一种微藻扩培混养培养基及其应用

技术领域

本发明涉及微藻生物技术领域，尤其涉及一种微藻扩培混养培养基及其应用。

背景技术

微藻是一类单细胞光合微型生物的总称。微藻已经成为传统陆生植物的一个有吸引力的替代品，用于生产生物燃料和其他高价值产品，同时缓解耕地、二氧化碳排放和全球变暖的压力。然而，实现微藻产品的高生产率仍然是微藻商业应用的主要挑战。微藻的混养发酵是指微藻同时利用有机物和光照进行生长的一种培养模式，由于兼具光合自养生长与异养生长的优势，微藻的混养发酵可以成为一种提升微藻生长速度与产物产量的方法，如小球藻、衣藻、微拟球藻、斜生栅藻等微藻都被发现可以进行混养生长。混养发酵技术在微藻生成生物柴油、生物制品等方面的优势已经得到了广泛的研究。

然而，由于现有微藻的混养培养基多以自养培养基加有机碳源的形式设计而成，存在培养成分复杂，微藻生物量产量低等缺陷。因此，为实现微藻混养发酵的工业化应用，需要设计专门的微藻混养培养基，以达到简化培养基配方、降级培养基成本提升微藻产量的目的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种微藻扩培混养培养基及其应用，该培养基具有成分简单、成本低及微藻产量高等优点，具有广泛的工业应用前景。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：第一方面，本发明提供了一种微藻扩培混养培养基，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂2-4份、磷源0.1-0.4份、碳源2-5份、生长因子0.01-0.1份、氮源0.3-0.54份和无机盐0.075-0.237份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

本发明的扩培混养培养基包含微藻生长的必备元素，包括磷源、碳源、生长因子、氮源、无机盐；同时，添加pH缓冲剂稳定培养液pH值提升微藻混养生长速度。Bis-Tris具有较为强的中性pH缓冲能力，可作为pH缓冲剂添加。在微藻培养中，pH会随着藻类的生物量的改变发生变化，影响藻类的生长。培养基添加了Bis-Tris在此过程起到pH缓冲的作用，稳定培养液pH值提升微藻混养生长速度；K

申请人经过大量的实验发现，在该重量份下，微藻扩培混养培养基的最终pH值稳定在8.0-8.5；在该培养基下培养微藻可具有较好的生物量，且适用于不同微藻的生长以及高浓度有机碳源条件下的微藻混养培养。

优选地，所述Bis-Tris的重量份为4份；所述K

在本发明特定的重量份下，微藻的生物量OD

优选地，上述的微藻扩培混养培养基中，所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

使用胰蛋白胨替换大部分市售上培养基含有的复杂的微量元素，可达到简化培养基成分的同时，保证微藻的生物量；使用NH

优选地，上述的微藻扩培混养培养基中，所述胰蛋白胨的重量份为0.1份；所述NH

优选地，上述的微藻扩培混养培养基中，所述无机盐包括MgSO

优选地，所述MgSO

更优选地，所述MgSO

上述微藻扩培混养培养基的制备方法：按上述重量份分别称取培养基成分，溶于水后，灭菌后制得培养基。本发明所述混养培养基配制方法简单，使用方便，适用于多种微藻的培养，可以降低培养工作量，提升微藻产量，为微藻的工业化生产提供了保障。

第二方面，本发明提供了上述微藻扩培混养培养基在微藻混养培养中的应用。

上述微藻扩培混养培养基适用于能进行混养生长的微藻。

优选地，所述微藻为小球藻、衣藻、微拟球藻、斜生栅藻中的任一种。

更优选地，所述小球藻为凯氏拟小球藻；所述衣藻为莱茵衣藻。

本发明的有益效果在于：

本发明所设计的微藻混养培养基具有成分简单、微藻生物量高等优点，且该培养基更适合微藻在高浓度有机碳源条件下的混养培养，能够通过增加有机碳源的添加量进一步获得更高丰度的微藻产品，十分适合于微藻的工业化培养。

附图说明

图1：凯氏拟小球藻在BG-11、BG-11-A、BG-11-AT和BG-11-AB培养基中混养培养最终OD

图2：凯氏拟小球藻在BG-11-AB、B-ABP和B-ABPAm培养基中混养培养最终OD

图3：凯氏拟小球藻在不同K

图4：凯氏拟小球藻及莱茵衣藻在TAP和B-ABPAm培养基中混养培养最终OD

图5：凯氏拟小球藻在不同乙酸盐浓度的TAP和B-ABPAm培养基中混养生长最终生物量，**p＜0.05。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实验使用的藻种：凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)FACHB-4和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)FACHB-265均购自中国科学院淡水藻种库。

实施例1：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.1份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

实施例2：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.2份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

实施例3：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，下称B-ABPAm培养基，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.4份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述MgSO

实施例4：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.4份、碳源3份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

实施例5：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.4份、碳源4份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

实施例6：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种实施例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.4份、碳源5份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

对比例1：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称BG-11培养基，包括以下重量份的组分：

磷源0.004份、碳源0.002份、氮源1.5份和无机盐0.0116份；所述磷源为K

所述氮源为NaNO

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

所述培养基还包括以下重量份的组分：

柠檬酸0.0006份、EDTANa

对比例2：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称BG-11-A培养基，包括以下重量份的组分：

磷源0.004份、碳源2.002份、氮源1.5份和无机盐0.0116份；所述磷源为K

所述氮源为NaNO

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

所述培养基还包括以下重量份的组分：

柠檬酸0.0006份、EDTANa

对比例3：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称BG-11-AT培养基，包括以下重量份的组分：

pH缓冲剂2.42份、磷源0.004份、碳源2.002份、氮源1.5份和无机盐0.0116份；所述pH缓冲剂为Tris-base；所述磷源为K

所述氮源为NaNO

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

所述培养基还包括以下重量份的组分：

柠檬酸0.0006份、EDTANa

对比例4：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称BG-11-AB培养基，包括以下重量份的组分：

pH缓冲剂4份、磷源0.004份、碳源2.002份、氮源1.5份和无机盐0.0116份；所述pH缓冲剂为Bis-base；所述磷源为K

所述氮源为NaNO

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

所述培养基还包括以下重量份的组分：

柠檬酸0.0006份、EDTANa

对比例5：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称B-ABP培养基，包括以下重量份的组分：

pH缓冲剂4份、磷源0.004份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源1.5份和无机盐0.0116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NaNO

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

对比例6：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，下称TAP培养基，包括以下重量份的组分：

pH缓冲剂2.42份、磷源0.0019份、碳源2份、氮源0.375份和无机盐0.1505份；所述pH缓冲剂为Tris base；所述磷源为K

所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

所述培养基还包括以下重量份的组分：

Na

对比例7：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.04份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份。所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

对比例8：

本发明的微藻扩培混养培养基的一种对比例，包括以下重量份的组分：pH缓冲剂4份、磷源0.8份、碳源2份、生长因子0.1份、氮源0.54份和无机盐0.116份；所述pH缓冲剂为Bis-Tris；所述磷源为K

所述生长因子为胰蛋白胨；所述氮源为NH

所述无机盐包括MgSO

所述MgSO

试验例

一、微藻生物量测定

1、不同培养基对微藻生物量的影响

(1)以凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)FACHB-4为微藻藻种，首先用BG-11培养基进行富集培养，当凯氏拟小球藻培养液OD

(2)将步骤(1)培养得到的凯氏拟小球藻种子液按2％体积比分别接种于对比例1-3制备的培养基中，置于光照培养箱中培养，培养条件为：30℃，6000Lux全光照。通过分光光度计测量培养液的OD

(3)将获得凯氏拟小球藻种子液按2％体积比分别接种于实施例3(B-ABPAm培养基)、对比例4(BG-11-AB培养基)、对比例5(B-ABP培养基)制备的培养基，置于光照培养箱中培养，培养条件为：30℃，6000Lux全光照。通过分光光度计测量培养液的OD

从图1可见，对比例2的BG-11-A培养基对微藻进行培养时，最终凯氏拟小球藻OD

对比例4的BG-11-AB培养基培养微藻，培养基最终pH值为8.58，相比添加Tris-base作为缓冲剂的对比例3的pH值出现显著性下降，说明相同分子量的Bis-Tris作为pH缓冲剂具有比Tris-base更强的中性pH缓冲能力，这使得凯氏拟小球藻混养生长速度进一步提升，最终凯氏拟小球藻OD

实施例3的B-ABPAm培养基与对比例4的BG-11-AB培养基的区别为实施例3的培养基使用胰蛋白胨代替了对比例4的多种微量元素。实施例3的B-ABPAm培养基与对比例5的B-ABP培养基的区别为实施例1的培养基以NH

2、磷酸根浓度对微藻生物量的影响

将凯氏拟小球藻种子液按2％体积比分别接种于实施例1-3、对比例7、8的培养基中，置于光照培养箱中培养，培养条件为：30℃，6000Lux全光照。通过分光光度计测量培养液的OD

从培养液OD

二、微藻适应性培养实验

1、不同藻类混养适应性测试

以凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)FACHB-4及莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)FACHB-265为微藻藻种，首先用BG-11培养基进行富集培养，当藻液OD

将获得凯氏拟小球藻种子液按2％体积比分别接种于实施例3的B-ABPAm培养基、对比例6的TAP培养基，置于光照培养箱中培养，培养条件为：30℃，6000Lux全光照。通过分光光度计测量培养液的OD

TAP培养基为目前应用最广的微藻混养培养基，对比使用TAP和B-ABPAm培养基培养不同微藻的培养结果可知，使用实施例3的B-ABPAm培养基培养微藻时，培养液最终pH值都小于使用对比例6的TAP培养基培养时的结果，说明B-ABPAm培养基具有更强的pH稳定性。

使用实施例3的B-ABPAm培养基培养时，凯氏拟小球藻的最终OD

使用实施例3的B-ABPAm培养基培养莱茵衣藻时，最终OD

2、高碳源浓度下微藻的混养培养测试

(1)以凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)FACHB-4(购自中国科学院淡水藻种库)为微藻藻种，首先用BG-11培养基进行富集培养，当凯氏拟小球藻培养液OD

(2)将对比例6TAP培养基中的乙酸钠分别配置成2份、3份、4份、5份。

(3)将凯氏拟小球藻种子液按2％体积比接种至上述不同乙酸钠含量的TAP培养基和实施例3-6的微藻扩培混养培养基中，将凯氏拟小球藻培养物置于光照培养箱中培养，培养条件为：30℃，6000Lux全光照。

(4)测量培养液的OD

从培养液OD

使用实施例3-6的微藻高丰度扩培混养培养基培养时，凯氏拟小球藻最终生物量随乙酸钠的份数增加而增加，在乙酸钠为5份时，最终OD

上述实验说明，本发明微藻高丰度扩培混养培养基——B-ABPAm培养基成分简单、配制方法简单，使用方便，适用于多种微藻的培养，可以降低培养工作量，提升微藻产量。从经济效益上，选择B-ABPAm培养基培养微藻，在降低成本的同时，还能保证微藻产量；另外在B-ABPAm培养基的基础上进行有机碳源浓度的提升，也可以促进微藻生物量的提升，为微藻的工业化生产提供了保障。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。