建鲤剩余采食量性状相关的SNP遗传分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种和分子生物学领域，涉及一种与建鲤（

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

中国是世界最大的鲤鱼养殖国家，其鲤鱼养殖面积占全球总面积的三分之二以上，鲤鱼年产量在我国淡水鱼中仅次于草鱼、鲢鱼和鳙鱼，排名第四，年产值约370亿元。建鲤是我国重要的鲤鱼养殖品种，因其体型颜色漂亮、生长速度快、抗逆性强、产量高，深受消费者和养殖户欢迎。随着饲料原材料价格上涨，鲤鱼饲料成本一路走高，因此如何节约饲料成本，进而提高生产效率是鲤鱼饲养过程中受关注的关键问题之一。

剩余采食量（RFI）定义为实际采食量与预期采食量之差，将能量分为维持能和代谢能，在个体中的表现主要是个体代谢效率上的差异，与体重等生产指标不存在相关性，可以作为一个更好的指标衡量饲料效率。研究表明，剩余采食量作为评价饲料利用效率的表型性状具有中等遗传力，有很好的选择反应。目前，RFI的研究多在禽畜中进行，鱼类RFI鲜见报道。选择RFI优良的基础群体，进行遗传选育，不仅有利于节约饲料成本，而且减少剩余饲料和粪便对水质的污染，低碳环保。

通过高通量测序技术，揭示RFI性状的遗传调节机制，遴选出特定表型潜在的分子标记，提高性状遗传预测的准确性。具体为，通过将RFI表型和基因组数据进行关联分析，寻找影响建鲤RFI的显著SNP位点，并鉴定出有效SNP标记，为性状早期选择和加速遗传选育进程提供有力工具。然而，尚未有鱼类RFI相关遗传分子标记的报道。

发明内容

本发明公开提供与建鲤剩余采食量相关的SNP分子遗传标记NC_056618.1-18426059，表示鲤第B22染色体NC_056618.1序列上的第18426059位。该标记表明不同基因型建鲤的剩余采食量存在差异，并进行通过建鲤剩余采食量的与全基因组SNP遗传标记的关联分析，筛选影响建鲤剩余采食量的效应遗传标记，应用于建鲤的选育，选留低剩余采食量，可有效降低生产过程中饲料消耗量，提高企业经济效益和竞争力，其中涉及的NC_056618.1-18426059遗传标记即SNP号为NC_056618.1-18426059的突变位点，见NCBI中鲤鱼基因组数据库（ASM1834038v1）。

本发明一方面，公开了一种与建鲤剩余采食量性状相关的SNP分子遗传标记，该标记位于B22号染色体NC_056618.1序列的18426059位点，位于LOC109046551和LOC109046550之间，该位点为一个C>T突变（突变位点，C>T即表示一个位点不同突变等位基因，C为大频率的等位基因，T为小频率的等位基因，符号>表示等位基因频率大小）。

进一步的，所述SNP分子遗传标记的突变位点及上下游序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：5’-CTTCACCTTAATACTGGCGTGTGTCTGCCAGGCGGATGCGTGCAGCTGGGGGGCCTCAAGGACAACAAAGATCTTGCATTAGTCGACAATCAGCTTCCAATGGTTGCCCCCCATGGGGATCTTACCTCGAGGGTTTGGGCCAGAAGCGTCCTTTCCAACCGCCCACCTCCTCAGAATTTGTAAATCAATGCACCAACACAAATGTTATTTTGCACCCAGCAGGAACCTCCAGCAAAGCACATCTTGTTTCATATCCTCAGAAAAAATTTGACCCCTTAGGCTCTGTTCAAGCTGAGGTTTATTGCCCAACCAACACAGn（C>T）ATCTCCCATTCCTTAAGAAATGCAAGAAATTTTTTGTTGTCGACACCAGCAGACAAGTCAAAGCAACACGCTGGTAAAATGTGACCACAAACAGACGCAATTCAGGCCGTCTTTGACCACAGGCAGCTCAAAGTGCTGATGTCTAGGT-3’；n为突变位点，上述序列的n是C或T时，导致上述序列多态性；5’-和-3’分别表示核苷酸序列的5’端和3’端。

本发明另一方面，提供一种确定上述SNP分子遗传标记的方法，具体步骤如下：

（1）培育健康的建鲤个体，选取剩余采食量最低和最高的建鲤取血保存；

（2）提取DNA，进行DNA质量测定；

（3）确定建鲤剩余采食量性状关联的SNP分子遗传标记。

本发明另一方面，提供一对上述SNP分子遗传标记的引物，所述引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-CTTCACCTTAATACTGGCGT-3’；反向引物序列如SEQ IDNO.3所示，具体为：5’-ACCTAGACATCAGCACTTTG-3’。

本发明另一方面，提供一种检测SNP分子遗传标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物。

进一步的，提供一种SNP分子遗传标记试剂盒的使用方法，具体如下：

（1）对待检测个体进行尾部采血，EDTA抗凝，-20℃保存，进行DNA提取；

（2）试剂盒包含2×Taq Master Mix，正、反向引物；

（3）应用sanger测序法对PCR产物进行测序；

（4）选取第B22染色体上第18426059位为CC基因型的纯合个体。

本发明另一方面，提供一种利用上述SNP分子遗传标记、SNP分子遗传标记的引物或SNP分子遗传标记试剂盒在筛选建鲤具有剩余采食量优良性状的个体或亲本的中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）在鱼类中，本发明第一次报道剩余采食量性状相关分子标记及其基因型。本发明提供的分子标记经验证与建鲤剩余采食量性状显著相关，可应用于建鲤的选育，在选育过程中选留低剩余采食量的建鲤，可有效降低生产过程中饲料消耗量，提高企业经济效益和竞争力。

（2）本发明提供一种鉴定上述SNP分子遗传标记的引物和试剂盒，可应用于高效筛选具有剩余采食量优良性状的个体或亲本的建鲤。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：SNP标记曼哈顿图；

图2：SNP分子标记基因型测序图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例：

一、SNP分子标记的筛选流程

选取108尾健康的建鲤个体，进行饱食投喂15天，记录每尾鱼的日摄食量、初试体重和终末体重，进行剩余采食量的计算，根据平均日采食量与中期代谢体重和平均日增重的线性回归方程得到，计算公式如下：

FI＝μ+β

式中，FI代表平均日采食量，μ代表截距，MBW代表试验中期代谢体重，ADG代表平均日增重，β

剩余采食量值越低，即剩余采食量越小，表示生产过程中相同产能所消耗的饲料越少，即节约饲料。选取剩余采食量最低的30尾进行和最高的30尾进行取血保存。对每个样本提取DNA，进行DNA质量测定。使用高通量测序技术进行简化基因组测序。对测序数据进行质量控制和过滤，去除低质量的测序读数和可能的假阳性SNP。将剩余采食量作为表型，与SNP数据进行关联分析。采用emmax软件（http://genetics.cs.ucla.edu/emmax/）的单倍型的混合线性模型（Mixed linear model，MLM）进行GWAS分析。

根据关联分析的结果，发现了一个与鲤剩余采食量性状关联的SNP分子标记，该分子标记位于鲤B22号染色体上，如图1曼哈顿图所示。该SNP分子遗传标记的突变位点及上下游序列如下：5’-CTTCACCTTAATACTGGCGTGTGTCTGCCAGGCGGATGCGTGCAGCTGGGGGGCCTCAAGGACAACAAAGATCTTGCATTAGTCGACAATCAGCTTCCAATGGTTGCCCCCCATGGGGATCTTACCTCGAGGGTTTGGGCCAGAAGCGTCCTTTCCAACCGCCCACCTCCTCAGAATTTGTAAATCAATGCACCAACACAAATGTTATTTTGCACCCAGCAGGAACCTCCAGCAAAGCACATCTTGTTTCATATCCTCAGAAAAAATTTGACCCCTTAGGCTCTGTTCAAGCTGAGGTTTATTGCCCAACCAACACAGn（C>T）ATCTCCCATTCCTTAAGAAATGCAAGAAATTTTTTGTTGTCGACACCAGCAGACAAGTCAAAGCAACACGCTGGTAAAATGTGACCACAAACAGACGCAATTCAGGCCGTCTTTGACCACAGGCAGCTCAAAGTGCTGATGTCTAGGT-3’； R为突变位点，上述序列319位核苷酸处的n是C或T时，即n（C/T）时，导致上述序列多态性；5’-和-3’分别表示核苷酸序列的5’端和3’端。

二、SNP分子标记的验证：

将该SNP分子标记在另一个建鲤群体中验证，共108尾健康个体。进行饱食投喂15天，记录每尾鱼的日摄食量、初试体重和终末体重，进行剩余采食量的计算。挑选低剩余采食量（负值）和高剩余采食量（正值）各30尾个体，取血进行DNA提取。以提取的DNA为模板，加入正向引物（CTTCACCTTAATACTGGCGT）和反向引物（ACCTAGACATCAGCACTTTG），进行PCR反应，PCR体系为20μL，其中2× Taq Master Mix 10μL，正、反向引物各1μL，DNA模板1μL，ddH

对测序结果进行分析，按照每个样品的测序峰图记录每个个体对应基因型（如图2），基因型CC测序图中相应位点只出现一个峰，说明等位基因相同，都为C；基因型CT测序图中相应位点有两个峰，说明等位基因不同，一个为C，一个为T。采用SPSS26.0的单因素方差分析对SNP分子标记的基因型和等位基因与剩余采食量进行分析，结果如表1和表2所示。在此SNP分子标记中，基因型频率和等位基因频率在低剩余采食量组和高剩余采食量组之间都存在极显著差异（P＜0.01）。在低剩余采食量组中，等位基因为C的频率高于等位基因为G的频率，基因型为CC的频率高于基因型为CT的频率，说明第319位的CC基因型个体比CT基因型个体剩余采食量表型更优。进一步说明在所筛选的分子标记的多态性与剩余采食量性状显著相关，为剩余采食量性状相关联SNP位点，可用于建鲤低剩余采食量性状选育。

表1：SNP分子标记基因型在低剩余采食量和高剩余采食量之间的分布差异统计表

表2：SNP分子标记等位基因在低剩余采食量和高剩余采食量之间的分布差异统计表

三、利用SNP标记等位基因进行建鲤剩余采食量性状的辅助分子育种方法：

本方法提供用于检测上述SNP标记的试剂盒，包括上述引物。检测步骤如下：

（1）对待检测个体进行尾部采血，EDTA抗凝，-20℃保存，进行DNA提取。

（2）试剂盒包含2×Taq Master Mix，正、反向引物（正向引物：CTTCACCTTAATACTGGCGT，反向引物：ACCTAGACATCAGCACTTTG，浓度为10mmol/L），ddH

PCR反应具体操作为：以提取的DNA为模板，PCR体系为20μL，其中2× Taq MasterMix 10μL，正、反向引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。

（3）应用sanger测序法对PCR产物进行测序。

（4）根据基因分型结果选留SNP标记NC_056618.1-18426059为CC基因型的纯合个体进行养殖，以降低剩余采食量，有效减少饲料消耗量和养殖成本；选留该标记个体加入核心育种群，能够实现该性状相关等位基因的快速纯合，可为加快遗传选择进展提供技术支撑。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。