一种裸花紫珠提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及裸花紫珠提取物领域，特别涉及裸花紫珠提取物的制备方法。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科紫珠属植物，一般生长在湿度较大的，平均温度在15～25℃的环境中，所以，在国内主要分布于湿度较大的海南、广东、广西等地，在海南又主要生长于澄迈、定安、儋州等地，其中海南五指山的裸花紫珠较其他地方品质更上一筹。裸花紫珠的药用部位为地上干燥部分，在海南当地人民用之为药材，同时也被当地黎族医生作为常用药材之一。近年来，很多科研单位加强了对裸花紫珠的研究，主要为国内，国外鲜见报道，2015年版的中国药典再一次把裸花紫珠录入，同时明确了其功能与主治为“消炎，解毒，止血，祛瘀，止痛”。

CN109123174A含裸花紫珠的家禽预混合饲料及其制备方法和应用，原料包括裸花紫珠、铁苋菜、胡椒、松针、艾叶、小茴香和冰片等，该家禽预混合饲料，能有效控制家禽夏季热应激，提高免疫力和抗病力，提高家禽生产性能。CN110404006A一种治疗鸡坏死性肠炎的药物组合物该药物组合物主要成分重量份数计为：裸花紫珠10-100份、瓜蒌10-80份、酸枣仁10-50份、淫羊霍5-30份、安息香1-30份，该药物组合物在治疗鸡坏死性肠炎中的应用，抗产气荚膜梭菌作用疗效好，能显著增强鸡的抵抗力、提高免疫力。本发明通过优化裸花紫珠提取物的提取方法，拓宽裸花紫珠的用途。

发明内容

鉴于此，本发明提出裸花紫珠提取物的制备方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种裸花紫珠提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将裸花紫珠鲜叶烘干，烘干后切碎，将切碎后的裸花紫珠粉末加入水中浸提，过滤，制得滤渣和滤液；

(2)滤渣采用乙醇-硫酸铵双水相体系超声提取，制得裸花紫珠提取液；

(3)将裸花紫珠提取液浓缩，制得裸花紫珠提取物。

进一步的，步骤(1)中，所述浸提为采用80-90℃的水浸提10-20min。

进一步的，步骤(2)中，所述乙醇-硫酸铵双水相体系中硫酸铵质量浓度为0.24-0.28g/mL，乙醇体积分数为45-55％。

进一步的，步骤(2)中，所述滤渣和乙醇-硫酸铵双水相体系质量比为0.8-1.2g:20-30mL。

进一步的，步骤(2)中，所述超声提取为在60-65℃下采用230-250W超声25-35min。

进一步的，步骤(3)中，所述浓缩为在60-70℃下减压浓缩20-30min。

进一步的，所述的裸花紫珠提取物在制备鸡饲料中的应用。

进一步的，所述裸花紫珠提取物在制备治疗和/或预防鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、鸡大肠杆菌病、鸡葡萄球菌病、肠道感染的饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中裸花紫珠提取采用采用乙醇-硫酸铵双水相体系超声提取，能够提取裸花紫珠中治疗和预防鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、鸡大肠杆菌病、鸡葡萄球菌病、肠道感染的有效成分。

附图说明

图1裸花紫珠提取物浓度为0.05g/ml对肠炎沙门氏菌抑菌圈对比图

图2裸花紫珠提取物浓度为0.2g/ml对肠炎沙门氏菌抑菌圈对比图

图3裸花紫珠提取物浓度为0.05g/ml对伤寒沙门氏菌抑菌圈对比图

图4裸花紫珠提取物浓度为0.2g/ml对伤寒沙门氏菌抑菌圈对比图

图5裸花紫珠提取物浓度为0.05g/ml对金黄色葡萄球菌抑菌圈对比图

图6裸花紫珠提取物浓度为0.2g/ml对金黄色葡萄球菌抑菌圈对比图

图7裸花紫珠提取物浓度为0.05g/ml对大肠杆菌抑菌圈对比图

图8裸花紫珠提取物浓度为0.2g/ml对大肠杆菌抑菌圈对比图

图9裸花紫珠提取物浓度为0.05g/ml对单增李斯特菌抑菌圈对比图

图10裸花紫珠提取物浓度为0.2g/ml对单增李斯特菌抑菌圈对比图

图11日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡肠道形态的影响

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)将裸花紫珠鲜叶烘干，烘干后切碎，将切碎后的裸花紫珠粉末加入80℃的水中浸提10min，过滤，制得滤渣和滤液；

(2)乙醇-硫酸铵双水相体系中硫酸铵质量浓度为0.24g/mL，乙醇体积分数为45％，将滤渣和乙醇-硫酸铵双水相体系按照质量比为0.8g:20mL混合，在60℃下采用230W超声25min，制得裸花紫珠提取液；

(3)将裸花紫珠提取液在60℃下减压浓缩20min，制得裸花紫珠提取物。

实施例2

(1)将裸花紫珠鲜叶烘干，烘干后切碎，将切碎后的裸花紫珠粉末加入90℃的水中浸提20min，过滤，制得滤渣和滤液；

(2)乙醇-硫酸铵双水相体系中硫酸铵质量浓度为0.28g/mL，乙醇体积分数为55％，将滤渣和乙醇-硫酸铵双水相体系按照质量比为1.2g:30mL混合，在65℃下采用250W超声35min，制得裸花紫珠提取液；

(3)将裸花紫珠提取液在70℃下减压浓缩30min，制得裸花紫珠提取物。

实施例3

(1)将裸花紫珠鲜叶烘干，烘干后切碎，将切碎后的裸花紫珠粉末加入85℃的水中浸提15min，过滤，制得滤渣和滤液；

(2)乙醇-硫酸铵双水相体系中硫酸铵质量浓度为0.26g/mL，乙醇体积分数为50％，将滤渣和乙醇-硫酸铵双水相体系按照质量比为1g:25mL混合，在60℃下采用240W超声30min，制得裸花紫珠提取液；

(3)将裸花紫珠提取液在65℃下减压浓缩25min，制得裸花紫珠提取物。

对比例1

取裸花紫珠干叶200g，粉碎度为1cm左右的小段，水为提取溶剂，料液比为1:30，加水后先浸润30min后，煎煮30min，制得裸花紫珠提取液，将裸花紫珠提取液在65℃下减压浓缩25min，制得裸花紫珠提取物。

对比例2

在实施例3的基础上，调整乙醇-硫酸铵双水相体系的原料组成，具体为：

乙醇-硫酸铵双水相体系中硫酸铵质量浓度为0.3g/mL，乙醇体积分数为65％。

试验例1抑菌试验

试验菌种为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌和伤寒沙门氏菌。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌采用MHA/MHB培养基，单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌和伤寒沙门氏菌采用TSA/TSB培养基。

实验过程为：

裸花紫珠供试品溶液：用电子天平分别称取实施例3裸花紫珠提取物0.05g/ml，0.2g/ml，后加入20％乙醇溶解，放超声波超声1h，后放离心机在25℃采用10000rpm离心10min，取其上清液，备用。

菌悬液：分别取大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特菌，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌的单菌落到50ul的液体培养基中，放37℃培养箱摇12h，后用显微镜数其活菌落个数后将其进行稀释到10×7cfu/ml，备用。

在无菌操作台内分别取上述的菌液0.1ul，加入至5ml的裸花紫珠供试液及20％乙醇对照液的试管内，后放到培养箱摇10min，称为作用时间。再分别取作用后的各溶液0.5ml加入至5mlPBS溶液的试管内，后放到培养箱摇10min，称为终止反应。分别取终止反应下的各溶液与pH值为7.4的PBS溶液分别按1倍，5倍和10倍充分稀释，再放到培养箱摇10min。取其上述不同的比例稀释液各0.5ml到培养皿内，用放凉到40℃-45℃的营养琼脂培养基倒15ml至培养皿作倾注，转动培养皿使其充分混匀，待其琼脂完全凝固后翻转平板，倒放到培养箱培养24h，后作活菌菌落计数后计算出抑菌率。

抑菌率＝(对照液-供试液)/对照液×100％

表1抑菌率试验结果(％)

注：表1中裸花紫珠提取物药物浓度为0.2g/ml，稀释倍数为1倍。

试验结果表明，本发明制得的裸花紫珠提取物抑菌效果优于对比例1-2的裸花紫珠提取物。

参见图1-11，本发明制得裸花紫珠提取物药物浓度为0.05-0.2g/ml稀释1倍、5倍、10倍对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌和伤寒沙门氏菌均有抑菌效果，抑菌率达到90％以上。

试验例2最低抑菌浓度(MIC)的测定

将实施例3制得的裸花紫珠提取物稀释至40mg/mL。采用微量肉汤稀释法，取96孔微量板，在无菌操作下用移液枪向每排11孔各加入100μL肉汤培养基，再吸取100μL稀释后的裸花紫珠提取物药液至第一孔，以第一孔裸花紫珠提取物浓度为20mg/mL作为起始浓度采用对倍稀释法稀释成相应浓度，第10孔中吸取100μL弃去，此为试验组。吸取100μL配置好的菌悬液依次加入第1～11孔中，充分混匀。第11孔不加试药，以便观察培养基是否适合菌株生长，为生长对照组，吸取200μL肉汤培养基加入到第12孔以便观察培养基否被污染。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌)每种细菌3个重复。随后将96微孔板放置于37℃培养箱培养24h。取出后采用酶标仪测定OD600 nm，与阴性对照组比较，抑菌率达到80％的样品浓度就为该受试菌的MIC。左氧氟沙星和20％乙醇作相同处理分别作为阳性药物对照和阴性溶剂对照。

抑菌率＝(阳性对照OD值-药物实验组OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100％

裸花紫珠浸膏对大肠杆菌的最低抑菌浓度是20mg/ml。对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度是2.5mg/ml。对奇异变形杆菌的最低抑菌浓度是20mg/ml。

试验例3

表2日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡

Negative:空白对照组，Positive:抗生素对照组，T1、T2、T3分别在日粮中添加150、300、600mg/kg的裸花紫珠提取物，TAOC＝总抗氧化能力，SOD＝超氧化物歧化酶，GSH-PX＝谷胱甘肽过氧化物酶。

表3日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡血清炎症因子和免疫蛋白浓度的影响

Negative:空白对照组，Positive:抗生素对照组，T1、T2、T3分别在日粮中添加150、300、600mg/kg的裸花紫珠提取物。

表4日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡内脏和免疫器官指数的影响

Negative:空白对照组，Positive:抗生素对照组，T1、T2、T3分别在日粮中添加150、300、600mg/kg的裸花紫珠提取物。

表5日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡空肠氧化还原基因mRNA表达的影响

Negative:空白对照组，Positive:抗生素对照组，T1、T2、T3分别在日粮中添加150、300、600mg/kg的裸花紫珠提取物。

表6，日粮中添加不同浓度裸花紫珠提取物对儋州鸡空肠

Negative:空白对照组，Positive:抗生素对照组，T1、T2、T3分别在日粮中添加150、300、600mg/kg的裸花紫珠提取物

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。