鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒。

背景技术

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)隶属鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)，广泛分布于我国江河、湖泊、水库等自然水域。因其肉质鲜美、肌间刺少、营养价值高深受消费者的喜爱。20世纪90年代以来，黄颡鱼市场需求量急剧上涨，自然水域的产量难以满足，鱼类学家通过人工催产和授精突破了黄颡鱼大规模化人工繁育技术，推动了黄颡鱼产业的发展。在黄颡鱼养殖过程中，我国学者发现黄颡鱼雄鱼生长速度显著快于雌鱼，因此开拓出了一条分子标记辅助的全雄鱼培育技术路线，并培育出新品种全雄黄颡鱼“全雄1号”，极大提高黄颡鱼产量和经济效益。然而,亲本超雄鱼繁育系经过多代自交之后会生退化,自交系在生长和抗病等性能方面呈现减弱的趋势,此时需要对全雄黄颡鱼进行品种改良或开发出其他黄颡鱼新品种。

杂交育种是遗传育种中最经典的方法之一，瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼亲缘关系较近，个体远大于黄颡鱼，因此研究人员选取瓦氏黄颡鱼作为父本与黄颡鱼杂交，产生新品种“黄优1号”，其形态特征与黄颡鱼接近，生长速度与成活率优于黄颡鱼，受到养殖户的一致青睐。然而，由于人工养殖密度过大、环境变化等原因，鱼类养殖特别容易出现开春大规模死亡的情况，再加上黄颡鱼体表无鳞，在养殖过程中更易受到水体环境影响，开春死亡率特别高。通过选育个体更大的近缘物种长吻鮠作为父本与瓦氏黄颡鱼杂交，得到的后代可以在半年时间达到一年龄的黄颡鱼上市规格，这样可以在开春前上市，避免大规模死亡。在实际生产过程中，由于杂交种的形态特征与父母本非常接近，养殖过程会存在混杂现象，影响生产过程。

DNA分子标记是根据物种间DNA序列差异设计的引物，可准确鉴定物种，被广泛应用于物种鉴定、性别鉴定、亲子鉴定等领域。由于瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及杂交种外形相似，此前通过形态学方法对其进行鉴定存在较大困难和鉴定错误，因此设计出可以稳定、高效鉴别瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种的DNA分子标记，对于生产实践意义重大。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于能够提供一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒，旨在解决上述背景技术中关于无法高效鉴别瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种的问题，通过使用该引物在瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种中的PCR产物凝胶电泳图可直观的进行区分。

为了实现上述技术目的，本申请主要采用如下技术方案：

第一方面，本申请提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的引物，所述引物正向序列为：TTATCTGACAGAAGCACCAG；反向序列为：CAGTTACCACTTTGGACTAT。

第二方面，本申请提供了一种如权利要求1第一方面所述的快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的引物在鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种中的应用。

第三方面，本申请提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的方法，所述方法包括如下步骤：

提取待鉴定样本的DNA；

利用如第一方面所述的引物对提取的待测DNA进行PCR扩增；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳后条带位置判断鉴定样本种类。

第四方面，本申请提供了一种检测瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1第一方面所述的引物。

与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果：

本申请通过筛选得到了一对可以将瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种准确鉴定出来的引物。鉴定过程仅需剪取少量鳍条，提取组织DNA，使用该引物进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳即可。该方法具有准确可靠、成本较低、操作简单的优势，且不受制于鱼体的生长情况，可在各养殖阶段取样鉴定，对于实际生产具有重要意义。

附图说明

图1为本申请实施例提供的引物设计示意图；

图2为本申请实施例中公开提供的PCR扩增产物的凝胶电泳结果图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本申请实施例提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的引物，所述引物正向序列为：TTATCTGACAGAAGCACCAG；反向序列为：CAGTTACCACTTTGGACTAT。

本申请实施例提供了一种如上所述的快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的引物在鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种中的应用。

本申请实施例提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的方法，所述方法包括如下步骤：

提取待鉴定样本的DNA；

利用如上所述的引物对提取的待测DNA进行PCR扩增；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳后条带位置判断鉴定样本种类。

在一些实施例中，所述待鉴定样本以鱼的鳍条组织作为提取样本。

在一些实施例中，所述PCR扩增体系为10μL，包括5μL2xTaqMasterMix、0.5μL10uM的正反向引物、1μL DNA模板、3μL ddH2O。

在一些实施例中，根据权利要求3所述的快速鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的方法，所述PCR扩增程序为：在95℃预变性3-5min，然后进入循环扩增阶段：95℃40s，54℃30s，72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。

在一些实施例中，根据电泳后条带位置判断鉴定样本种类的方法为：若仅扩增出一条339bp的条带，则鉴定样本为瓦氏黄颡鱼；若仅扩增出一条730bp的条带，则鉴定样本为长吻鮠；若同时扩增出339bp、730bp两条条带，则鉴定样本为瓦氏黄颡鱼与长吻鮠的杂交种。

本申请实施例提供了一种检测瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和其杂交种的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物。

下面对本申请的应用原理做进一步详细说明。

引物的设计：

首先在组装、注释的瓦氏黄颡鱼基因组找到patj基因序列，将其比对到已发表的长吻鮠基因组得到与之对应的序列，然后，通过对两段序列作进一步比对，找到一段391bp的INDEL，如图1所示，根据这段DNA序列差异设计了可将瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种准确鉴定出来的引物。

其中，正向引物序列为：TTATCTGACAGAAGCACCAG；

反向引物序列为：CAGTTACCACTTTGGACTAT。

具体的，利用上述引物鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种的方法，采用以下实验方案：

1、材料与方法

(1)样本采集：取2年龄瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种各8尾，取样于武汉市水产研究所。

(2)组织DNA提取：使用TIANGEN(磁珠法)动物组织DNA提取试剂盒，具体流程如下：

(a)取鳍条组织10-50mg，剪碎，加入200μL组织消化液GHA、20μL蛋白酶k(20mg/ml)，65℃水浴消化30分钟至组织碎片消化完全。(如消化完仍有碎片，12000rpm离心1分钟去除杂质留上清液。)

(b)消化完成后冷却至室温，加入20μL RNase酶，55℃水浴10分钟，之后再次离心吸上清。

(c)加入300μL裂解液GHB，振荡均匀，75℃水浴15分钟，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。

(d)室温放置5分钟后加入350μL异丙醇，振荡混匀10秒。

(e)加入30μL磁珠悬浮液G，振荡混匀1分钟，每3分钟振荡混匀1分钟，共静置9分钟。

(f)将离心管放置在磁力架上静置30秒，吸去液体。

(g)加入700μL缓冲液GDA(加乙醇)，振荡混匀30秒。

(h)将离心管放置在磁力架上静置30秒，吸去液体。

(i)重复步骤g、h。

(j)加入700μL漂洗液PWD(加乙醇)，振荡混匀30秒。

(k)将离心管放置在磁力架上静置30秒，吸去液体。

(l)重复步骤j、k。

(m)将离心管置于磁力架上，室温晾干10-15分钟。

(n)将离心管从磁力架上取下，加入100-200μL洗脱缓冲液TB，振荡均匀，置于56℃水浴10分钟，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。

(o)将离心管放置于磁力架上静置2分钟，磁珠完全吸附后，小心地将DNA溶液转移至一个新的离心管中，4℃保存。

(p)测DNA浓度，跑1％的琼脂糖胶查看提取基因组DNA的完整性。将DNA浓度调整至50ng/μL。

(q)引物准备：在自己组装、注释的瓦氏黄颡鱼基因组找到patj基因序列，将其比对到已发表的长吻鮠基因组得到与之对应的序列，通过对两段序列的进一步比对，找到一段391bp的INDEL，根据这段DNA序列差异设计了可将瓦氏黄颡鱼、长吻鮠及其杂交种准确鉴定出来的引物。其中。正向引物序列为：TTATCTGACAGAAGCACCAG，反向引物序列为：CAGTTACCACTTTGG ACTAT。引物设计如见图1所示。

(r)PCR反应：使用该对引物分别在三个物种组织DNA中进行PCR扩增。PCR反应体系为10μL，包括5μL 2xTaqMasterMix、0.5μL正反向引物(10uM)、1μL DNA template、3μLddH2O。PCR程序：将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在95℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：95℃40s→54℃30s→72℃60s，循环30-35次，后在72℃保温7min。

(s)PCR产物电泳检测：根据产物大小选择制备1％的琼脂糖胶，将PCR产物混合Gel-re d染液后点样，200V、200A跑20分钟左右，取出凝胶放置在紫外照胶仪上观察条带情况。

2、结果

PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图2所示，从左到右第一个位置为marker(DL2000plus)，第2-6为长吻鮠，扩增条带大小为730bp；第7-11为瓦氏黄颡鱼与长吻鮠的杂交种，扩增出两条条带，条带大小分别为730bp，339bp；第12-16为瓦氏黄颡鱼，扩增条带大小为339bp。鉴定成功率为100％，可以准确鉴定以上三种物种。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。