一种牦牛Wnt7A基因CNV标记的检测方法与应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于RT-qPCR技术检测牦牛Wnt7A基因CNV标记的方法及其应用。

背景技术

20世纪80年代以来，随着分子生物技术和生物信息学的迅猛发展，动物分子育种技术的研究取得了一系列突破性的进展，动物的育种技术正在由常规的表型选育向分子育种方向发展。分子标记辅助育种(molecular marker-assisted breeding,MAS)是利用与数量性状相关的分子标记，从分子水平准确快速地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型选择的方法。该方法与常规育种方法相比，信息量更丰富、选择准确性更高。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)，是一种新的基因组变异形式，通常是指在1Kb到数Mb之间基因组大片段的重复和缺失。对于位置明确的CNV，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。如RT-qPCR、MLPA、FISH和数字PCR等。其中，RT-qPCR是目前应用最为广泛的检测方法，该方法操作比较简单，检测速度快，污染少，可用于大样本群体分型。

Wnt7A是一种分泌型的信号蛋白，属于Wnt基因家族。Wnt7A可以在许多生物进程中发挥其调节作用。许多研究表明，Wnt7A在动物骨骼肌发生和发育过程中具有重要作用，其可以刺激肌卫星细胞的对称分裂，对于骨骼肌肌卫星细胞数量稳定具有重要影响。本发明意外发现，所述Wnt7A基因位于CNV区域，因此提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，并提供了一种方便、准确、大样本量的检测牦牛Wnt7A-CNV的检测方法，为牦牛的生长性状的早期选育提供了基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛Wnt7A基因CNV标记的方法及其应用，尤其涉及一种基于RT-qPCR技术检测牦牛Wnt7A基因CNV标记的方法及其应用。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛Wnt7A基因候选区域NW_005394031.1:534971-621416的拷贝数变异。

第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状或在牦牛早期育种中的应用。

优选地，所述检测牦牛生长性状或在牦牛早期育种具体为：根据2

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因BTF3引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-TCAGGACCAGTGACCCACAG-3’；

下游引物R1：5’-GCAGACGGGAAGTTGTGACC-3’；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGCAGCAAACACTTTCACCATT-3；

下游引物R2：5’-AGCAAAACCGCTACTAGCAAACTC-3’。

第三方面，本发明提供了一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对包括目标基因引物对P1和参照基因BTF3引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-TCAGGACCAGTGACCCACAG-3’；

下游引物R1：5’-GCAGACGGGAAGTTGTGACC-3’；

所述参照基因BTF3引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGCAGCAAACACTTTCACCATT-3；

下游引物R2：5’-AGCAAAACCGCTACTAGCAAACTC-3’。

第四方面，本发明提供了用于RT-qPCR技术检测上述第一方面所述CNV标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有上述第三方面所述的引物对。

优选地，所述试剂盒还包括GoTaq

第五方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：

以牦牛的基因组DNA为模板，通过RT-qPCR技术分别利用权利要求5所述的引物对扩增牦牛Wnt7A基因的CNV区域和参照基因BTF3；

根据2

优选地，所述RT-qPCR扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA 1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，GoTaq

优选地，所述RT-qPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：95℃30s；

(2)扩增反应：95℃变性30s，62℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；

(3)绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到97℃，+0.5℃5s。

本发明的有益效果是：本发明通过RT-qPCR技术检测该位点在牦牛群体中Wnt7A基因的拷贝数变异情况，并与6月龄、12月龄18月龄和30月龄的体重、体高、体斜长和胸围等重要经济性状进行关联分析；如果检测Wnt7A基因的拷贝数变异类型为缺失型，则待测牛的6月龄胸围更优异；根据对应的Wnt7A基因拷贝数变异类型与生长性状的关联分析结果，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于中国牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛Wnt7A基因候选区域NW_005394031.1:534971-621416的拷贝数变异；

本发明提供了检测CNV标记的方法，以牦牛的血液全基因组DNA为模板，通过RT-qPCR方法分别扩增牦牛Wnt7A基因CNV区域并将BTF3基因作为参照，根据Log

本发明以牦牛Wnt7A基因的CNV为候选位点，通过RT-qPCR技术检测该位点在牦牛群体中的拷贝数变异情况，并与6月龄、12月龄18月龄和30月龄的体重、体高、体斜长和胸围等重要经济性状进行关联分析；如果检测Wnt7A基因的拷贝数变异类型为缺失型，则待测牛的6月龄胸围更优异，具有更好生长性能；研究该基因CNV并将其与牦牛重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。

本发明提供的牦牛基因的拷贝数变异检测方法，可用于牦牛的早期选育；检测Wnt7A基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；Wnt7A基因拷贝数变异位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明中进行RT-qPCR绘制的Wnt7A基因扩增曲线；

图2本发明中进行RT-qPCR绘制的BTF33基因扩增曲线；

图3本发明中进行RT-qPCR绘制的Wnt7A基因溶解曲线；

图4本发明中进行RT-qPCR绘制的BTF33基因溶解曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用RT-qPCR对牦牛Wnt7A基因的拷贝数变异进行检测，下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明所涉及的一种基于RT-qPCR技术对牦牛Wnt7A基因CNV标记进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库的牦牛Wnt7A基因序列，再用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用PCR检验引物；

(2)采用RT-qPCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与牦牛各年龄阶段的生长性状进行关联分析，筛选到与牦牛生长性状相关的CNV标记；

(4)根据拷贝数变异类型挑选获得生长性状优异的牦牛种群，进行选育。

实施例检测阿什旦牦牛Wnt7A基因CNV标记

1、牦牛样本采集

本发明以阿什旦牦牛作为检测对象，共采集了213头具有生长性状记录的牦牛的血液样本。

2、血液基因组DNA的提取

(1)向5ml含抗凝剂的血液中加入5ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm(2，000×g)离心2min，倒弃上清；

(2)再向其中加入7.5ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm(2,000×g)离心2min，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2min，确保沉淀在管中；

(3)配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液；

(4)加入2.5ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；

(5)65℃水浴30min，其间颠倒混匀数次；

(6)加入2.5ml异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA；

(7)3,600rpm(～2,000×g)离心8min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中；

(8)加入2.5ml 70％乙醇，涡旋振荡5sec，3,600rpm(～2,000×g)离心3min，倒弃上清；

(9)重复操作步骤H；

(10)将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5min，确保沉淀在管中；

(11)空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净；

(12)加入500μl缓冲液TB，低速涡旋5sec，65℃加热1h溶解DNA，其间轻弹数次助溶。

3、基因组DNA浓度和纯度检测

用Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD

4、目标基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牦牛Wnt7A基因(GenBankAccession No.NW_005394031.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计RT-qPCR引物(引物对P1)，对检测Wnt7A基因拷贝数变异，同时以NCBI所公布的牦牛BFT3基因序列(GenBankAccession No.NW_005393074.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因中一段163bp的序列的RT-qPCR引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示。

表1实时荧光定量PCR的引物信息

注明：F表示上游引物，R表示下游引物。

通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于RT-qPCR分析。扩增曲线平滑，表明RT-qPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(图1和图2)；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图3和图4)。

其中，进行RT-qPCR所用的扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA 1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，GoTaq

PCR扩增的反应程序为：

(1)预变性：95℃30s；

(2)扩增反应：95℃变性30s，62℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；

(3)绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到97℃，+0.5℃5s。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列(引物对P1)和参考序列(引物对P2)的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2

根据Log

5.牦牛Wnt7A基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：6月龄、12月龄、18月龄和30月龄的体重、体高、体长和胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了线性模型：

Yij＝μ+Ai+Gij+Eij

其中：Yij为生长性状的观察值，μ为群体平均值，Ai为年龄效应，Gj为基因型的固定效应，Eij为随机残差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。Wnt7A基因CNV与牦牛品种生长性状的关联分析结果如表2所示，其中，表中所计算的数值Mean±SE为平均值±标准误差；在同一行中数值的右上角标有不同小写字母代表同行数据间差异显著水平P＜0.05。

关联分析结果表明：牦牛Wnt7A基因CNV位点可显著影响6月龄胸围，优势拷贝数变异类型为缺失型，说明Wnt7A基因CNV位点可以作为牦牛生长性状的候选分子遗传标记。

表2 Wnt7A基因CNV与牦牛品种生长性状的关联分析

6.上述CNV标记在牦牛选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以对牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快牦牛品种改良的选育进程。