共找出6个SNP位点，ApoB_SNP1、ApoB_SNP2、ApoB_SNP3位于启动子区，ApoB_SNP4位于第5外显子区，ApoB_SNP5位于第26外显子区，ApoB_SNP6位于第29外显子区。

上述检测所得的6个SNP标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。

检测所得的6个SNP标记ApoB_SNP1-6突变位点的引物的DNA序列如序列表SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:14所示。

实施例2：ApoB_SNP1至ApoB_SNP6标记在地中海水牛泌乳性状的关联分析中的应用

为了确定检出的ApoB_SNP1至ApoB_SNP6标记与地中海水牛泌乳表型差异是否相关，本实施例选择地中海水牛(350头)为试验材料。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行多态性检测，并分析不同基因型与水牛泌乳性状的相关性。采用SAS9.4软件中的一般线性模型进行基因型和表型值之间的关联分析，SNPs与单倍型关联分析模型相同，分析模型为：Y

对地中海水牛ApoB基因突变位点多态性检测，用Sequenom SNP分型检测技术对350头地中海水牛群体进行SNP基因分型，结果发现每个位点均检测到三种基因型。本发明对上述筛选的6个突变位点进行群体遗传信息分析，多态信息含量显示6个SNP位点PIC含量在0.25-0.5，属于中度多态，表明这些多态信息含量较高，遗传变异较大，具有更大的选择潜力。

表3ApoB基因6个SNPs位点在地中海水牛群体中的遗传信息

对ApoB_SNP1-6位点的不同基因型与地中海水牛泌乳性状进行最小二乘分析，确定了ApoB_SNP1-6为与泌乳性状相关的2个SNP标记。结果如表4所示。g.-1718A>G与地中海水牛乳蛋白率显著相关(p<0.05)，AA型个体的乳蛋白率(4.62±0.02％)显著高于GA型个体(4.57±0.01％)(p<0.05)；g.-1823G>C与地中海水牛乳蛋白率显著相关(p<0.05)，GG型个体乳蛋白率(4.63±0.02％)显著高于CG型个体(4.57±0.01％)(p<0.05)；g.-2063A>C与地中海水牛乳蛋白率显著相关(p<0.05)，AA型个体的乳蛋白率(4.63±0.02％)显著高于GA型个体(4.57±0.01％)(p<0.05)；g.5903G>A与地中海水牛乳脂率显著相关(p<0.05)，GG型个体乳脂率(8.16±0.04％)显著高于AA型个体(7.95±0.07％)(p<0.05)；g.37375G>A与地中海水牛270d乳脂量、270d乳蛋白量及乳蛋白率显著相关(p<0.05)，GG型个体的270d乳蛋白量(237.5±1.93kg)、乳蛋白率(4.61±0.01％)及270d乳脂量(133.69±1.03kg)均显著高于GA型个体(p<0.05)的270d乳蛋白量(228.67±2.25kg)、乳蛋白率(4.56±0.01％)以及270d乳脂量(129.40±1.20kg)；g.40787A>G与地中海水牛乳脂率和乳蛋白率显著相关(p<0.05)，GG型个体的乳脂率(8.20±0.06％)和乳蛋白率(4.63±0.02％)均显著高于AA型个体的乳脂率(7.95±0.07％)和乳蛋白率(4.57±0.02％)(p<0.05)(表4)。

表4ApoB基因SNP位点多态性与地中海水牛泌乳性状关联分析

注：在表4中,(1)以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，字母不同时表示差异显著(P<0.05)，未标注者表示差异不显著(P>0.05)。(2)PM：高峰奶量；MY：305d产奶量；FY：乳脂量；FP：乳脂率；PY：乳蛋白量；PP：乳蛋白率。

实施例3：具有优良泌乳性状的ApoB_SNP1至ApoB_SNP6位点的单倍型组合的鉴定

(1)单倍型与单倍型组合的构建

利用Haploview软件进行ApoB_SNP1至ApoB_SNP6的单倍型分析,同时将得到的所有个体的ApoB_SNP1至ApoB_SNP6位点的基因型数据输入PHASE程序，计算得到每个个体的基因型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度。

单倍型block分析如附图7所示。结果发现SNP位点g.-1718A>G，g.-1823G>C，g.-2063A>C参与构成一个单倍型模块1(haplotype block)，SNP位点g.37375G>A和g.40787A>G参与构成一个单倍型模块2，二者均处于连锁不平衡状态。

(2)不同单倍型组合与产奶性状关联分析

计算所有个体单倍型组合的单倍型频率，筛选单倍型频率高于5％的组合，发现block1中单倍型组合H1H1、H1H2、H2H2的频率分别为18.5％、33.7％、29.7％；block1中单倍型组合H1H1、H1H2、H1H3、H2H2、H3H2的频率分别为6.3％、28.9％、10.6％、32.6％、18.9％。

将这些单倍型组合进一步与地中海水牛产奶性状关联分析，发现Block1与270d乳蛋白量、乳蛋白率显著相关(p<0.05)，H2H2型个体的270d乳蛋白量(134.25±1.31kg)、乳蛋白率(4.62±0.02％)显著高于H1H2型个体的270d乳蛋白量(130.33±1.03kg)、乳蛋白率(4.57±0.01％)(p<0.05)，因此H2H2为Block1的优势单倍型(表5)。Block2与乳蛋白率显著相关(p<0.05)，H2H2型个体的乳蛋白率(4.63±0.01％)显著高于H1H2型个体(4.56±0.02)(p<0.05)，因此H2H2为Block2的优势单倍型(表6)。

表5Block1单倍型组合与地中海水牛泌乳性能关联分析

注：同行上标不同字母表示差异显著，P<0.05，相同字母表示差异不显著，P>0.05。

表6Block2单倍型组合与地中海水牛泌乳性能关联分析

注：同行上标不同字母表示差异显著，P<0.05，相同字母表示差异不显著，P>0.05。

本实施例鉴定2个具有优良泌乳性状的ApoB_SNP1至ApoB_SNP6位点的单倍型组合Block1和Block2。Block1的优势单倍型组合H2H2的序列为：AGA/AGA；Block2的优势单倍型组合H2H2的序列为：GG/GG。这2个单倍型组合可以作为筛选标记用于筛选具有优良地中海水牛泌乳性状的标记辅助选择上。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 与地中海水牛优良泌乳性状相关的分子标记与应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "R" is for "A" or "G".

<400> 1

gagagccttg ggcaaagttt cctgtgggca aagtttcctg tgggacatgg acaggaccta 60

gagaggaagg gacggattca tggagaaggt tctgggatgt rttaggagaa atattctgcg 120

tccacccact actccacttc tcctcactgg cctcccctgt ccctgaggaa acccaaaggc 180

agttcctata gagaaaagcc t 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "S" is for "G" or "C"

<400> 2

gagaaatatt ctgcgtccac ccactactcc acttctcctc actggcctcc cctgtccctg 60

aggaaaccca aaggcagttc ctatagagaa aagcctcctc stctcaactt cccaagaaga 120

aattggacct ttggggtggg cagaggagaa cagggaggaa gtttgccttt tccaaaggcc 180

cctcctcact ggggcttcca c 201

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "M" is for "A" or "C"

<400> 3

ggtccctcgg gtcaagaagg ggtcagtccc tctccagacc cctctctcct tctcttctct 60

ctcggcttcc tccagatgga ctgagtccag ggcaggtgac mcagagcctt gggtactgat 120

ctgggttaga ggcccctagg caacctcaaa gtccaccagg taagaaggaa gtgggggtcg 180

gggcgaaggt cttcacctag a 201

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "R" is for "G" or "A"

<400> 4

agcaagttct actttatcca gagaaagaag agcctaaaca catcctcaac atcaagaggg 60

gcatcatctc tgccctcctg cttcccccag aaacggaaga rgctaagcaa gtgttatttc 120

tggtgagaat tttaaaagct ggtaatagtg gtcctttgaa ctcctcttca tatagtggag 180

ctgggttcca cttatacatc a 201

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "R" is for "G" or "A"

<400> 5

atataccaaa aaccccaatg gttatcttgt ttctatcccc gtgcaagaat tgaatgataa 60

attcattatt cctggactga aacgaaataa tcaaaattcc rttcatgtca cacctacatt 120

ccaagtcccc tttacagatc ttcaggttcc atcctacaca cttgacctta gtgaaataaa 180

aatctacaag aagctaagta c 201

<210> 6

<211> 201

<212> DNA

<213> Bubalus bubalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> "R" is for "A" or "G"

<400> 6

atactgtttt cctatttact atacctgatg gaggagtctg agttatacaa ggacctaaac 60

aataaatttt cttttacatc aatgtgcaat caactaatag rtatggtctt ggagtgtatg 120

aaaacgtttc tatttttctc acaagagatc caaaaggcac ttagttacct ccaatctacc 180

atgatgacag agatgctaag t 201

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgcgtccac ccactactc 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccctcccgc ctgctgtcta 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctcggtgac catactct 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaatgctga tgtgaaac 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aatggttatc ttgtttctat c 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaagaaatac atcctggg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtccttttc tgctggtc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agagcctgca cgtactga 18