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一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法

文献发布时间:2024-04-18 19:58:21


一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法

技术领域

本发明属于环境污染治理领域,尤其涉及一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法。

背景技术

自20世纪以来,抗生素被广泛应用于畜牧业、农业、医疗卫生等领域,为人类和畜禽疾病的治疗和动植物生长的促进起着重要的作用。在畜禽养殖业中,抗生素进入动物体内,一部分会被吸收利用,但绝大部分会以代谢物的形式随粪便排出体外。抗生素在动物养殖过程中的长期使用及滥用,会让动物粪便成为抗生素和抗性基因的重要来源。

红壤是经过脱硅富铝化过程以及生物富集作用发育而成的铁铝土,生产潜力巨大。但高温、降雨等因素会导致红壤中的土壤有机质快速分解,极大地降低了红壤中的N、P、K等养分含量,使得红壤耕地产能降低。因此,农业生产中往往会向红壤中施加有机肥,以此来提高土壤肥力、改善土壤质量、增加作物产量。畜禽粪便作为有机肥施用到土壤中,会大幅度提高红壤中抗生素和抗性基因的丰度,加速环境中抗性基因在细菌间的传播和扩散,造成环境抗性传播风险。

畜禽粪便中的微生物大多来自于动物肠道。动物肠道和土壤的pH值不同,因此来源于动物肠道中的微生物无法在土壤中生存下来,导致土壤中存在大量死亡的肠道微生物。微生物死亡后通常会裂解,造成细胞质内容物的释放,这其中包括胞外抗生素抗性基因(eARGs)。我们通常会把胞内抗生素抗性基因(iARGs)和胞外抗生素抗性基因(eARGs)作为一个整体来评估抗性风险,但胞外抗生素抗性基因(eARGs)是一种潜在的抗性传播风险。它只有通过转化进入到细胞中,成为胞内抗生素抗性基因(iARGs),才会造成真正的抗性传播风险。eDNA去除剂是一种能够去除红壤中胞外DNA(eDNA)及胞外抗生素抗性基因(eARGs)的化学试剂。该化学试剂可以降解掉红壤中的胞外DNA(eDNA),进而阻止细胞质内容物的释放,降低红壤中胞外抗生素抗性基因的丰度,帮助我们正确认识红壤中抗生素抗性基因带来的抗性传播风险。

发明内容

针对红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因污染这一问题,本发明提供一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是:

本发明保护一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法,通过eDNA去除剂,降解红壤中的胞外DNA(eDNA)以及存在于胞外DNA中的抗生素抗性基因(eARGs),从而达到消除红壤中胞外DNA(eDNA)及胞外抗生素抗性基因(eARGs)的目的。

在具体的实施方案中,所述方法通过以下具体步骤实现:

(一)配制eDNA去除剂,待用;

(二)称取红壤,加入步骤(一)配制的eDNA去除剂,混匀;室温下静置;

其中,红壤和eDNA的质量体积比为1:0.5~1.5。

在具体的实施方案中,所述红壤和eDNA的质量体积比为1:1。在具体的实施方案中,所述的eDNA去除剂主要包括以下物质:10~30mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、5~15mM L-抗坏血酸、1~3mM五水合硫酸铜、0.2~2mM乙二胺四乙酸、0.01~0.035mM过氧化氢。

优选的,所述的eDNA去除剂主要包括以下物质:20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、10mM L-抗坏血酸、2mM五水合硫酸铜、1mM乙二胺四乙酸、0.025mM过氧化氢。

在具体的实施方案中,所述步骤(二)中红壤可以根据实际情况过筛后再经eDNA去除剂处理。

本发明的有益效果:

(1)在eDNA去除剂的作用下,红壤中胞外DNA的去除率超过95%。

(2)eDNA去除剂不对活体细菌的胞内DNA产生影响。

(3)eDNA去除剂能够降解掉红壤中的胞外DNA(eDNA),从而去除掉eDNA中携带的胞外抗生素抗性基因(eARGs),降低红壤中胞外抗生素抗性基因丰度。

附图说明

图1为基于PVPP法,土壤沉淀和上清液中gfp基因拷贝数变化;

图2为不同浓度的PMA试剂对红壤胞外DNA中gfp基因拷贝数变化;

图3为红壤体系下,胞外DNA中gfp基因拷贝数变化;

图4为不同土壤体系下,胞外DNA中gfp基因拷贝数变化;

图5为红壤体系下,胞内DNA中gfp基因拷贝数变化;

图6为施用有机肥红壤中抗生素抗性基因丰度变化情况。

具体实施方法

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的,均视为可以通过市场购买的常规产品。

本发明请求保护一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法,通过以下步骤实现:

(一)配制eDNA去除剂,待用;

(二)称取0.3g红壤于10mL离心管中,加入3mL的eDNA去除剂,涡旋,制成土壤悬浮液;室温下,静置10min。

下文举例说明本发明优选的具体的实施方式,但本发明不限于此。

实施例1eDNA去除剂去除红壤中的胞外DNA

采集未施用任何肥料的红壤(SCon)、施用有机肥的红壤(SM)以及施用无机肥的红壤(SNPK)样本,过2mm筛,均一化处理;均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL透明离心管中,加入10ul、携带4.3×10

结果如图3所示,经eDNA去除剂处理土壤后,gfp基因拷贝数与对照组相比显著降低,去除率在95%以上,表明eDNA去除剂能够有效地去除红壤当中的胞外DNA。

对比例1PVPP法洗脱红壤中的胞外DNA

采集红壤样本,过2mm筛,均一化处理;称取0.2g土壤于2mL透明离心管中,加入1mL0.1M的PBS缓冲液;加入10ul、携带4.3×10

结果如图1所示,土壤沉淀中的gfp基因拷贝数显著高于上清液中的gfp基因拷贝数,表明加入红壤中超过95%的外源质粒DNA被土壤吸附。与图3相比,PVPP不能有效地洗脱掉红壤中的eDNA。

表1gfp基因引物

对比例2PMA法结合红壤中的胞外DNA

称取0.3g均一后的红壤样本于10mL透明离心管中,加入3mL 0.01M的PBS缓冲液;随即加入10ul、携带4.3×10

结果如图2所示,经PMA处理的土壤中,其gfp基因拷贝数与CK相比没有显著差异。与图3相比,PMA无法有效地结合掉红壤样本中的eDNA。

对比例3eDNA去除剂对不同土壤中胞外DNA的去除效果

采集安徽(AH)、河南(HN)以及山东(SD)三地的土壤样本,过2mm筛,均一化处理;均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL透明离心管中,加入10ul、携带4.3×10

结果如图4所示,与CK相比,经eDNA去除剂处理土壤样本中的gfp基因拷贝数没有显著降低。与eDNA去除剂能有效去除红壤中95%以上的eDNA相比,该实验表明eDNA去除剂不能有效去除安徽、山东以及河南三地土壤样本中的eDNA。

实施例2eDNA去除剂对红壤中胞内DNA的影响

采集未施用任何肥料的红壤(SCon)、施用有机肥的红壤(SM)以及施用无机肥的红壤(SNPK)样本,过2mm筛,均一化处理;8种携带gfp基因片段的菌按照培养条件培养(表2);取等量的菌液置于2mL离心管中,无菌水洗涤3次,制成混合菌群;均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL离心管中,加入10ul、携带3×10

结果如图5所示,经eDNA去除剂处理后,红壤胞内DNA中的gfp基因拷贝数没有显著下降,表明eDNA去除剂不对活体细菌的胞内DNA产生影响。

表2菌群信息

实施例3

一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法是按下列步骤进行的:对施加有机肥30天的红壤样本进行采样,过2mm筛,均一化处理;称取均质后的土壤样本0.3g置于10mL离心管中,加入3mL无菌水/eDNA去除剂,混匀,静置10min;10000g离心2min,弃上清;加入3mL 0.1M的磷酸钠缓冲液(pH=7.4),充分混匀,10000g离心2min,弃上清,重复三次;用DNeasy PowerSoil Pro Kit(购自Qiagen)试剂盒提取土壤DNA;利用宏基因组测序方法,比较eDNA去除剂处理前后,红壤中抗生素抗性基因丰度(图6)及抗生素种类(表3)的变化情况。

结果如图6和表3所示,eDNA去除剂处理红壤样本后其抗生素抗性基因的丰度和种类与CK相比有明显差异,表明eDNA去除剂可以有效去除红壤中的胞外DNA以及胞外抗生素抗性基因。

表3施用有机肥红壤中抗生素种类变化情况

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求为保护范围为准。

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技术分类

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