一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法

技术领域

本发明涉及人工湿地废水处理技术领域，尤其涉及一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法。

背景技术

沿海养殖业、盐碱地区农业以及各种工业生产中未经处理的含盐废水排放，威胁到水生、陆生和湿地生态系统，并严重影响人类生活及身体健康。高密度近海养殖以及盐碱地农田排水通常还有大量的溶解性无机盐和多种类型污染物，其中氮素污染物最具代表性。含有大量氮素的沿海养殖废水排放至海洋水体中导致赤潮等有害藻华，影响生态系统及公众健康，成为国内外关注的热点环境问题。对于含盐废水传统的治理方法包括物理化学法、生物反应器法或者其组合技术等，如蒸发法、聚沉-絮凝技术、离子交换法等，但这些技术由于成本较高、能源消耗大、运行复杂等，有的还可能产生二次污染，应用范围有限，尤其是在农业非点源污染的治理中受到限制。

人工湿地作为一种可持续稳定运行的生态净化技术，具有成本低廉、运行高效、操作简易、生态友好并兼具美学景观价值等优势，已被广泛应用与生活、工业及农业等多种废水的处理。植物在湿地脱氮过程中起着重要作用，植物生长过程中可以直接从水体吸收氮素从而将其去除，另外植物根系微生物及根系分泌有机碳作为反硝化碳源可直接或间接影响湿地脱氮效率。人工湿地在去除含盐废水中的氮素方面虽然得到了一定的应用，但是由于废水中盐分对人工湿地中植物、微生物等生长胁迫作用，导致人工湿地在处理含盐废水时脱氮效率大幅降低，限制了人工湿地技术在处理含盐废水中的应用，亟待发展相关技术突破技术瓶颈提升湿地耐盐脱氮效率。虽然有文献报道，在人工湿地中添加耐盐菌可以提高湿地脱氮效率，但多需要持续添加菌剂，并操作管理复杂等问题。印度梨形孢是一种生物营养型的根内共生真菌，可以定殖于多种植物根部皮层细胞内和细胞间，提高植物对土壤中氮磷等元素的吸收，促进植物生长，并能诱导植物产生系统抗性，增强植物抗盐能力，能够提高水稻、大麦、番茄等在盐胁迫下产量。但是，目前还没有将其应用至湿地植物提升人工湿地无盐或耐盐脱氮效率的文献报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法，包括以下具体步骤：

S1：当湿地面积较少、植物用量较少的情况下，选择美人蕉、鸢尾等湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗，采用1/10Hoagland营养液浇灌驯化培养7-10天，待其长出大量健康新生根系，将印度梨形孢菌液接种至培养液植物根系处；

S2：将印度梨形孢成功定殖的美人蕉或鸢尾等湿地植物幼苗移栽至填装好基质的人工湿地中，采用河塘水浇灌进行湿地预培养，培育周期约为1个月左右，使湿地植物成活并健康稳定生长；

S3：当湿地面积较大、所需植物量较多时，选择美人蕉、鸢尾等湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗，将其移栽至填装好填料的湿地系统中，采用河塘水浇灌进行湿地预培养，培育周期约为10-15天，待植物成活并长出大量新根后，利用印度梨形孢菌液浇灌湿地植物根部进行接种，成功定殖后继续培养10-15天；

S4：建成后的人工湿地用于对含盐或不含盐废水进行脱氮处理。

作为本发明的进一步技术方案，所述S1和S3中，湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗需用水清洗干净根系。

作为本发明的进一步技术方案，所述S1和S3中，印度梨形孢菌液的准备方法为：采用PDA液体培养基培养印度梨形孢4-7天，待培养液中长出大量孢子体后离心，用蒸馏水清洗2-3次后再离心得印度梨形孢菌丝，菌丝与蒸馏水按质量体积比2:100比例混合得印度梨形孢菌液。

作为本发明的进一步技术方案，所述S1和S3中，印度梨形孢菌液的接种量为每3-7天接种一次，每次接种为10mL/株，接种频次为2-3次。

作为本发明的进一步技术方案，所述人工湿地的类型包括表流人工湿地、潜流人工湿地、复合垂直潜流人工湿地等类型。

本发明的有益效果为：将益生内生真菌印度梨形孢接种到人工湿地植物根部，印度梨形孢在植物根部定殖后对植物的促生效应和诱导植物耐盐抗性的特点，促进植物生长并提高其耐盐能力，通过植物生长和耐盐能力的增强提升人工湿地对无盐和含盐废水的脱氮效率。

附图说明

图1为本发明提出的一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法的流程图；

图2为本发明的实施例1中的未接种(CK)与接种印度梨形孢鸢尾(PI)在不同盐度胁迫下的相对生长速率差异图；

图3为本发明的实施例1中的不同浓度盐胁迫下鸢尾光合荧光参数变化图；

图4为本发明的实施例1中的未接种(P-)与接种印度梨形孢鸢尾(P+)在不同盐度胁迫下的脱氮效率差异图；

图5为本发明的实施例2中的不同运行批次下各湿地出水TN浓度变化图；

图6为本发明的实施例2中的不同运行批次下各湿地对总氮的去除率差异图；

图7为本发明的实施例2中的不同湿地中美人蕉生物量(A)和植物吸收除氮量(B)差异图；

图8为本发明的实施例2中的不同湿地中美人蕉根系分泌TOC含量差异图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白理解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

请参阅附图1，一种用益生内生真菌提升湿地无盐与耐盐脱氮效率的方法，包括以下具体步骤：

S1：当湿地面积较少、植物用量较少的情况下，选择美人蕉、鸢尾等湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗，采用1/10Hoagland营养液浇灌驯化培养7-10天，待其长出大量健康新生根系，将印度梨形孢菌液接种至培养液植物根系处；

S2：将印度梨形孢成功定殖的美人蕉或鸢尾等湿地植物幼苗移栽至填装好基质的人工湿地中，采用河塘水浇灌进行湿地预培养，培育周期约为1个月左右，使湿地植物成活并健康稳定生长；

S3：当湿地面积较大、所需植物量较多时，选择美人蕉、鸢尾等湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗，将其移栽至填装好填料的湿地系统中，采用河塘水浇灌进行湿地预培养，培育周期约为10-15天，待植物成活并长出大量新根后，利用印度梨形孢菌液浇灌湿地植物根部进行接种，成功定殖后继续培养10-15天；

S4：建成后的人工湿地用于对含盐或不含盐废水进行脱氮处理。

在一个优选的实施方式中，S1和S3中，湿地植物的实生苗或者分株繁殖幼苗需用水清洗干净根系。

在一个优选的实施方式中，S1和S3中，印度梨形孢菌液的准备方法为：采用PDA液体培养基培养印度梨形孢4-7天，待培养液中长出大量孢子体后离心，用蒸馏水清洗2-3次后再离心得印度梨形孢菌丝，菌丝与蒸馏水按质量体积比2:100比例混合得印度梨形孢菌液。

在一个优选的实施方式中，S1和S3中，印度梨形孢菌液的接种量为每3-7天接种一次，每次接种为10mL/株，接种频次为2-3次。

在一个优选的实施方式中，人工湿地的类型包括表流人工湿地、潜流人工湿地、复合垂直潜流人工湿地等类型。

实施案例1：印度梨形孢提高水生鸢尾耐盐脱氮能力

1.水生鸢尾种苗预培养：选择长势一致株高约为15cm左右的鸢尾幼苗(种子萌发实生苗或无性分株幼苗)，洗净根部泥土等杂质，采用1/10Hoagland营养液预培养7-10天，待其长出大量新根；

2.利用PDA液体培养基接种印度梨形孢后，在28℃恒温培养箱中黑暗震荡培养5-7天(转速180r/min)，待培养液中长出大量孢子，初步离心后用蒸馏水洗涤2-3次，并离心，将所得印度梨形孢菌丝体搅碎后与蒸馏水按质量体积比2:100比例混合，得印度梨形孢菌液；

3.将印度梨形孢菌液接种预先培养的鸢尾幼苗，每株幼苗接种10mL，每隔3-7天接种一次，共接种2-3次；

4.采用台盼兰染色法进行镜检，检查印度梨形孢在鸢尾根部的定殖情况；

5.选择成功定殖的鸢尾幼苗，并以未接种幼苗为对照，比较水培过程中两种幼苗在有盐或无盐情况下对水体中氮的去除效果差异；并测定计算不同处理鸢尾的相对生长速率，每个处理3个重复，结果取平均值。

未接种(CK)与接种印度梨形孢鸢尾(PI)在不同盐度胁迫下的相对生长速率差异图如图2所示；

不同浓度盐胁迫下鸢尾光合荧光参数变化图如图3所示；

未接种(P-)与接种印度梨形孢鸢尾(P+)在不同盐度胁迫下的脱氮效率差异图如图4所示。

结果显示，与未接种鸢尾相对，接种印度梨形孢的鸢尾在不同盐度处理下的相对生长速率均显著升高，虽然在0-6‰盐度水平下，两种鸢尾的光合荧光参数Fv/Fm相差不大，但是随盐度水平升高，在12‰和18‰的高盐度胁迫下，接种印度梨形孢的鸢尾光合能力显著高于未接种鸢尾，较高的光合能力更有助于鸢尾生长。同时，在0‰-18‰盐度范围内，接种印度梨形孢的鸢尾对水培液中氮的平均去除率比未接种鸢尾高12.7％-32.0％。

结论：印度梨形孢接种鸢尾后，鸢尾在不同盐度水平下的生长速率均明显提高，较高生长能力和光合效率促进了鸢尾在不同盐度水平下脱氮效率的显著提升，印度梨形孢接种鸢尾可以增强其在无盐及盐胁迫下的脱氮能力。

实施案例2：印度梨形孢提高美人蕉湿地耐盐脱氮效率

1.美人蕉湿地建设

采用PVC塑料圆桶构建小型湿地系统，湿地中从下至上分别添加粒径10-20mm陶粒、5-8mm陶粒各30cm，然后覆土厚度15cm；选择长势一致、高30cm、湿重120g的美人蕉幼苗按16株/m

2.印度梨形孢接种

湿地预培养10-15天，待美人蕉成活并长出大量新根后采用印度梨形孢菌液接种。

3.印度梨形孢菌液制备

利用PDA液体培养基接种印度梨形孢后，在28℃恒温培养箱中黑暗震荡培养5-7天(转速180r/min)，待培养液中长出大量孢子，初步离心后用蒸馏水洗涤2-3次，离心后将所得印度梨形孢菌丝体搅碎后与蒸馏水按质量体积比2:100比例混合，得印度梨形孢菌液。

4.印度梨形孢接种美人蕉湿地

用印度梨形孢菌液浇灌湿地中美人蕉根部区域，每株美人蕉接种10mL，每隔3-7天接种一次，共接种2-3次。

5.美人蕉湿地耐盐脱氮

接种完成后继续培育2-3周，期间保持水位略高于土层表面；然后配置总氮浓度为15.2±2.3mg/L的废水，均分为两份，其中一份添加NaCl配置成盐度为9‰的含盐废水，另一份不添加NaCl为对照，共4个处理分别为未接种美人蕉湿地处理不含盐废水(N)，未接种美人蕉湿地处理9‰盐度废水(S)，印度梨形孢接种美人蕉湿地处理不含盐废水(P)，印度梨形孢接种美人蕉湿地处理9‰盐度废水(PS)，每个处理3个重复。采用序批式运行方式，一次性将废水加入至湿地中，停留7天后，全部排空，然后进入下一批次运行，共运行10个批次，分析不同湿地在各运行批次的总氮去除率。

不同运行批次下各湿地出水TN浓度变化图如图5所示；

不同运行批次下各湿地对总氮的去除率差异图如图6所示；

不同湿地中美人蕉生物量(A)和植物吸收除氮量(B)差异图如图7所示；

不同湿地中美人蕉根系分泌TOC含量差异图如图8所示。

结果显示：在处理无盐含氮废水时，接种印度梨形孢的美人蕉湿地出水TN浓度(0.21-1.64mg/L)显著低于未接种湿地(0.34-2.16mg/L)，最大相差59.2％，接种后湿地对氮的去除率平均较未接种湿地高7.4％-12.3％；而在处理9‰含盐废水时，接种印度梨形孢的美人蕉湿地出水TN浓度(1.85-4.93mg/L)亦显著低于未接种湿地(2.23-5.44mg/L)，对氮的平均去除率较未接种湿地高5.0％-8.1％。在无盐情况下，接种印度梨形孢的美人蕉生物量比未接种美人蕉高27.1％、植物吸收脱氮量提升29.2％；在9‰盐度胁迫下，接种美人蕉生物量较未接种时生物量增加17.3％、植物吸收脱氮量提高34.1％，表明接种印度梨形孢通过促进美人蕉生长、生物量增加，提高了植物吸收脱氮量，从而提升了美人蕉湿地的脱氮效率。另一方面，对4种湿地中植物根系有机碳(TOC)分泌量分析发现，在9‰盐胁迫湿地中的美人蕉根系TOC分泌量显著降低，同时也发现在无盐和9‰盐胁迫下，接种印度梨形孢的美人蕉根系分泌TOC浓度分别比未接种植物高12.0％和41.5％，较高的TOC分泌量可作为有机碳源促进反硝化脱氮，从而提高脱氮效率。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：将益生内生真菌印度梨形孢度梨形孢接种到人工湿地植物根部，印度梨形孢在植物根部定殖后对植物的促生效应和诱导植物耐盐抗性的特点，促进植物生长并提高其耐盐能力，通过提高植物吸收脱氮以及促进根系有机碳源分泌等根际效应提升人工湿地对无盐和含盐废水的脱氮效率。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。