一种基于大黄叶绿体基因组多态性区域制备的条形码及其应用

技术领域

本发明涉及大黄的鉴定方法，具体涉及利用大黄叶绿体基因组多态性区域对大黄的基原、产地、质量、真伪、批次的鉴别方法。

背景技术

大黄(Rhei Rhizoma)是一种重要的常用大宗药材，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效。《中华人民共和国药典》规定，正品大黄来源于廖科大黄属(Rhem)的掌叶大黄(R.palmatum L.)、唐古特大黄(R.tanguticum Maxim.ex Balf)或药用大黄(R.franzembachii Munt)的干燥根和茎。近年来，由于大黄野生资源日趋匮乏，大黄属波叶组的华北大黄(R.franzenbachii Munt)、河套大黄(R.hotaoense C.Y.Cheng etKao)、天山大黄(R.wittrockii Lundstr)等大黄伪品药材常混淆流通于市场，如何准确鉴别大黄药材的真伪一直史生药领域关注的问题。另外一方面，大黄是典型的多基原、多功效的药材，已有研究表明，掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄3种正品大黄的化学成分有一定的差异，并且三者在药理活性上也存在不同程度的差异，为确保大黄更为精确的对症用药，有必要针对不同功效用途，选取不同基原大黄入药，因此，在鉴别大黄真伪的前提下，进一步鉴别大黄基原种也具有重要的意义。

与传统重要鉴定方法相比，基于DNA序列标记的中药材分子鉴定技术具有不依赖于药材形态、无需鉴定人长年经验积累、重复性好、准确度高等优点。特别是在鉴别近缘种药材上，可以很好地解决由于药材外观形状极其相似而导致的鉴定困难。因此近年来分子鉴定技术在中药鉴定领域得到了广泛的应用。叶绿体基因组为植物细胞提供必需能量的光合细胞器。叶绿体基因组的遗传信息来自母系遗传的，因此叶绿体基因组是母本的一个很好的分子标记，叶绿体基因组序列一般是比较保守的，具有相对稳定的基因组结构、基因含量、基因顺序和较低的突变率。因此，叶绿体基因组是系统发育研究和物种鉴定有效工具之一。近年来的研究表明，叶绿体基因组突变不是随机的，而是聚集在“热点”，这样在基因组中就形成了高变区-多态性区域。叶绿体基因组多态性区域不仅为物种水平上的鉴定提供分子标记，而且还可以为物种提供准确的遗传多样性和群体结构，进一步为物种的品种择育种提供了有价值的信息。

发明内容

为了弥补现有技术的空白，本发明提供了一种大黄叶绿体基因组多态性区域及其应用，所述区域为trnH-GUG_psbA基因多态性间区。

本发明的第一方面，提供一种trnH-GUG_psbA基因多态性间区作为大黄鉴别DNA条形码的应用。在一种实施方案中，所述鉴别DNA条形码可用于大黄种质鉴别，更为具体的，所述种质鉴别包括对样品基原、产地、质量和真伪的鉴别。

本发明的第二方面，提供一种利用trnH-GUG_psbA基因多态性间区对大黄种子进行批次防伪的方法，所述方法包括：

(1)大黄单倍型选择和种植

将收集单倍型种子，将携带不同的trnH-GUG_psbA区间的单倍型进行组合，然后分批次进行种植，

(2)大黄批次样品的鉴定

将上述的大黄样品进行收集，提取DNA，对大黄的叶绿体多态性区域trnH-GUG_psbA进行扩增，并进行测序，并将测序结果分析，根据单倍型的序列和组合方式判断种植的大黄的批次样品。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1trnH-GUG_psbA不同单倍型序列；

图2单倍型序列构建的进化树；

图3大黄中各有效成分标准曲线；

图4不同单倍型的大黄药材中有效成分含量分析；

图5编号2-7单倍型Hap1和编号2-2单倍型Hap7测序峰图；

图6编号2-7单倍型Hap1和编号2-8单倍型Hap9测序峰图。

具体实施方式

实施例1大黄叶绿体基因组多态性区域的筛选

1.1叶绿体基因组基因区域比对结果

首先收集青海和日乡、四川色达、湖北宜昌、四川平武、宁夏隆德、甘肃宕昌、陕西陇县地区的7个大黄样品，提取叶绿体基因组，进行叶绿体基因组测序，测序结果应用clustalw2软件对样本进行多序列比对分析，得到112个对比结果。其中9个基因对应的比对结果只有1个差异位点，53个基因对应的比对结果显示序列相似性为100％，以上62个基因无法用于筛选DNA条形码。将剩余50个比对结果按照序列相似度由小到大排序，表1-1展示的是不同大黄样品变异度最高的30个叶绿体基因，表中数据可以看出，除了trnG-UCC、psbH基因外，大黄叶绿体基因区序列高度相似。由此可以看出，

表1-1 大黄变异度最高的30个叶绿体基因

1.2叶绿体基因组基因间区比对结果

应用clustalw2软件分别对125个基因间区序列做多序列对比分析，去除只有1个位点差异的21个基因间区和相似性为100％的17个基因间区比对结果，剩余87个基因间区可以用于筛选DNA条形码。将备选87基因间区序列按照序列相似性由小到大排序发现基因间区的序列相似性比基因区域序列相似性低，但可能由于掌叶大黄、唐古特大黄、掌叶大黄物种间亲缘关系很近，或者由于大黄属植物叶绿体进化缓慢，从表1-2可以看出，整体比对结果的相似性仍然比较高。

表1-2 大黄变异度最高的30个叶绿体基因间区

1.3筛选大黄叶绿体基因组多态性区域

对于一个高效的条形码序列，除了要满足变异度足以区分不同物种的需求外，还需要满足PCR扩增和PCR产物测序的实验要求，所以对于序列长度也是筛选因素之一。将筛选出的比对长度在300～700bp之间，序列相似度＜97％的基因间区片段进行人工核对，其中trnH-GUG_psbA基因(SEQ ID NO.1)间区在第125位掌叶大黄4-5碱基为A，其余为C，掌叶大黄4-6第372为碱基为C，其余为A，编号4-4掌叶大黄342-349位有碱基AAATAAAAA插入；药用大黄5-1第186、341位分别为A、T；唐古特大黄第186、206、281位碱基分别为C、T、A，比对结果显示trnH-GUG_psbA基因间区每个样本的该段序列均存在其特异性变异位点，

表1-3 大黄核心种质特异性DNA条形码片段

实施例2利用trnH-GUG_psbA基因间区实现对不同大黄道地性核心种质的鉴别

2.1收集不同地区的大黄种子

收集全国各地不同地区的多份药材(地区表2-1)，进行DNA提取，利用特异性引物trnH-GUG_psbA-F：CGGGCGAACGACGGGAATTG；trnH-GUG_psbA-R：ATACTGTCGAATAACAAGCC，通过PCR扩增trnH-GUG_psbA片段，回收后进行测序。

表2-1 大黄不同地区样品收集表

2.2利用trnH-GUG_psbA分析不同地区大黄的单倍型和序列特征

对测序结果进行分析，共形成13个单倍型(图1)，根据单倍型序列特征分为两大类。

第一类突变位点主要分布在36bp-360bp，共有6个单倍型，单倍型Hap2的179和218位的特异性碱基为C和A；Hap3在36-42位存在插入序列CTTTAAA；单倍型Hap4139位的特异性碱基为A；单倍型Hap5286和952位的特异性碱基分别位T和A；单倍型Hap639、49位的特异性碱基分别为G和A。

第二类突变位点379-404，其中379、381-385、387、389及391-392、394、396、399、400-402和404位的特异性碱基都为C、A、T、T、T、T、T、C、T、T、G、C、G、G、G、T；除此之外，单倍型Hap8的其他特异性碱基在199、200和952位都为A；单倍型Hap9的其它特异性碱基在219和352位，分别为T和C；单倍型Hap10的其它特异性碱基在274-280位间缺失；单倍型Hap11的其它特异性碱基在128和304位都为T；单倍型Hap12其它特异性碱基在49和219位，分别为A和C；单倍型Hap13其他特异性碱基在295位为A。

2.3系统进化树

使用MEGA7.0软件对大黄的单倍型序列进行构建系统发育树，由图2可知，由单倍型序列构建的进化树可以分为两大支，与上面的测序结果分析类似；其中Hap1—Hap6是一大分支；Hap7-Hap13分布在另外一分支上。

从系统发育进化树可看出，掌叶大黄聚为两个大支，药用大黄和唐古特大黄分别聚于其中的一支，表明药用大黄和唐古特大黄这两种基原具有明显的谱系划分，其中药用大黄河南省洛阳市(Hap5)、湖北省宜昌市(Hap3)以及四川省绵阳市(Hap6)聚为一支。而云南省昆明市(Hap12)在另一大分支上，表明云南省昆明市产药用大黄与其余药用大黄存在明显的谱系划分。唐古特大黄青海省海北州祁连县2(Hap7)与青海省果洛藏族自治州(Hap9)和青海省海北州祁连县1(Hap8)聚在一大支上。掌叶大黄四川省甘孜州炉霍县(Hap10)和甘肃省陇南市宕昌县2(Hap11)聚为一小支。四川省甘孜州理塘县(Hap2)和陕西省宝鸡市陇县(Hap4)聚为一小支。同时大部分产自四川省样本(四川阿坝州，四川雅江，四川石棉，四川绵阳)聚为一大支。大部分青海省样本(青海省海北州祁连县，青海省果洛藏族自治州)聚在一大支上，表明不同产地的大黄有一定的地理区域划分，这也说明大黄的trnH-GUG_psbA单倍型在产地分布上有一定趋向性，表明可以根据大黄trnH-GUG_psbA单倍型对大黄进行部分产地鉴别，尤其我们可以根据基因型的种类和数目对大黄产地鉴别。

实施例3大黄单倍型质量测定

3.1标准曲线的测定

按药典标准或参照其他已发表文献，对大黄中有效成分，进行标准曲线测定，包括没食子酸、儿茶素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚等多个成分。标准曲线如图3。

3.2利用HPLC分析不同单倍型大黄药材的质量特征

利用HPLC对3个不同单倍型大黄样品进行分析，其中Hap6为药用大黄，Hap1为唐古特大黄，Hap4为掌叶大黄，对不同单倍型大黄多份药材进行粉碎提取其中有效成分，并利用HPLC测定各类有效成分，按标准曲线计算各个成分含量。结果如图4所示。

通过含量测定发现，Hap1中番泻苷B％含量最高，3.39％，Hap6中番泻苷A％含量最高，0.19％，Hap4中芦荟大黄素含量最高，0.15％，说明

实施例4利用大黄叶绿体多态性区域进行大黄种子批次防伪

4.1挑选多态性区域存在不同变异位点的种子进行批次防伪验证

实验采用叶绿体基因片段作为建立中药材生产批次条形码的主要手段，实验采用的批次条形码包含但不限于matK片段，trnH-GUG_psbA片段等叶绿体基因片段。

挑取图1中编号2-7单倍型Hap1和编号2-2单倍型Hap7两个不同单倍型的大黄种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种，8月份采集大黄不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR仪扩增trnH-GUG_psbA片段，回收后进行测序。测序峰图如图5所示。

由图5中明显可见trnH-GUG_psbA片段变异位点：在379bp处，Hap1碱基为A，Hap7碱基为C，该位点测序峰图存在A-C套峰结构；在381bp，382bp，383bp和384bp处，测序峰图出现C-A，C-T和G-T套峰结构；在352bp处，Hap1碱基为A，Hap7碱基为C，该位点测序峰图出现A-C套峰结构。

另挑取图1中编号2-8单倍型Hap9和编号2-7单倍型Hap1两个不同单倍型的大黄种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种，8月份采集大黄不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR仪扩增trnH-GUG_psbA片段，回收后进行测序。测序峰图如图6所示。

由图6中明显可见trnH-GUG_psbA片段变异位点：在352bp处，Hap1碱基为A，Hap9碱基为C，该位点测序峰图出现A-C套峰结构；在219bp处，Hap1碱基为A，Hap9碱基为T，该位点测序峰图出现A-T套峰结构。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 北京中医药大学

<120> 一种基于大黄叶绿体基因组多态性区域制备的条形码及其应用

<130> CP210212

<141> 2021-07-21

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1702

<212> DNA

<213> Rhei Rhizoma

<400> 1

cgggcgaacg acgggaattg aacccgcgca tggtggattc acaatccact gccttgatcc 60

acttggctac atccgcccct acgttcctta cttgaaaatg attcaaatta cactcactaa 120

ctcactattc atcatttttt tacttaattt tttatattca tttttttctt ttacaaaaat 180

ttgaaatctt tctctctatg aatataaatg actatgaaac aaaaaatttc cccaaaaacc 240

aaaacaacaa agagggcgta tgggtagaaa ttaaaaaaat gcgaatgcgt ccataaatat 300

aaaaaaatac aacattcaat catcactcat cacttaaaac atttttttct tttttttaat 360

ggggaagaaa acttatgact cataacataa aatatatata taataaaaat tttaattaaa 420

ggagcaatac caacccgctc gatagaacaa gaaattgggt attgctcctt taattaaaaa 480

aactcgacta cactaagacc aaaatcttat ccattgatag atggagcttg gatagcagct 540

aagtctagag ggaagttatg agcattacgt tcatgcataa cttccatacc aaggttagcg 600

cggttaataa tatcagccca agtattaatt acacgacctt gactatcaac tacagattgg 660

ttgaaattga agccgttcag attaaacgcc atagtactaa tacctaaagc agtaaaccag 720

atacctacta caggccaagc agctaagaag aaatgtaaag aacgagaatt gttgaaacta 780

gcatattgga agattaatcg gccaaaataa ccatgagcgg ctacgatatt ataagtttct 840

tcctcttgac caaatctgta accttcatta gcagattcat tttctgtggt ttccctgatc 900

aaactagagg ttaccaaaga accatgcata gcactgaata gggagccgcc aaatacacca 960

gctacgccta acatgtgaaa tgggtgcata aggatgttgt gctcggcctg aaatacaatc 1020

atgaagttga aagtaccaga gattcctaga ggcataccat cagaaaagct tccttgacca 1080

attgggtaga tcaagaaaac agcagtagca gccgcaacag gagctgaata cgcaacagca 1140

atccaagggc gcatacccag acggaaacta agttcccact cacgacccat gtaacaagct 1200

acaccaagta agaagtgtag aacaattagc tcataaggac caccgttgta taaccattca 1260

tcaacagatg cagcttccca tattggataa aagtgcaaac cgatagctgc agaagtagga 1320

ataatggcac cagagataat attgtttccg taaagaagag atccagaaac aggctcacga 1380

ataccatcaa tatctactgg aggagcagca atgaaggcta taataaatac agaagttgcg 1440

gtcaataagg tagggatcat caaaacgcca aaccatccaa tgtaaagacg gttttcagta 1500

ctggttatcc agttacaaaa acgaccccat aggctttcgc tttcgcgtct ctctaaaatt 1560

gcagtcatgg tcaaaaatct tggtctattt catttaatca tcagggactc ccaagcgcac 1620

aaattctata taatctatac tcgattaaaa actcgattaa aaatagataa ttataattga 1680

aggcttgtta ttcgacagta ta 1702