一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法

技术领域

本发明涉及减肥保健食品检测领域，特别是涉及一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法。

背景技术

保健品理应只是起到保健作用，可以在一定程度上促进人体内新陈代谢，配合适量的运动起到维持身材的作用，但不能仅靠食用保健品而达到减肥的目的。不法商贩通过向标示带有减肥功效的保健品中添加相关违禁药物成分，使保健品可以起到立竿见影的“减肥疗效”从而欺骗消费者。并且为了更好的推广产品，违禁药物成分的添加量往往较高，消费者在不知情的情况下，短期内大量服用，会对身体造成极大的危害。

目前常用的治疗肥胖症的药物主要有两类：（1）作用于中枢的食欲抑制剂 此类药物又称厌食性药物，它是通过影响神经递质的活性，抑制食欲和提高基础代谢率来减重，如西布曲明。（2）作用于外周的脂肪酶抑制剂 通过阻断饮食中部分的吸收达到减肥目的，如奥利司他。

随着国家对违禁药物添加情况监管力度的加大，诸如西布曲明、酚酞等常见的非法添加药物成分越来越少，取而代之的是诸如奥利司他等具有毒性低、见效快、检测方法少等特点的药物成分，以求达到逃避监管的非法目的。

对于保健食品，尤其是减肥茶类食品中非法添加的奥利司他药物成分，现阶段检测方法主要分为以下两类：（1）仪器检测类。例如：红外光谱法、拉曼光谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法可用于检测保健食品中是否非法添加奥利司他该类药物成分，但是该类方法除需配备昂贵的大型仪器和大量辅助实验设备外，前处理过于繁杂耗时，使用成本高昂，对于市场即时得到结果的要求无法满足，无法应对质量监管发展需求，不适用于基层人员使用；（2）非仪器检测。申请号为CN201510804600.8，专利名称为《一种奥利司他的快速检测方法》公开了利用显色法检验中成药和保健食品中是否非法添加奥利司他药物成分。但是该方法仅可作为实验室内控检测纯品奥利司他，专属性差；中成药和保健品中成分复杂，采用该方法进行检测，结果易被同类相近性质物质影响，极易出现假阳性，抗干扰性差，准确度低，极易出现误判。并且检测结果无法进行数据记录，只可作为参考，无法追溯，实际检测应用中不适用于监督检测要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法，包括以下：

步骤a，取一次使用量的待测样品，取出内容物，研磨成粉状，置于容器内，加入纯净水和硫酸镁，振荡混合后，静置，过微孔滤膜过滤，将滤液转移至离心管中，得到第一样液；

步骤b，固相萃取：使用活化剂对C18固相萃取小柱进行活化处理，取第一样液负压上样，依次使用水、第一淋洗液进行负压淋洗，采用洗脱液进行负压洗脱，得到第二样液，将第二样液氮气吹干，得到第一待测物，活化剂和第一淋洗液均为体积分数为20%的甲醇水溶液，洗脱液为体积分数为90%的甲醇水溶液；

步骤c，向第一待测物中加入一定量的己烷，待第一待测物充分复溶后再次加入己烷补充溶液体积至2ml，混摇3~4次，得到第一样液，向第一样液中加入盐酸溶液，混合均匀，在一定温度条件下水浴反应，反应完毕后，取出冷却至室温，得到第三样液，将第三样液吹干，得到第二待测物；反应式如下：

该反应中盐酸既起催化作用，也参与反应，奥利司他的结构中含有酰胺键，盐酸对奥利司他进行开环反应，生成羧酸基团和羟基基团，并将酰胺键中的亚氨基转化为铵根离子，生成第二待测物，提高了反应效率的同时使其变为不可逆的完全反应，与现已公开的专利方法中强碱开环相比，专属性更强，反应效率更高，副产物较少且无干扰。

步骤d，向第二待测物中加入干燥的四氢呋喃溶液，复溶第二待测物后，加入对甲基苯异氰酸酯，在120℃油浴条件下加热10min，后降至80℃加热20min进行反应，得到第三样液，反应式如下：

该反应中四氢呋喃为催化剂，第二待测物的羧酸基团与对甲基苯异氰酸酯的异氰酸酯基团在四氢呋喃的催化下发生反应，生成氨基甲酸酯基团，便于后续与乙酰胆碱酯酶农残检测试剂反应。

步骤e，将第三样液转移至旋转蒸发器中蒸干，得到第三待测物，加入甲醇或乙醇复溶第三待测物，得到待测样液；

步骤f，取纯净水作为空白对照液，取待测样液、空白对照液分别与乙酰胆碱酯酶农残检测试剂反应，利用分光光度计在412nm波长条件下测定反应后的待测样液、空白对照液的分光光度值，并计算待测样液对乙酰胆碱酯酶的抑制率；

步骤g，待测样液对乙酰胆碱酯酶的抑制率大于等于于50%，判定为阳性，即待测样品中非法添加有奥利司他药物成分；待测样液对乙酰胆碱酯酶的抑制率小于50%，判定为阴性，即待测样品中没有添加奥利司他药物成分。

本发明的有益效果：本发明的检测方法不需要使用大型检测仪器，分析成本低，方法灵敏度高，专属性强，抗干扰能力突出，检测结果最终通过分光光度计读取，可以有效保留检测数据，通过数据的保留可以建立溯源系统，给日常监督监管工作提供了结果追溯的途径，检测结果灵敏度高，极大得降低了假阳性，检测用时短，通过固相萃取及多次溶剂萃取浓缩，极大的提高了检出限，适用于对中药类减肥保健品中违法奥利司他的定性检测。

在一些实施方式中，待测样品为固体减肥保健品或半固体减肥保健品，待测样品为减肥茶或减肥胶囊中的一种。

在一些实施方式中，步骤a中微孔滤膜的孔径为0.45μm。

在一些实施方式中，步骤b中C18固相萃取小柱的填料粒径为40~60μm， C18固相萃取小柱的孔径为120A，C18固相萃取小柱的规格为600mg/3ml。

在一些实施方式中，步骤b中上样流速为1.0ml/min，第一淋洗液的淋洗流速为1.0ml/min，洗脱液的洗脱流速为1.0-1.5 ml/min。

在一些实施方式中，步骤c中盐酸溶液的摩尔浓度为1.0-1.5mol/L。

在一些实施方式中，步骤c中水浴反应的温度为85℃。

在一些实施方式中，乙酰胆碱酯酶农残检测试剂包括乙酰胆碱酯酶、底物、显色剂和缓冲液，乙酰胆碱酯酶农残检测试剂为购买的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂或自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂。

在一些实施方式中，自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂中底物为碘化乙酰硫代胆碱，自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂中显色剂为二硫代二硝基苯甲酸和碳酸氢钠的混合物，自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂中缓冲液为pH=8的磷酸盐缓冲液。

在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾以11.9:3.2的质量比混合，并定容至1L。

附图说明

图1为本发明的一种实施方式的一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法的自制酶液的稳定性数据表。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例中甲醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯甲醇，乙醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙醇，盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯盐酸，二硫代二硝基苯甲酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的97%的2，2-二硫二苯甲酸，碳酸氢钠选择国药集团化学试剂有限公司供应分析纯碳酸氢钠，四氢呋喃选择国药集团化学试剂有限公司供应分析纯四氢呋喃，对甲基苯异氰酸酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%的对甲基苯异氰酸酯，己烷选择国药集团化学试剂有限公司供应分析纯己烷，硫酸镁选择国药集团化学试剂有限公司供应分析纯硫酸镁，磷酸氢二钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯磷酸氢二钾，磷酸二氢钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯磷酸二氢钾；

3.25%-3.5%的氢氧化钠水溶液的配制：称取16.25g-17.5g氢氧化钠放入烧杯中，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入500mL容量瓶，然后定容至刻度线；

1mol/L的盐酸溶液的配制：量取43ml 36%盐酸倒入烧杯，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入500mL容量瓶，然后定容至刻度线；

1.5 mol/L的盐酸溶液的配制：量取64.5ml 36%盐酸倒入烧杯，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入500mL容量瓶，然后定容至刻度线；

自制的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂：

磷酸盐缓冲溶液的配制：取11.9g磷酸氢二钾溶液与3.2g磷酸二氢钾等体积混合，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入1L容量瓶，然后定容至刻度线并调节pH值至8；

显色剂的配制：取160mg二硫代二硝基苯甲酸与15.6mg 碳酸氢钠混合，用20ml磷酸盐缓冲溶液溶解后使用，单次使用量为100ul；

底物的配制：取25mg碘化乙酰硫代胆碱溶解于3ml蒸馏水中，单次使用量为100ul；

酶液的配制：

10 U/ml储备液：将500 U/mg的AChE（乙酰胆碱酯酶）灰白色固体粉末用缓冲液A溶解，定容至50 ml量瓶中，摇匀即得；

0.22 U/ml工作液：取220 μl的10 U/ml储备液，用缓冲液B溶解，定容至10 ml量瓶中，摇匀即得。

其中，缓冲液A：50 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），pH 8.0；

称取3.03 g Tris（三羟甲基氨基甲烷），精密称定，加入到375 ml去离子水中，在电磁搅拌下滴加浓盐酸至pH 8.0 (25℃)，再向其中加入去离子水，定容至500 ml量瓶中，即得。

缓冲液B：50 mM Tris-HCl，pH 8.0，含有0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），用来稳定酶；

称取0.05 g BSA，精密称定后用缓冲液A溶解，定容至50 ml量瓶中，摇匀即得（轻摇，防止产生气泡）。

以下实施例2-8均采用本实施例1中的试剂。

实施例2

本发明的一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法，包括以下：

步骤a，取一次使用量的减肥茶样品，取出内容物，研磨成粉状，置于三角瓶内，向三角瓶内加入20ml纯净水和0.2g硫酸镁，振荡3min使其充分混合后，静置5min，过0.45μm微孔滤膜过滤，将滤液转移至50ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，固相萃取：加入6ml体积分数为20%的甲醇水溶液对规格为600mg/3ml、填料粒径为40μm、孔径为210A的C18固相萃取小柱进行活化处理，取第一样液以1.0ml/min的流速负压上样，上样完毕后，依次使用6ml水、6ml体积分数为20%的甲醇水溶液以1.0ml/min的流速进行负压淋洗，采用6ml体积分数为90%的甲醇水溶液对C18固相萃取小柱以1.0ml/min进行负压洗脱，得到第二样液，将第二样液于60℃下氮气吹干，得到第一待测物；

步骤c，向第一待测物中加入0.2ml己烷，待第一待测物充分复溶后再次加入己烷补充溶液体积至2ml，混摇3~4次，得到第一样液，向第一样液中加入1ml 1.0mol/L的盐酸溶液，混合均匀，在85℃温度条件下水浴反应25min，反应完毕后，取出冷却至室温，得到第三样液，将第三样液在50℃条件下氮气吹干，得到第二待测物；

步骤d，向第二待测物中加入5ml干燥的四氢呋喃溶液，复溶第二待测物后，加入0.2ml对甲基苯异氰酸酯，在120℃油浴条件下加热10min，后降至80℃加热20min，得到第三样液；

步骤e，将第三样液转移至旋转蒸发器中蒸干，得到第三待测物，加入0.2ml甲醇复溶第三待测物，得到待测样液；

步骤f，乙酰胆碱酯酶农残检测试剂选择购买市场上现有的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂，按照乙酰胆碱酯酶农残检测试剂的说明书配制显色剂、底物溶液和显色剂，取纯净水作为空白对照液，取2.5ml空白对照液和2.5ml待测样液，向其中分别加入100μl酶液和100μl显色剂，振荡混匀，37℃下静置反应10min，再加入100μl底物溶液，将空白对照液转移至比色皿中，放入农残检测仪相应通道在412nm波长条件下，测定3min内吸光度变化值ΔA

步骤g，该待测样液的抑制率大于50%，判定为阳性，即减肥茶样品中非法添加有奥利司他药物成分。

实施例3

本发明的一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法，包括以下：

步骤a，取一次使用量的减肥胶囊样品，取出内容物，研磨成粉状，置于三角瓶内，向三角瓶内加入30ml纯净水和0.5g硫酸镁，振荡3min使其充分混合后，静置5min，过0.45μm微孔滤膜过滤，将滤液转移至50ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，固相萃取：加入6ml体积分数为20%的甲醇水溶液对规格为600mg/3ml、填料粒径为60μm、孔径为210A的C18固相萃取小柱进行活化处理，取第一样液以1.0ml/min的流速负压上样，上样完毕后，依次使用6ml水、6ml体积分数为20%的甲醇水溶液以1.0ml/min的流速进行负压淋洗，采用6ml体积分数为90%的甲醇水溶液对C18固相萃取小柱以1.5 ml/min进行负压洗脱，得到第二样液，将第二样液于60℃下氮气吹干，得到第一待测物；

步骤c，向第一待测物中加入0.2ml己烷，待第一待测物充分复溶后再次加入己烷补充溶液体积至2ml，混摇3~4次，得到第一样液，向第一样液中加入1ml 1.5mol/L的盐酸溶液，混合均匀，在85℃温度条件下水浴反应25min，反应完毕后，取出冷却至室温，得到第三样液，将第三样液在50℃条件下氮气吹干，得到第二待测物；

步骤d，向第二待测物中加入5ml干燥的四氢呋喃溶液，复溶第二待测物后，加入0.5ml对甲基苯异氰酸酯，在120℃油浴条件下加热10min，后降至80℃加热20min，得到第三样液；

步骤e，将第三样液转移至旋转蒸发器中蒸干，得到第三待测物，加入1.0ml乙醇复溶第三待测物，得到待测样液；

步骤f，乙酰胆碱酯酶农残检测试剂选择自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂，取纯净水作为空白对照液，取2.5ml空白对照液和2.5ml待测样液，向其中分别加入100μl酶液和100μl显色剂，振荡混匀，37℃下静置反应10min，再加入100μl底物溶液，将空白对照液转移至比色皿中，放入农残检测仪相应通道在412nm波长条件下，测定3min内吸光度变化值ΔA

步骤g，该待测样液的抑制率小于50%，判定为阴性，即该减肥胶囊样品中没有非法添加奥利司他药物成分。

实施例4

本发明的一种中药类减肥保健品中非法添加奥利司他药物成分的检测方法，包括以下：

步骤a，取一次使用量的减肥糖果压片样品，取出内容物，研磨成粉状，置于三角瓶内，向三角瓶内加入25ml纯净水和0.35g硫酸镁，振荡3min使其充分混合后，静置5min，过0.45μm微孔滤膜过滤，将滤液转移至50ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，固相萃取：加入6ml体积分数为20%的甲醇水溶液对规格为600mg/3ml、填料粒径为50μm、孔径为210A的C18固相萃取小柱进行活化处理，取第一样液以1.0ml/min的流速负压上样，上样完毕后，依次使用6ml水、6ml体积分数为20%的甲醇水溶液以1.0ml/min的流速进行负压淋洗，采用6ml体积分数为90%的甲醇水溶液对C18固相萃取小柱以1.25 ml/min进行负压洗脱，得到第二样液，将第二样液于60℃下氮气吹干，得到第一待测物；

步骤c，向第一待测物中加入0.2ml己烷，待第一待测物充分复溶后再次加入己烷补充溶液体积至2ml，混摇3~4次，得到第一样液，向第一样液中加入1ml 1.25mol/L的盐酸溶液，混合均匀，在85℃温度条件下水浴反应25min，反应完毕后，取出冷却至室温，得到第三样液，将第三样液在50℃条件下氮气吹干，得到第二待测物；

步骤d，向第二待测物中加入5ml干燥的四氢呋喃溶液，复溶第二待测物后，加入0.35ml对甲基苯异氰酸酯，在120℃油浴条件下加热10min，后降至80℃加热20min，得到第三样液；

步骤e，将第三样液转移至旋转蒸发器中蒸干，得到第三待测物，加入0.6ml乙醇复溶第三待测物，得到待测样液；

步骤f，乙酰胆碱酯酶农残检测试剂选择自配的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂，取纯净水作为空白对照液，取2.5ml空白对照液和2.5ml待测样液，向其中分别加入100μl酶液和100μl显色剂，振荡混匀，37℃下静置反应10min，再加入100μl底物溶液，将空白对照液转移至比色皿中，放入农残检测仪相应通道在412nm波长条件下，测定3min内吸光度变化值ΔA

步骤g，该待测样液的抑制率等于50%，判定为阳性，即该减肥糖果压片样品中非法添加有奥利司他药物成分。

实施例5 自制的乙酰胆碱酯酶农残检测试剂的稳定性实验

（1）自制酶液的稳定性实验

本实施例中选择初始活性（以空白对照值计）为0.712的酶作为观测酶试剂，使用外购底物、空白对照液和待测样液，酶液配制后于冷藏 3-8℃条件下存放，使用时恢复至室温，分别在酶试剂配制好后第0m、第1m、第3m、第6m、第9m、第12m、第13m、第14m，参照实施例1中步骤f的测定方法，对空白对照液、待测样液进行吸光度变化值测定，并计算抑制率，得到如下表1和图1。

表1 自制酶液的稳定性实验数据

配制浓度分别为1.0 mg/kg、0.5mg/kg的甲萘威标准使用液（1.0mg/kg为常规酶试剂检出限，抑制率应大于50%），作为参比药物成分，酶液配制后于冷藏 3-8℃条件下存放，使用时恢复至室温，将酶试剂配制好后第0m、第1m、第3m、第6m、第9m、第12m、第13m、第14m的时间依次对应编号为1~8，参照实施例1中步骤f的测定方法，使用自制酶试剂进行空白对照液、1.0 mg/kg、0.5mg/kg甲萘威标准使用液的吸光度变化值测定，并计算抑制率，得到下表2。

表2 不同活性酶的比对实验

通过表2，可以直接得出乙酰胆碱酯酶随着配制时间的延长，其酶活性逐渐下降，且下降速率随着时间的推移逐渐加快，并且乙酰胆碱酯酶在配置后12个月内，测定阳性结果抑制率均高于50%，阴性结果低于50%，可以正常使用，说明酶活稳定性较好。12个月后活性计量值降低至0.3左右，此时由于活性过低，较易被低浓度氨基甲酸酯类成分抑制，而导致假阳性，所以为保证结果准确度，本次酶的活性有效期不超过12月个月。

（2）不同温度条件下酶活性的稳定性实验

本实施例中使用批号为20210119的乙酰胆碱酯酶作为酶试剂，使用空白对照液，使用自制底物，参照实施例1中步骤f的测定方法，在湿度66%、酶液pH值为8.0的条件下，在不同温度条件下：17℃、20℃、29℃、35℃、42℃、45℃，对空白对照液进行吸光度变化值ΔA测定，得到下表3。

表3 不同温度条件下酶活性数据表

通过上述表3，可以直接得出，在20℃-42℃下，乙酰胆碱酯酶的酶活性保持稳定。

（3）不同湿度条件下酶活性的稳定性实验

本实施例中使用批号为20210119的乙酰胆碱酯酶作为酶试剂，使用空白对照液，使用自制底物，参照实施例1中步骤f的测定方法，在温度29℃、酶液pH值为8.0的条件下，在不同湿度条件下：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，对空白对照液进行吸光度变化值ΔA测定，得到下表4。

表4不同湿度条件下酶活性数据表

通过上述表4，可以直接得出，在湿度20%-90%条件下，乙酰胆碱酯酶的酶活性保持稳定。

（4）不同pH值条件下酶活性的稳定性实验

本实施例中使用批号为20210119的乙酰胆碱酯酶作为酶试剂，使用空白对照液，使用自制底物，参照实施例1中步骤f的测定方法，在温度29℃、湿度67%的条件下，在不同pH值条件下：6.8、7.0、7.4、7.8、8.0、8.4，对空白对照液进行吸光度变化值ΔA测定，得到下表5。

表5不同pH值条件下酶活性数据表

通过上述表5，可以直接得出，在pH值为7.8-8.0的酶液条件下，乙酰胆碱酯酶的酶活性保持稳定。

实施例7自制乙酰胆碱酯酶农残检测试剂的酶添加量实验

本实施例中使用批号为20210119的乙酰胆碱酯酶作为酶试剂，使用空白对照液，使用自制底物，以实施例5中浓度为1.0 mg/kg、0.5mg/kg的甲萘威标准使用液（1.0mg/kg为常规酶试剂检出限，抑制率应大于50%），作为参比药物成分，参照实施例1中步骤f的测定方法，在温度29℃、湿度67%的条件下，按照不同酶液添加量20μl、50μl、80μl、100μl、200μl，对空白对照液、1.0 mg/kg、0.5mg/kg甲萘威标准使用液的吸光度变化值测定，并计算抑制率，得到下表6。

表6 酶液添加量实验数据表

由表6结果可知，酶试剂用量直接接影响后续检测的准确性，以本批次自制酶试剂为例，满足阳性（≥1ppm）及阴性（＜1.0ppm）的情况下，选择100μl为宜。

实施例8自制乙酰胆碱酯酶农残检测试剂中酶液与显色剂混合时间实验

本实施例中使用批号为20210119的乙酰胆碱酯酶作为酶试剂，使用空白对照液，使用自制底物，以实施例5中浓度为1.0 mg/kg、0.5mg/kg的甲萘威标准使用液（1.0mg/kg为常规酶试剂检出限，抑制率应大于50%），作为参比药物成分，参照实施例1中步骤f的测定方法，在温度29℃、湿度67%、酶液添加量为100μl的条件下，按照酶液与显示剂混合时间为15min、10min、8min、5min、3min，对空白对照液、1.0 mg/kg、0.5mg/kg甲萘威标准使用液的吸光度变化值测定，并计算抑制率，得到下表7。

表7 酶液与显色剂混合时间实验数据表

由表7结果可知，混合时间间接影响了后续检测的准确性，以本批次自制酶试剂为例，满足阳性（≥1ppm）及阴性（＜1ppm）的情况下，选择酶液与显色剂的混合时间为10min为宜。

本发明的检测方法不需要使用大型检测仪器，分析成本低，方法灵敏度高，专属性强，抗干扰能力突出，检测结果最终通过分光光度计读取，可以有效保留检测数据，通过数据的保留可以建立溯源系统，给日常监督监管工作提供了结果追溯的途径，检测结果灵敏度高，极大得降低了假阳性，检测用时短，通过固相萃取及多次溶剂萃取浓缩，极大的提高了检出限，适用于对中药类减肥保健品中违法奥利司他的检测。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。