一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及花叶病毒实时检测领域，具体涉及一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus， CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，它是目前发现的寄主范围最广、分布最广、危害最为严重的病毒之一，该属病毒可侵染 85 科365属1000多种植物。黄瓜花叶病毒主要由蚜虫以非持久性方式进行传播，烟田主要靠烟蚜（Myzus persicae）传播，因此发病速度极快，来势迅猛。

因而对于 CMV 的检测主要集中在病毒生物学鉴定、血清学检测、电镜技术、分子杂交、RT-PCR和实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检测等，而与实时荧光定量PCR技术相比，其他方法都存在耗时长、灵敏度低和不能对病毒进行定量检测等缺点。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高，同时可以对样本进行实时快速定量检测等优点。因此实时定量作为一个有效的实验方法，被应用于植物病毒的检测，然而现有的检测方法的步骤较繁琐且只能定性分析病毒是否存在，为此需要进一步对检测方法进行研究，从而实现耗时短、灵敏度高、定量检测以及特异性强的检测要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种实时荧光定量PCR技术（real-timefluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），耗时短，灵敏度高，定量检测，特异性强，从而克服现有技术中缺陷的用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，用于克服现有技术中缺陷。

本发明采用的技术方案为：一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

步骤一：引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中CMV的外壳蛋白基因保守序列EF417579.1和HSC70-1基因DV161835，根据引物和TaqMan探针设计原则，Primer Premier5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；其中，上游引物CMV-F： CGGAGTCCAAGCCAACAAT；下游引物CMV-R：GAAGTACCAGCTCATCCGTCTC；探针：FAM-ATATCAGCGCGCATC-MGB；所述的EF417579.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；

步骤二：烟草总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用EppendorfD30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；

步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中的PCR反应体系所产生的产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；提取的质粒用pMD™18-T Vector的通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应，从而得到PCR产物，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；

步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×10

步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得CMV终浓度为2.32×10

所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1g CMV烟草病毒样本，使用Trizol试剂提取总RNA，以健康烟草叶片为阴性对照。

所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2µl、Random Primer 1µl、DEPC-ddH2O 7µl，先65℃保育5min，快速置于冰上放置2min以上，后加入以下试剂：5×RTbuffer 5µl、RRI 0.5µl、M-MLV 1µl、dNTPmix 5µl、DEPC-ddH2O 3.5µl，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验。

所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq 10µl，10µmol/L的上下游引物各0.5µL，cDNA 2µl，ddH2O 7µl，反应程序依次为95℃预变性3min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。

所述的步骤三中PCR反应体系包括Premix Taq 10µl，BcaBEST SequencingPrimers 0.5µl，M13 Primers 0.5µl，质粒模板2µl，ddH2O 7µl。PCR反应程序依次为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，并进行35次循环，72℃后延伸10min。

所述的步骤五中利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量反应体系为20 µl：Probe qPCR Mix 10µl，10µmol/L的上下游引物各0.4µL，探针 0.8µl，ROXReference Dye II 0.2µl，质粒模板2µl，灭菌水6.2µl，反应依次为预变性：95℃30s，PCR反应95℃5s、57℃15s、72℃30s，并进行45次循环。

本发明有益效果是：本发明的方法快速简单，耗时短，灵敏度高，定量检测方便，特异性强，检测结果可靠，使得本发明的方法可作为黄瓜花叶育苗中CMV有症和隐症筛查的有效手段。

附图说明

图1为本发明的CMV标准曲线图。

图2为本发明的内参基因标准曲线图。

图3为本发明的扩增曲线图。

图4为本发明的RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

如图1、2、3、4所示，一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一：引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中CMV的外壳蛋白（coatprotein，CP）基因保守序列EF417579.1和HSC70-1基因DV161835，根据引物和TaqMan探针设计原则，Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；其中，上游引物CMV-F：CGGAGTCCAAGCCAACAAT；下游引物CMV-R：GAAGTACCAGCTCATCCGTCTC；探针：FAM-ATATCAGCGCGCATC-MGB，引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；所述的EF417579.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；步骤二：烟草总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中的PCR反应体系所产生的产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-TVector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；提取的质粒用pMD™18-T Vector的通用引物BcaBESTSequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应，从而得到PCR产物，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×10

所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1g CMV烟草病毒样本，使用Trizol试剂提取总RNA，以健康烟草叶片为阴性对照。

所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2µl、Random Primer 1µl、DEPC-ddH2O 7µl，先65℃保育5min，快速置于冰上放置2min以上，后加入以下试剂：5×RTbuffer 5µl、RRI 0.5µl、M-MLV 1µl、dNTPmix 5µl、DEPC-ddH2O 3.5µl，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验。

所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq 10µl，10µmol/L的上下游引物各0.5µL，cDNA 2µl，ddH2O 7µl，反应程序依次为95℃预变性3min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。

所述的步骤三中PCR反应体系包括Premix Taq 10µl，BcaBEST SequencingPrimers 0.5µl，M13 Primers 0.5µl，质粒模板2µl，ddH2O 7µl。PCR反应程序依次为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，并进行35次循环，72℃后延伸10min。

所述的步骤五中利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量反应体系为20 µl：Probe qPCR Mix 10µl，10µmol/L的上下游引物各0.4µL，探针 0.8µl，ROXReference Dye II 0.2µl，质粒模板2µl，灭菌水6.2µl，反应依次为预变性：95℃30s，PCR反应95℃5s、57℃15s、72℃30s，并进行45次循环。

实验结果：

根据图1、2所示，实时荧光定量PCR标准曲线的建立，结果表明，随着阳性质粒模板浓度逐渐降低，Ct值出现递增趋势，CMV、内参基因在质粒标准品浓度101-109copies/µl范围内，Ct值同质粒标准品浓度之间线性关系良好。可根据待检测样品的Ct值参照此标准曲线进行样品含毒量的检测。

CMV、内参基因TaqMan实时荧光定量PCR反应，每个质粒梯度浓度均进行三次技术重复，结果如下表所示，三次重复变异系数均小于2%，表明本实验重复性良好，实验结果可靠。

实验结果如下表：

根据图3、4所示，CMV的TaqMan荧光定量PCR检测方法能够最低检测出2.32×102copies/mL的病毒样品，而常规RT-PCR检测方法能够最低检测出4.53×102copies/mL的病毒样品，表明TaqMan荧光定量PCR检测TMV的灵敏度比常规RT-PCR检测提高了10倍。

序列表

<110> 河南省农业科学院烟草研究所

<120> 一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

<130> 2022.05.05

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggacaaat ctgaatcaac cagtgctggt cgtaaccgtc gacgtcgtcc gcgtcgtggt 60

tcccgctccg cctcctcctc cgcggatgct aactttagag tcctgtcgca acagctttcg 120

cgacttaata agacgttagc agctggtcgt ccaaccatta accacccaac ctttgtgggt 180

agtgaacgat gtaaacctgg gtacacgttc acatctatca ccctgagacc accgaaaata 240

gaccgtgggt cttattatgg taaaaggttg ctacttcctg attcggtcac agagttcgat 300

aagaagcttg tttcgcgcat tcaaattcga gttaatccct tgccaaaatt tgattctacc 360

gtgtgggtga cagttcgtaa agttcctgcc tcctccgact tatccgttac cgccatctct 420

gctatgttcg cggacggagc ctcaccggta ctggtctatc agtacgccgc atccggagtc 480

caagccaaca ataaactgtt gtacgatctt ttggcgatgc gcgctgatat tggcgacatg 540

cgaaagtacg ccgttctcgt gtattcaaaa gacgatgctc tcgagacgga tgagctggta 600

cttcatgtcg acatcgagca ccaacgcatt cccacgtctg gggtgctccc agtctga 657

<210> 2

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtaccagggc gcaggtggag acatgggtgg tgccatggat gatgagggtc ctgctcctag 60

tggtggtggt gctggtccta agattgagga ggtggactaa gttggtgctc ctctattgtt 120

ttttatttct tgttagagac ttgcaatttt atttcagaga tctgtgtgcc taatgatttt 180

tgcctagtag atggattata ttattttcat tctgcaatca agtaatacct atcttttatt 240

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