用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记nicas1及其试剂盒与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记Nicotine Associated SNP 1及其试剂盒与应用。

背景技术

研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化烟碱烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯，帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。

烟碱(Nicotine)是栽培烟草(Nicotianatabacum)最为重要的次生代谢产物，尼古丁作为一种最为知名的生物碱，其含量的多少可以直接决定烟叶品质，是烟草中最具有经济价值的部分。在大多数的烟草品种中生物碱占干重的2％-4％，而烟碱占生物碱总含量的90％-95％。

烟草生长受到昆虫、病原菌侵害或受到胁迫时,烟株通过诱导产生烟碱抵御侵害,因此烟碱是一种烟草自身的保护性代谢物,对自身的正常生长发育提供保护。在工业生产中烟碱含量过高或过低都会导致烟叶化学成分含量不协调,降低可用性,不利于卷烟的生产。因此研究烟草的烟碱合成与代谢调控对我国烟草工业以及农业生产的发展具有重要意义。

烟碱生物合成途径已经部分解析，烟草中的腐胺可以用于合成烟碱吡咯烷环。精氨酸脱羧酶(ADC,arginine decarboxylase)催化精氨酸脱羧生成腐氨,或由鸟氨酸脱羧酶(ODC, ornithine decarboxylase)催化鸟氨酸脱羧形成腐氨。腐胺在腐胺N-甲基转移酶(PMT, putrescine-N-methyltransferase)作用下获得由S-腺苷蛋氨酸(SAM,S-adenosyl-L-methionine) 提供的甲基形成N-甲基腐胺,这是一个依赖S-腺苷蛋氨酸合成酶(SAMS,S-adenosylmethionine synthase)活性的反应。N-甲基腐胺在N-甲基腐胺氧化酶(MPO, N-methylputrescine oxidase)催化下形成4-甲氨基丁醚,并通过自身环化形成N-甲基-△1-吡咯啉阳离子,随后与提供吡啶环部分的烟酸衍生物发生缩合反应形成烟碱。

烟碱吡啶环部分由烟酸提供,其前体是由天冬氨酸合成的喹啉酸。喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT,quinolinatephosphoribosyltransferase)催化下形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD),然后经由吡啶核苷酸循环途径生成烟酸。

近期有关烟碱吡咯烷环部分和吡啶环部分缩合反应的研究表明,NADPH依赖性还原酶的PIP家族成员类异黄酮还原酶基因A622及其同源基因参与了这一过程。

植物激素是调控次生代谢产物生物合成基本方式之一，解析激素信号对次生代谢产物生物合成的调控机制是植物科学研究的重点之一。植物激素茉莉酸类化合物(Jasmonates,JAs) 已被证明广泛参与植物次生代谢物质的代谢调控，JA对烟碱生物合成具有显著的诱导作用。

在茉莉酸存在时,茉莉酸衍生物JA-Ile与茉莉酸受体COI1相结合使负调控因子JAZ蛋白的泛素化降解,从而释放下游转录激活因子并激活植物的茉莉酸应答。烟草的茉莉酸途径调控因子COI1和JAZ蛋白都已被证明是烟碱合成调控因子。近期研究还鉴定了一些调控烟碱合成的转录因子,如ERF转录因子家族成员JAP1、ERF32及ORC1的同源基因等,bHLH转录因子家族成员bHLH1/2和MYC2等,这些ERF转录因子和bHLH转录因子还可以通过彼此间的相互调控影响烟碱代谢过程。

目前本领域尚不存在利用SNP位点鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记。

发明内容

基于本领域的上述空白，本发明的目的在于提供一种用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记Nicotine Associated SNP 1(简称nicas1)及其试剂盒与应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记Nicotine Associated SNP 1，其特征在于，为位于烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017的第0002539号基因组片段第 95304位的SNP位点Nitab4.5_0002539:95304A/G。

所述用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记Nicotine Associated SNP 1的特异性引物如 SEQ ID NO.1和2所示。

用于鉴别烟草尼古丁含量高低的试剂盒，其特征在于，包括：分子标记NicotineAssociated SNP 1；所述分子标记Nicotine Associated SNP 1为位于烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017的第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点 Nitab4.5_0002539:95304A/G。

所述的用于鉴别烟草尼古丁含量高低的试剂盒还包括：分子标记NicotineAssociated SNP 1的特异性引物；优选地，所述分子标记Nicotine Associated SNP 1的特异性引物如SEQ ID NO.1和2所示；

优选地，所述试剂盒还包括：用于PCR的试剂、用于测序的试剂、和/或，用于KASP基因分型检测的试剂；

优选地，所述用于PCR的试剂包括：dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、ddH

优选地，所述用于测序的试剂包括：Tris-HCl、琼脂糖、EB；

优选地，所述KASP基因分型检测的试剂包括：KASP Master mix。

一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法，其特征在于，采用分子标记NicotineAssociated SNP 1对待测烟草材料进行筛选；所述分子标记Nicotine Associated SNP 1位于烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539基因组片段第95304位的SNP位点 Nitab4.5_0002539:95304A/G。

所述的一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法包括：采用所述分子标记NicotineAssociated SNP 1的特异性引物对待测烟草材料的DNA进行PCR扩增；所述分子标记Nicotine Associated SNP 1的特异性引物如SEQ ID NO.1和2所示；

优选地，所述一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法还包括：所述PCR扩增产物进行测序或KASP基因分型检测；

优选地，测序结果或KASP检测结果显示SNP位点基因型为GG对应的待测烟草材料为尼古丁含量低的烟草材料；

测序结果或KASP检测结果显示SNP位点基因型为AA对应的待测烟草材料为尼古丁含量高的烟草材料；

优选地，所述PCR扩增的反应体系包括：

模板0.02μL/μL、正向引物0.02μL/μL、反向引物0.02μL/μL、5×buffer 0.2μL/μL、dNTP mixture 0.02μL/μL、DNA聚合酶0.02μL/μL、其余为水；

PCR扩增的反应程序包括：98℃5min；以98℃30s、58℃30s、72℃30s为1个循环，共35个循环；72℃5min；

优选地，所述待测烟草材料的DNA提取自烟草的叶片、种子、根、茎、花、或果实。

一种高尼古丁含量的烟草品种的选育方法，其特征在于，采用所述一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法从待测烟草材料筛选出高尼古丁含量的烟草材料。

以筛选出的高尼古丁含量的烟草材料做为母本或父本、以待改良的烟草材料做为父本或母本，将二者杂交得到F1代；

优选地，再以F1代植株为亲本进行自交获得F2代群体，以F2代群体植株与筛选出的高尼古丁含量或低尼古丁含量的烟草材料或待改良的烟草材料进行回交。

本发明提供一种与烟草尼古丁含量性状关联的SNP(Single NucleotidePolymorphism)位点Nicotine Associated SNP 1，其特征在于：所述SNP位点的位置为烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位，存在一个A/G的SNP 位点。

所述的与烟草尼古丁含量性状关联的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点。

所述的与烟草尼古丁含量多少相关联的SNP(single nucleotide polymorphism)位点在烟草尼古丁含量多少的早期预测和筛选中的应用。

所述的与烟草尼古丁含量性状关联的SNP(single nucleotide polymorphism)位点在烟草分子标记辅助育种中的应用。

所述与烟草尼古丁含量性状关联的SNP(single nucleotide polymorphism)位点在高，低尼古丁含量烟草育种中进行应用。

一种与烟草尼古丁含量性状关联的SNP(single nucleotide polymorphism)位点，所述SNP 位点Nicotine Associated SNP 1为位于烟草基因组版本Nitab v4.5 GenomeScaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点Nitab4.5_0002539:95304A/G。

一种烟草尼古丁含量多少相关联的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点在烟草尼古丁含量多少的早期预测和筛选中的应用。

一种烟草尼古丁含量性状关联的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点在烟草分子标记辅助育种中的应用。

一种烟草尼古丁含量性状关联的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点在高，低尼古丁含量烟草育种中进行应用。

本发明具有的优点是：本发明鉴定到烟草尼古丁含量性状关联的SNP(singlenucleotide polymorphism)位点，为培育不同尼古丁含量的烟草奠定基础，本发明鉴定到控制烟草尼古丁含量性状关联的SNP(single nucleotide polymorphism)位点以及基因，同时为分子标记辅助育种以及聚合育种提高棉纤维产量奠定基础。

采用本发明的SNP位点，可以通过杂交然后回交的常规方法培育高尼古丁含量或低尼古丁含量的烟草品种。可以用来为培育不同尼古丁含量的烟草提供基因资源，同时也可为烟草分子标记辅助育种提供标记信息，加速烟草尼古丁含量育种的进展。该发明可以不通过转基因方法直接进入烟草育种环节。

本发明提供一种与烟草烟碱含量相关联的SNP(Single NucleotidePolymorphism)位点与应用，所述SNP位点位于烟草基因组版本Nitab v4.5 GenomeScaffolds Edwards2017第0002539 号基因组片段第95304位，是一个碱基变化为A/G的SNP位点。

该位点为烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的一个A/G的SNP。本发明鉴定到控制烟草尼古丁含量的关键位点为烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点Nitab4.5_0002539:95304A/G。

本发明通过鉴定该SNP为分子标记辅助育种以及聚合育种改变烟草尼古丁含量奠定基础。

本发明筛选鉴定出一个主效影响烟草尼古丁含量的SNP位点，因此可以通过杂交然后回交的常规方法培育高尼古丁含量或低尼古丁含量的烟草品种。可以用来为培育不同尼古丁含量的烟草提供基因资源，同时也可为烟草分子标记辅助育种提供标记信息，加速烟草尼古丁含量育种的进展。该发明可以不通过转基因方法直接进入烟草育种环节。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。

本发明的实验例1使用的17份烟草材料均为申请人单位自有的烟草种质资源，申请人承诺自本发明申请日起20年内可向公众发放用于验证本发明的效果。

实验例2使用的红花大金元、云烟87为公知公用的烟草品种，可商购获得。

第1组实施例、本发明的分子标记

本组实施例提供一种用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记NicotineAssociated SNP 1 (简称nicas1)。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述分子标记nicas1为位于烟草基因组版本Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的 SNP位点Nitab4.5_0002539:95304A/G。本发明所述的用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记Nicotine Associated SNP 1为位于烟草基因组版本Nitabv4.5 Genome Scaffolds Edwards2017 第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点Nitab4.5_0002539:95304A/G。该SNP位点在此两个版本的基因组上对应同一个位点，的核苷酸为G或A，并经实验证实尼古丁含量高的烟草的该位点为A，尼古丁含量低的烟草的基因组该位点为G，并且可用该分子标记准确筛选出尼古丁含量高低的烟草品种，并确认其基因型与表型。本发明的烟草基因组版本为 Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017版本基因组。

在具体的实施例中，可扩增所述用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记nicas1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

nicas1-F1 GTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCT(SEQ ID NO.1)

nicas1-R1 TGATAAAGTCAGGCGAAAACGA(SEQ ID NO.2)

采用上述引物通过KASP标记方法对就可以区分SNP，但是本领域技术人员利用本发明的SNP还可以采用其它检测手段，例如caps标记方法等，他可根据SNP位点设计出其它适用于不同检测手段的可用的引物。

第2组实施例、本发明的用于鉴别烟草尼古丁含量高低的试剂盒

本组实施例提供用于鉴别烟草尼古丁含量高低的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括：分子标记nicas1；所述分子标记nicas1为位于烟草基因组版本 Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点 Nitab4.5_0002539:95304A/G。在一些实施例中，所述分子标记nicas1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述试剂盒还包括：分子标记nicas1的特异性引物；优选地，所述分子标记nicas1 的特异性引物如SEQ ID NO.1和2所示；

优选地，所述试剂盒还包括：用于PCR的试剂、用于测序的试剂、和/或，用于KASP基因分型检测的试剂；

优选地，所述用于PCR的试剂包括：dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、ddH

优选地，所述用于测序的试剂包括：Tris-HCl、琼脂糖、EB；

优选地，所述KASP基因分型检测的试剂包括：KASP Master mix。

第3组实施例、本发明的鉴别烟草尼古丁含量高低的方法

本组实施例提供一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法。本组实施例具备如下共同特征：采用分子标记nicas1对待测烟草材料进行筛选；所述分子标记nicas1为位于烟草基因组版本 Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017第0002539号基因组片段第95304位的SNP位点 Nitab4.5_0002539:95304A/G。在一些具体的实施例中，所述的一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法包括：采用所述分子标记nicas1的特异性引物对待测烟草材料的DNA进行PCR扩增；所述分子标记nicas1的特异性引物如SEQ ID NO.1和2所示；

优选地，所述一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法还包括：所述PCR扩增产物进行测序或KASP基因分型检测；

优选地，测序结果或KASP检测结果显示SNP位点基因型为GG对应的待测烟草材料为尼古丁含量低的烟草材料；

测序结果或KASP检测结果显示SNP位点基因型为AA对应的待测烟草材料为尼古丁含量高的烟草材料；

优选地，所述PCR扩增的反应体系及反应程序如下表1所示：

表1

优选地，所述待测烟草材料的DNA提取自烟草的叶片、种子、根、茎、花、或果实。

KASP是本领域公知技术，本领域技术人员可根据实际试验中的具体情况，参照本领域常规技术手段进行常规选择和调整的，例如，可购买“KASP Master mix”并参照其产品说明书记载的反应条件，根据本发明所得的PCR扩增产物的片段大小选择合适的参数、调整合适的反应条件。

KASP、DNA测序均为本领域公知技术，也是目前市场上成熟的商品化技术，本领域技术人员可根据本发明记载的引物序列进行PCR扩增，将扩增产物送至有偿进行KASP、DNA测序的公司进行PCR扩增产物的片段大小确定或序列确定，从而得出PCR扩增产物的片段大小或具体序列，根据SNP位点是AA还是GG来判断模板所对应的烟草品种是尼古丁高含量型还是尼古丁低含量型。

本领域技术人员也可采用本领域其它常规手段检测PCR扩增产物，例如，可采用竞争性等位基因特异性PCR扩增、电泳、DNA测序等方法均可获知PCR扩增产物序列，进而得知待测烟草材料具体是尼古丁低含量型烟草还是尼古丁高含量型烟草。

在另一些实施例中，可采用Kluster Caller基因分型仪，检测PCR产物序列。

Kluster Caller基因分型仪是本领域常见的可商购获得的仪器，其操作方法可参考该仪器的产品说明书进行操作。

第4组实施例、本发明高尼古丁含量的烟草品种的选育方法

本组实施例提供一种高尼古丁含量的烟草品种的选育方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第3组实施例所一项所提供的一种鉴别烟草尼古丁含量高低的方法从待测烟草材料筛选出高尼古丁含量的烟草材料。

本领域技术人员可在烟草植株生长的任意阶段采用所述鉴别烟草尼古丁含量高低的方法对烟草材料进行筛选，并得到高尼古丁含量或低尼古丁含量的烟草材料。

在进一步的实施例中，以筛选出的高尼古丁含量或低尼古丁含量的烟草材料做为母本或父本、以待改良的烟草材料做为父本或母本，将二者杂交得到F1代；

优选地，再以F1代植株为亲本自交获得F2代，再用F2代植株与筛选出的高尼古丁含量的烟草材料或低尼古丁含量的烟草材料或待改良的烟草材料进行回交。

实验例1：本发明SNP标记鉴别尼古丁含量高低的烟草材料

测定烟叶中尼古丁含量

依据标准YC/T 160-2002检测中烟草材料的尼古丁含量。选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株为处理对象，以野生型烟草K326为对照。取5株非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对5株非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。

用5％乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的总植物碱(以烟碱计)与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，氯化氰由氰化钾和氯胺T在线反应产生。反应产物用比色计在460nm测定。

主要仪器设备：连续流动分析仪(美国API)(德国SEAL AA3)(法国ALLIANCE)。

配置试剂：

Brij 35溶液(聚乙氧基月桂醚)：水中加5滴22％Brij35，搅拌均匀。

缓冲溶液A：称取2.35g氯化钠(NaCl)，7.60g硼酸钠(Na

缓冲溶液B：称26g磷酸氢二钠(Na

氯胺T溶液(N-氯-4-甲基苯硫酰胺钠盐)[CH

0.22mol/L NaOH缓冲液：NaOH 8.8g，Na

对氨基苯磺酸缓冲液：称取C

氯胺T：称取氯胺T1.2g，用纯水溶解定容至100mL，用棕色试剂瓶保存。

氰化钾：KCN 0.4g，用纯水溶解定容至100mL。

NaCO

分析步骤：称取0.3g烟样于150mL三角瓶或塑料瓶中(精确至0.0001g)；加入50mL5％乙酸溶液盖上塞子；在普通摇床上振荡萃取30min，转速控制170r/min，用滤纸过滤上机。 (如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释)。

结果的计算与表述：

以干基计的总植物碱的含量，由下面公式得出：

式中：

C——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为mg/mL；

V——萃取液的体积，单位为mL；

m——试料的质量，单位为mg；

W——试样的水分含量，单位为％。

以两次测定的平均值作为测定结果，结果精确至0.01％。

在本文中，尼古丁含量＞20mg/g的烟草材料为基因型为AA的尼古丁高含量的烟草材料；

尼古丁含量≤20mg/g的烟草材料为基因型为GG的尼古丁低含量的烟草材料。

采用本发明的分子标记对另外17份待测烟草材料进行验证并鉴别，因考虑篇幅，仅将部分结果如下表2所示：

表2

经本发明的分子标记nicas1及鉴定方法进行检测，在待测的17份待测烟草材料中，基因型与表型相符的一共17份，其中AA基因型的烟草材料9份，GG基因型的烟草材料8份，本发明的SNP标记及方法鉴别尼古丁含量高低的烟草材料，准确率高达100％。

实验例2：本发明的分子标记SNP位点在育种上应用

为了进一步确认该SNP位点在育种中的用处，本发明将高烟碱材料红花大金元(烟碱含量为21.4mg/g，基因型为AA)与低烟碱材料云烟87(烟碱含量为9.4mg/g，基因型为GG)进行杂交，种植收获到的F1种子。检测F2群体及F1个体的基因型及烟碱含量。检测基因型的方法为KASP标记方法，检测引物为nicas1-F1：

GTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCT(SEQ ID NO.1)，

nicas1-R1：

TGATAAAGTCAGGCGAAAACGA(SEQ ID NO.2)。

F2群体中GG基因型为54株，尼古丁含量均高于20mg/g。实验结果表明，用本发明的SNP位点检测F2群体的基因型和表型，准确率仍然达到100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记SHIC_ASM_7_116010945及其试剂盒

与应用

<130> P210716/YCN

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nicas1-F1引物

<400> 1

gtatcaagaa tcaaacagat ctgaattgat ttgtct 36

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nicas1-R1引物

<400> 2

tgataaagtc aggcgaaaac ga 22