一种对虾肠道海泥黏着杆菌菌株及其在对虾养殖中的应用

技术领域

本发明涉及一株海泥黏着杆菌及其应用，尤其是涉及一种对虾肠道海泥黏着杆菌菌株及其在对虾养殖中的应用。

背景技术

对虾是世界三大对虾养殖品种之一，但随着对虾集约化生产的提高，残饵、粪便等有机物累积致使对虾养殖水质恶化，弧菌、肝肠胞虫等致病性病原微生物大量繁殖，导致养殖水体微生物生态失衡，引起对虾肠道菌群失调、对虾代谢紊乱、易受到病原微生物的侵染。病害的频发导致对虾的产量和质量都不稳定，成为制约对虾养殖业发展的卡脖子问题。目前，对虾疾病防治通常采用大量换水、添加抗生素和微生物制剂等方法，而大量换水不仅会浪费大量的水体资源，还会增加养殖成本。同时，使用抗生素会导致耐药菌株的出现以及危害人类健康。为此，寻求新型的抗生素替代品成为研究热点。其中，微生物制剂具有无毒、无污染和效果显著等特点被广泛应用于对虾养殖。

生物絮团养殖对虾肠道中，黄杆菌科细菌在对虾肠道中广泛存在并占据较高丰度，是对虾肠道微生物中群落中的核心类群。黄杆菌科细菌在健康对虾肠道中占据一定的优势，可能有助于提高对虾的适应性和抗病力。可见，黄杆菌科细菌在对虾肠道微生物中有着重要的地位，它们对对虾健康生长发育至关重要。目前，国内外还没有公开任何关于从对虾肠道分离具有消化酶活性的黄杆菌科海泥黏着杆菌菌株及其在水产养殖中应用的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有淀粉酶和纤维素酶活性，且可提高对虾养殖存活率和抗副溶血弧菌侵染能力的对虾肠道海泥黏着杆菌菌株及其在对虾养殖中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种对虾肠道海泥黏着杆菌菌株，该菌株为BG12菌株，分类命名为海泥黏着杆菌(Tenacibaculum lutimaris)，于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25267。

上述对虾肠道海泥黏着杆菌菌株在制备副溶血弧菌抑制剂中的应用。

上述对虾肠道海泥黏着杆菌菌株在制备对虾养殖用益生菌添加剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种对虾肠道海泥黏着杆菌菌株及其在对虾养殖中的应用，该菌株从对虾肠道中分离得到，培养24h时其OD

上述对虾肠道海泥黏着杆菌菌株，该菌株为BG12菌株，分类命名为海泥黏着杆菌(Tenacibaculum lutimaris)，于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25267，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为海泥黏着杆菌BG12随培养时间的pH值变化和OD

图2为海泥黏着杆菌BG12产淀粉酶(A)和纤维素酶(B)功能；

图3为根据海泥黏着杆菌BG12菌株16S rRNA序列构建的聚类树；

图4为添加BG12菌株的幼虾存活率(A)、肠道饱满度(B)以及对弧菌侵染的抗性(C)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1、本发明菌株的分离纯化

在无菌超净台上，用灭菌牙签挑取活虾肠道装入灭菌的EP管中，加入高压灭菌的PBS缓冲液，剧烈震荡30s后置于30℃、180rpm摇床震荡培养30min；然后以2％(V/V)的比例转接于新鲜的肉汤培养基中置于30℃、180rpm摇床震荡培养24h，取适量培养后的培养液进行稀释后，均匀涂布于1/100 2216E琼脂培养基上，30℃倒置培养2～3d；用无菌接种环挑取单菌落，在2216E琼脂培养基上纯化培养2次，而后加入无菌甘油保种于-80℃；

该菌株为革兰氏阳性菌，在2216E琼脂培养基上30℃培养24h，菌落为橙黄色，菌体扁圆形。如图1所示，该菌株在2216E肉汤培养基中培养12h，OD

2、本发明菌株的生物酶活性功能鉴定

产淀粉酶能力：将分离得到的菌株活化后，用2216E肉汤培养基于30℃培养过夜，吸取5μL待测菌液点种在产淀粉酶细菌选择性培养基平板(硝酸钠1.0g，磷酸氢二甲1.0g，氯化钾1.0g，硫酸镁0.5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨3.0g，可溶性淀粉5.0g，琼脂15.0g，氯化钠15.0g，蒸馏水1000mL)上于30℃倒置培养24h。培养结束后，在培养基上覆盖革兰氏碘溶液(将2.0g碘化钾溶解在少量水中，再将1.0g的碘溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶解后，用蒸馏水定容至300mL，棕色瓶中避光保存)染色3-5min，清水冲洗后，根据菌株在产淀粉酶细菌选择培养基平板是否产生透明圈判断其产淀粉酶能力。如图2A所示，该菌株在产淀粉酶细菌选择培养基平板产生透明圈，具有较强的产淀粉酶能力。

产纤维素酶能力：将分离的得到的菌株活化后，用2216E肉汤培养基于30℃培养过夜，吸取5μL待测菌液点种在产纤维素酶细菌选择性培养基平板(取硝酸钠1.0g，磷酸氢二甲1.0g，氯化钾1.0g，硫酸镁0.5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨3.0g，羧甲基纤维素0.5g，琼脂15.0g，氯化钠15.0g，溶于蒸馏水1000mL)上于30℃倒置培养24h。培养结束后，在培养基上覆盖1mg/mL的刚果红溶液染色10-15min，倒去刚果红溶液，在培养基上覆盖l mol/L NaCl溶液洗去多余染料，15min后倒掉NaCl溶液，根据菌株在产纤维素酶细菌选择性培养基平板是否产生透明圈判断其产纤维素酶能力。如图2B所示，该菌株在产纤维素酶细菌选择性培养基平板产生透明圈。以下采用16S rRNA测序对该菌株进行鉴定。

3、本发明菌株的鉴定

16S rRNA基因的PCR扩增：将筛选出的菌株BG12用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系为(20μL)：模板2μl，kodaq2×PCR MasterMix(Cat.No.G497，abm，Canada)10μL，引物27F 0.5μL(浓度为10μM)，引物1492R 0.5μL(浓度为10μM)，ddH

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR在1.5wt％琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带为1500bp左右。然后割胶回收纯化后送上海生工公司测序，测得16S rRNA序列为900bp，BG12菌株16S rRNA序列为900bp，序列为：GGTGCTTGCACCGCTGACGACCGGCGAACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTGTACAGGAGGATAGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACTCCATAATACTGAGATGTGGCATCACAATTTAGTTAAAGATTTATCGGTACAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCTTACCATGGCAACGATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACAGGAAGAAACAGTCGTACGTGTACGACCTTGACGGTACTGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGCAGGCGGTCAATTAAGTCAGAGGTGAAATCCCATAGCTTAACTATGGAACTGCCTTTGATACTGGTTGACTTGAGTTATACGGAAGTAGATAGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAATACCGATTGCGAAGGCAGTCTACTACGTATATACTGACGCTCATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGACACTAGTTGTTGGGTGCAAATTCAGTGACTAAGCGAAAGTGATAAGTGTCCCACCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGG。将该序列提交到EZBioCloud比对后发现，该菌株与模式菌株TenacibaculumlutimarisDSM16505菌株的相似度高达98.44％，因此将该BG12菌株命名为TenacibaculumlutimarisBG12。该菌株的16S rRNA聚类树见附图3。将该菌株命名为海泥黏着杆菌BG12(Tenacibaculum lutimaris)，于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25267。

实施例2

本实验是在宁波大学海洋学院中试基地进行，共设置10个5L对虾养殖生态实验桶，其中5个桶用作对照，5个用作海泥黏着杆菌BG12添加组。统一投放虾苗，每个实验桶放苗200尾(p10幼苗)。菌剂活化与添加：取保存菌株在2216E琼脂培养基上划板活化，待单菌落长出后，挑取单菌落接于新鲜的2216E肉汤培养基中培养过夜，调节OD

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。