银离子空间分布可控的载银羟基磷灰石微粒及其制备方法

技术领域

本发明属于抗菌剂制备技术领域，涉及到一种载银羟基磷灰石微粒，特别涉及到一种银离子空间分布可控的载银羟基磷灰石微粒及其制备方法。

背景技术

无机抗菌剂现阶段发展十分迅速，在安全性和持久性方面均具有优势，是目前抗菌技术的主要研发领域。银离子为代表的银系抗菌剂由于具有广谱以及高的抗菌活性，且毒性较小，应用极为广泛。但由于银离子本身所具有的物理化学特性，如易溶于水、氧化性强、光稳定性差等，使得银离子基抗菌剂在实际的应用中存在诸多限制，例如，在利用双螺杆挤出制备含银离子抗菌高分子母粒时，银离子在高温下可能会和树脂以及有机助剂等还原性物质反应，从而导致变色现象的发生。银离子基抗菌剂应用于基体表面抗菌时，在可见光激发下会导致光致变色，银离子转化为单质银而使抗菌活性降低。具体可以归纳为以下几个主要问题：1、遇光、长期保存或特定工艺制造易变色；2、易溶出导致抗菌时效短；3、容易被还原成单质银导致抗菌作用减弱。现有技术当中通常将银负载在某些惰性材料上，以求解决上述问题，但同时亦会带来其他严重缺陷，可具体参见以下专利技术方案：

方案1：CN 107258812 A；CN 101182689，介绍了一种银离子取代沸石中的钠离子，形成载银沸石的技术方案。

方案2：CN 106280639 A介绍了一种膨润土载银，手段是通过离子交换，将银离子引入膨润土层间制备抗菌材料。

方案3：CN 108385374 A介绍了一种介孔二氧化硅载银。

上述三个方案的缺陷在于银和载体之间结合力较弱，银离子容易溶出，会存在短时间内银离子浓度急剧上升进而引起生物毒性的问题，另外银离子抗菌剂抗菌效果的持久性也会受到损伤。

方案4：磷酸盐载银抗菌剂，具有代表性的技术路线主要包括：1、羟基磷灰石载银(CN 102669178；CN 101390524 A；Keskar M,Sabatini C,Cheng C,et al.Synthesis andcharacterization of silver nanoparticle-loaded amorphous calcium phosphatemicrospheres for dental applications[J].Nanoscale Advances,2019.)；2、磷酸钙载银(Rao G V,Shashikala H D.Optical,dielectric and mechanical properties ofsilver nanoparticle embedded calcium phosphate glass[J].Journal of Non-Crystalline Solids,2014,402:204-209.)；3、磷酸锆盐载银(邹冬梅,施利毅,张大卫.载银羟基磷酸锆钠抗菌剂的制备[J].上海大学学报(自然科学版),2006(03):288-291.)。

方案4的技术缺陷主要体现在：磷酸盐载银抗菌剂的制备通常是通过高温处理使得银离子进入磷酸盐的晶格中，因此银离子在磷酸盐晶格中具有良好稳定性，能以很小的速度释放，具有持久的抗菌性。但是，高温烧结导致这类抗菌剂颗粒较大，粒度分布不均匀，银离子释放速度并不能得到有效调控。

羟基磷灰石(Ca

目前，在现有技术文献当中我们可知，能够利用酵母菌、大肠杆菌细胞等为模板制备氧化锌和氧化锆空心球/管(参考文献吕伟,周明,刘长隆.微生物模板辅助制备ZnO空心微球[J].材料导报,2012,26(022):23-26.)，以及二氧化钛(CN 101711977 A，He,T.；Weng,Y.；Yu,P.；Liu,C.；Lu,H.；Sun,Y.；Zhang,S.；Yang,X.；Liu,G.,Bio-Template Mediated InSitu Phosphate Transfer to Hierarchically Porous TiO

因此，有必要提供改进的技术方案，以克服现有技术当中所存在的相应技术问题或不足。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种有效的复合材料，不仅有效隔离银离子和环境介质之间的化学反应，而且能够精确调控银离子的释放速率，从而达到同时兼顾抗菌活性、抗菌持久性以及生物安全性等这些决定其应用性能的重要参数。

为了达到上述目的，本发明提供了一种载银羟基磷灰石微粒的制备方法，以及通过上述制备方法而得到的相应载银羟基磷灰石微粒，其具有银离子空间分布可控的特性。具体为：

一种银离子空间分布可控的载银羟基磷灰石微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将可溶性钙盐和/或银盐加入到微生物细胞分散液当中，使得钙离子和/或银离子吸附在微生物细胞表面；其中所述微生物细胞表面包含磷壁酸；

步骤二：将步骤一所得溶液滴入足量可溶性磷酸盐溶液中，使得吸附在微生物细胞表面的银离子和/或钙离子转换成难溶盐磷酸银和/或羟基磷灰石壳层；

步骤三：向步骤二所得溶液滴入可溶性钙盐和/或银盐，进而继续生成难溶的磷酸盐沉淀；

步骤四：重复上述步骤，直至磷酸盐无机壳层厚度增加到所需要求时停止。

对于负载型银离子抗菌剂，银离子的释放速率主要取决于：(1)银离子与载体之间的作用形式，如通过物理或/和化学吸附分布在载体表面、或多孔载体的孔洞内部，以晶体缺陷的形式嵌入载体晶格内部，如取代缺陷(占据其他离子的晶格格点位置)或者填隙缺陷(位于晶格间隙)；(2)银离子在载体内部的空间分布，银离子在载体颗粒内部分布位置不同，其在颗粒内部的扩散阻力不同，从而影响银离子的释放速率；(3)载体颗粒性质，如粒径越大比表面积越小，银离子在载体内部扩散阻力则越大，银离子释放越慢。

本发明所提供的技术方案是利用微生物细胞表面的磷壁酸对Ag

优选的，所述可溶性磷酸盐溶液的PH值为7～14。在碱性条件下，将获得羟基磷灰石，并且更优选的PH值为12。

优选的，所述可溶性磷酸盐选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵及水合物中的一种或几种。

优选的，所述银盐为水溶性银盐，所述水溶性银盐选自硝酸银。

优选的，所述钙盐选自水溶性无机钙盐和/或有机酸钙盐；所述水溶性无机钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、其水合物中的一种或几种；所述有机酸钙盐选自油酸钙、硬脂酸钙中的一种或两种。

优选的，所述微生物细胞为革兰氏阳性菌。进一步优选的，所述微生物细胞为金黄色葡萄球菌。

本发明还提供了一种载银羟基磷灰石微粒，其特征在于，根据上述银离子空间分布可控的载银羟基磷灰石微粒的制备方法制得。

优选的，所述载银羟基磷灰石微粒为粒径400nm～1000nm的球形或类球形。

本发明还提供了一种通过上述载银羟基磷灰石微粒制备而得到抗菌材料或制品；所述抗菌材料为生物医学材料、高分子材料、油漆涂料或丝线，所述制品为医疗器械、食品包装、塑料制品或纺织制品。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于工业化生产。本发明所述制备方法制备的载银羟基磷灰石微粒可作为无机抗菌剂用于塑料、化纤、油墨、涂料、生物可降解高分子材料、食品包装材料的抗菌助剂，还可作为生物医用材料用于药物输送、蛋白吸附以及用作牙和骨组织修复材料等领域，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为载银羟基磷灰石微粒的扫描电镜(SEM)照片。

图2为载银羟基磷灰石微粒的扫描电镜(SEM)照片。

图3为Ag-HA-HA制备过程中利用XRD跟踪逐层沉淀反应和沉淀转化的过程。

图4为Ag-HA-HA制备过程中逐层沉淀反应和沉淀转化示意图。

图5为三种载银羟基磷灰石微粒中Ag

图6为载银羟基磷灰石微粒的EDSmapping图。

图7为载银羟基磷灰石微粒的XRD图。

图8为三种载银羟基磷灰石微粒样品表面Ca、P、O和Ag的原子个数比的变化趋势。

图9为载银羟基磷灰石微粒浸泡液中Ag

图10为载银羟基磷灰石微粒浸泡液中Ag

图11为载银羟基磷灰石微粒对金黄色葡萄球菌的抑菌圈照片。

图12为载银羟基磷灰石微粒对大肠杆菌的抑菌圈照片。

具体实施方式

为了进一步说明，本发明通过提供下述实施例以求本领域技术人员能够对本发明的宗旨进行清楚地理解。但应当注意，下述各实施例并非是对本发明技术方案的限定，本领域技术人员在对各实施例进行分析和理解的同时，可结合现有知识对本发明提供的技术方案做一系列变形与等效替换，该变形与等效替换而得的新的技术方案亦被本发明囊括在内。

由于本发明无法对实施例进行穷举，因此一些优选的技术特征和优选的技术方案可以进行合理的相互替换或组合，由此而得的新的技术方案亦被囊括在本发明之中。

由于本发明针对的是复合材料，其特点体现在品种众多但因为系同一种类而故特性上具备一定程度的一致性，本领域技术人员有能力进行合理的推测，以使得本发明思想在本发明技术方案中提供的范围内适用。

为了使阅读者更好的理解本发明宗旨，特例举最具代表性的一系列实验数据。阅读者在阅读时应当具备本领域内的一般技术知识，以方便准确的理解数据中所包括的逻辑关系。

下各实施例涉及到的步骤可以归纳为：

(1)金黄色葡萄球菌的培养和分离：先配置1L菌种培养液，并置于高压灭菌锅灭菌20～30min，然后将菌种接入已灭菌的培养液中，120～200rpm转速、37℃条件下摇床培养12～56h，得到1L光学浓度OD

(2)将步骤1得到的细菌颗粒分散于去离子水中。

(3)将水溶性银盐、钙盐的混合溶液或者单一组分盐溶液加入到步骤2得到的菌液中，持续搅拌、涡旋使银离子和/或钙离子在细菌颗粒表面吸附平衡。

(4)将步骤3获得的分散液逐滴加入到一定浓度一定pH的磷酸盐溶液中，引发无机沉淀反应，在细菌颗粒表面生成难溶磷酸盐壳层。

(5)将水溶性银盐、钙盐的混合溶液或者单一组分盐溶液加入到步骤4得到的分散中，持续搅拌、涡旋使银离子和/或钙离子在细菌颗粒表面吸附平衡。

(6)重复上述步骤3～5，改变负载层数，改变壳层厚度。

(7)将步骤6制备得到的产物进行分离、乙醇清洗，分散于聚乙二醇-400或聚乙二醇-600中，借助超声使分散均匀，并经过200℃的高温处理。

(8)将步骤7制备得到的产物进行分离、乙醇清洗、干燥得到载银羟基磷灰石微粒。

下述实施例以Ca(NO

实施例1

在室温下将1L光学浓度OD

实施例2

本实施例与实施例1大致相同，在室温下将1L光学浓度OD

实施例3

本实施例与实施例1大致相同，在室温下将1L光学浓度OD

实施例4

本实施例与实施例1大致相同，在室温下将1L光学浓度OD

实施例5

本实施例与实施例1大致相同，在室温下将1L光学浓度OD

综合上述实施例我们可知，上述方法采用水溶性银盐、钙盐和磷酸盐为原料，综合利用微生物模板表面官能团对金属离子的锚定作用、逐层无机沉淀反应、沉淀转化反应等技术手段实现抗菌剂微粒粒径以及银离子空间分布的可调控性。详细的，由于微生物细胞表面官能团特别是磷壁酸对金属离子具有强的化学键合作用，首先将表面锚定了Ag

所述水溶性钙盐可采用常用的水溶性钙盐，例如氯化钙、硝酸钙等；应理解为可采用一种水溶性钙盐，也可采用两种及以上的可溶性钙盐；此外还应理解为可以采用水溶性钙盐水合物，例如Ca(NO

所述的磷酸盐可采用常见的磷酸盐，包括但不限于磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵。应理解可采用一种磷酸盐，也可采用两种以上的磷酸盐；此外还应理解为可以采用磷酸盐的水合物，例如Na

所述的微生物细胞主要采用表面含有磷壁酸的革兰氏阳性菌种，特别是金黄色葡萄球菌。

我们选取了三种典型样品进行表征：分别为Ag主要分布于羟基磷灰石壳层内部(Ag-HA-HA)、Ag主要分布于羟基磷灰石壳层中间(HA-Ag-HA)以及Ag负载于羟基磷灰石表面(HA-HA-Ag)的球形颗粒样品。对于这三种样品，Ag在羟基磷灰石颗粒中的分布示意图如图5所示。

图6为样品颗粒基于能谱EDS的元素分布图(element mapping)。如图所示，N元素来自于微生物细胞本身，因此N的元素分布图显示的是金黄色葡萄球菌细胞的形态图，而Ca和P来自于羟基磷灰石，且Ca、P的元素分布图与样品SEM图中球形颗粒的形状和位置完全相同，证明羟基磷灰石是以金黄色葡萄球菌细胞为模板进行生长。对比这三个样品，Ag的元素分布图却不尽相同：对于样品Ag-HA-HA和HA-Ag-HA，Ag元素分布相对均匀，而对于Ag分布于外层的样品HA-HA-Ag，在银元素分布图中则出现局部的较大的点状光斑，表明银以大的聚集体颗粒的形式存在，XRD测试结果表明银对于Ag分布于外层的样品HA-HA-Ag，银的存在形式主要是磷酸银(图7)。

图7是这3个样品的XRD图谱，均给出了羟基磷灰石的(002)(对应2θ＝25.93°)、(211)(2θ＝31.77°)和(112)(对应2θ＝31°～32.3°)、(222)(对应2θ＝46.7°)、(213)(对应2θ＝46.7°)以及(004)(对应2θ＝53.35°)等晶面的衍射峰，确定该材料为羟基磷灰石(Ca

特别说明，在通过逐层沉淀反应生成银和/或钙的磷酸盐微粒时，本发明巧妙利用了磷酸难溶盐之间的原位转化反应(磷酸银转化为银离子负载的羟基磷灰石)，将银离子嵌入到特定位置(内层或中层)的羟基磷灰石壳层中，进而达到有效控制银离子释放速度的目的。以银位于内层的样品Ag-HA-HA的制备过程为例，利用XRD技术对制备过程中的逐层沉淀反应以及沉淀转化过程进行跟踪，如图3所示。当向最初生成了磷酸银壳层之后的反应体系中反复交替引入钙离子和磷酸根时，由图3可以看出磷酸银的衍射峰逐渐减弱并最终消失，取而代之的是出现了羟基磷灰石的衍射峰。这表明最初在金黄色葡萄球菌表面生成的磷酸银和后期加入的钙离子、磷酸根离子发生了沉淀转化反应，由磷酸银转化为溶解度更小的羟基磷灰石，而银离子则主要分布在位于内层的羟基磷灰石基体中(该过程示意图如图4所示)。

样品表面各元素原子个数比如下表：

XPS测试可以给出固体样品表面(通常<10nm深度范围内)所包含各元素的摩尔百分数。因此，基于这三个样品的XPS谱可以获得Ag、Ca、P、O在每个样品表面上的原子个数比，结果见表1和图8。由图8可以清

楚的看出，按样品顺序Ag-HA-HA→HA-Ag-HA→HA-HA-Ag，样品表面Ca、P和O元素的原子百分数依次减少，银的含量依次增大。由于银元素的负载量都是相同的，因此上述测试结果表明在这三个样品中存在银元素空间分布的不同，即对于Ag-HA-HA，由于银主要分布在内层，因此Ca，P和O在HA颗粒表面的含量是最大的，对于HA-HA-Ag，由于银主要分布于表面，因此Ca，P和O在HA颗粒表面的含量是最小的。

为了进一步确定三个样品的HA颗粒中存在银的空间分布的差异，我们又对这三种微粒的EDS元素分布图中Ca(P)分布图的直径R

为了评价三种样品银离子的释放速度，将相同质量的三种颗粒浸泡于等量去离子水中，每隔七天进行离心，收集上清液，并将沉淀再次浸泡于相同量的去离子水中，用原子吸收光谱测试浸泡液中Ag离子的浓度(图9)。由图9可以看出，在每次浸泡液中Ag离子的浓度的大小顺序(银离子释放速度)依次是：HA-Ag-HA>Ag-HA-HA>HA-HA-Ag。对于这三个样品，前三次浸泡液中银离子的浓度都是随浸泡次数的增加依次减小。但是在第四次及以后的浸泡过程中，对于银位于中部的样品HA-Ag-HA，Ag的释放量(对应释放速度)趋于稳定，而其他两个样品Ag的释放速度仍然在逐渐变小。影响银离子释放速度的因素主要有银的存在状态(银离子、银纳米颗粒)以及银在颗粒中的空间分布。对于前三次浸泡，银离子释放速度都随浸泡次数显著减小的原因可以归结为三个样品中以银离子形式存在的银(特别是分布于颗粒表面附近易扩散的银离子)的扩散溶出。银位于中部的样品的释放速度始终高于银位于内部的样品的释放速度，这可归结为磷酸钙壳层对银离子扩散的阻力的影响。而银位于外表面样品的银离子释放速度反而最低，这主要是因为银是以相对较大的磷酸银纳米颗粒的形式存在的原因。

为了进一步探究Ag的释放，我们又将质量相同的三种颗粒分别置于相同量的去离子水中，每隔一段时间取一定量的上清液测试原子吸收光谱，图10显示颗粒在不同时间段内释放Ag

为了定性检测样品抗菌性，针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌做了三个样品的抑菌圈测定，结果如图11、图12。三种样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性都十分明显，且三种样品针对两种微生物细胞的抑菌结果差异性不大。为了定量研究三个样品的抗菌性能，我们测试了三个样品对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC，内层、中层、外层三个样品的MIC分别为0.014wt％、0.007wt％、0.014wt％。

由此可见，本发明所具备的主要有益特点在于：

(1)从载银抗菌剂的结构和形态上来看，在本发明提供的羟基磷灰石颗粒中，银离子的空间分布具有可调控性，银离子可以主要分布于颗粒的内层，中层或者表面；

(2)从载银抗菌剂的结构和形态上来看，本发明提供的球形载银羟基磷灰石颗粒的粒径具有均一性，通常为400～1000nm；

(3)以上两点确保了本发明提供的载银离子抗菌剂的银离子释放速度具有可调控性，从而可以达到同时兼顾抗菌性、生物安全性以及化学稳定性等这些决定其应用性能的重要参数的目的；

(4)在制备方法方面，本发明提供了一个利用革兰氏阳性菌表面磷壁酸官能团作为金属离子锚定位点，从而控制难溶磷酸盐成核与生长的新思路；

(5)在制备方法方面，本发明在以革兰氏阳性菌表面作为难溶磷酸盐成核位点的前提下，综合利用逐层化学沉淀反应、沉淀转化反应以及控制银离子的加入实际从而实现了对难溶磷酸盐颗粒粒径以及银离子空间分布的调控。