海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用、副溶血性弧菌抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用、副溶血性弧菌抑制剂及其制备方法。

背景技术

凡纳滨对虾又称南美白对虾，由于其具有较强的环境适应能力、生长快和抗病力强、经济效益显著等特点，是目前世界上养殖单产最高的对虾品种，也是世界三大高产量对虾养殖品种之一。随着对虾养殖规模的不断提高，对虾养殖病害发生频率亦相应增加，由副溶血性弧菌引起的疾病最为常见，如红体病、红腿病、白斑病、肠炎病、烂鳃病等，导致对虾养殖业蒙受了巨大损失。副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性菌，其致病机理较复杂，是多种致病因子相互作用的结果。副溶血性弧菌常存在于海洋和河口生态系统及鱼、虾、贝类等水产品中。

为了避免经济损失，目前水产养殖业主要使用抗生素对副溶血性弧菌进行防治，但这存在明显的弊端，即：弧菌耐药性的产生、抗生素药物的残留、对水生动物体内微平衡以及免疫力的破坏，因此，寻找一种有效的天然的抗菌物质已成为大家关注的焦点。有相关研究表明花椒籽和大蒜提取物对副溶血性弧菌也有抑制作用，但是抑菌有效物质是通过有机溶剂无水乙醇进行提取，且其制备过程复杂，若要投入水产养殖业，产率过低，成本过高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用、副溶血性弧菌抑制剂及其制备方法。本发明以海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂，能够有效抑制副溶血性弧菌；而且本发明提供的副溶血性弧菌抑制剂的制备方法简单易行、且采用水即可提取有效物质，大大降低了成本。

本发明提供了一种海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到分离液；

b)将所述分离液浓缩，得到副溶血性弧菌抑制剂。

优选的，所述步骤a)包括：

a1)将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到一次分离液和一次残渣；

a2)将所述一次滤渣与水混合煮沸后，固液分离，得到二次分离液和二次残渣；

a3)将所述一次分离液与二次分离液合并，得到分离液。

优选的，所述步骤a1)中，所述煮沸的时间为5～25min。

优选的，所述步骤a1)中，所述煮沸的时间为15～20min。

优选的，所述步骤a2)中，所述煮沸的时间为5～25min。

优选的，所述步骤a2)中，所述煮沸的时间为15～20min。

优选的，所述步骤a1)具体包括：

将海巴戟与水混合浸泡后，加热煮沸和固液分离，得到一次分离液和一次残渣；

所述浸泡的时间为25～35min。

优选的，所述步骤a1)中，所述海巴戟与水用量比为30g∶(140～160) mL；

所述步骤a1)中的海巴戟与步骤a2)中的水的用量比为30g∶(80～120) mL；

所述步骤b)中，所述浓缩为使浓度达到25mg/mL以上。

本发明还提供了一种上述技术方案中所述的制备方法制得的副溶血性弧菌抑制剂。

本发明以海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂，能够有效抑制副溶血性弧菌。本发明还提供了一种上述副溶血性弧菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：a)将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到分离液；b)将所述分离液浓缩，得到副溶血性弧菌抑制剂。本发明先将海巴戟与水混合煮沸提取，再浓缩得到提取液，能够作为副溶血性弧菌抑制剂，有效抑制副溶血性弧菌；而且本发明的制备方法简单易行，且水提即可，无需使用有机溶剂，大大降低了成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为紫外线对海巴戟提取物抑菌能力影响的示意图；

图2为煮沸不同时长下对海巴戟提取液抑菌率影响的示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用。

海巴戟为茜草科巴戟天属植物，又名海巴戟天、四季果、印度桑葚等，国外称之为诺丽。由于海巴戟富含多种活性成分，国际市场已将它定位成药品和保健食品。对海巴戟果的研究与应用目前大都集中在人类医药学和保健领域，几乎没有海巴戟果在水产养殖领域的研究报道。而本发明以海巴戟作为提取对象，能够提取出对副溶血性弧菌有明显抑制作用的有效物质，作为副溶血性弧菌抑制剂使用，发掘了海巴戟提取物作为副溶血性弧菌抑制剂的应用。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到分离液；

b)将所述分离液浓缩，得到副溶血性弧菌抑制剂。

本发明先将海巴戟与水混合煮沸提取，再浓缩得到提取液，能够作为副溶血性弧菌抑制剂，有效抑制副溶血性弧菌；而且本发明的制备方法简单易行，且水提即可，无需使用有机溶剂，大大降低了成本。

关于步骤a)：将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到分离液。

本发明中，所述海巴戟优选为晒干和粉碎的海巴戟，即将海巴戟晒干并粉碎后，进行后续提取。本发明中，所述粉碎的粒度没有特殊限制，优选为 100μm。

本发明中，上述步骤a)优选包括：

a1)将海巴戟与水混合煮沸后，固液分离，得到一次分离液和一次残渣；

a2)将所述一次滤渣与水混合煮沸后，固液分离，得到二次分离液和二次残渣；

a3)将所述一次分离液与二次分离液合并，得到分离液。

关于步骤a1)：

在所述煮沸前，优选先进行浸泡。所述浸泡的温度没有特殊限制，室温下进行即可。所述浸泡的时间优选为25～35min；在本发明的一些实施例中，浸泡时间为30min。

浸泡后，进行加热煮沸。所述煮沸的时间优选为5～25min，更优选为 15～20min，最优选为15min。在本发明的一些实施例中，所述煮沸的时间为 5min、10min、15min、20min或25min。本发明中，所述煮沸的时间是指保持沸腾的时间。本发明中，所述煮沸过程中伴随搅拌，即边煮边搅拌。本发明中，在加热煮沸过程中先用文火煮沸、再用武火煮沸；其中，控制文火煮沸的时间占上述总煮沸时间的15％～25％。

在上述煮沸处理后，进行固液分离。本发明中，所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离方式即可，如过滤等。本发明中，所述过滤优选为采用4层砂布过滤。经固液分离后，得到一次分离液和一次残渣。

关于步骤a2)：

经步骤a1)得到一次分离液和一次残渣后，将所述一次残渣与水混合煮沸。本发明中，优选将一次残渣与水混合直接煮沸，所述直接是指混合后立即加热煮沸，不进行浸泡处理。

本发明中，该步骤中所用水与步骤a1)中所用海巴戟的用量比优选为 (140～160)mL∶30g。

本发明中，所述煮沸的时间优选为5～25min，更优选为15～20min，最优选为15min。在本发明的一些实施例中，所述煮沸的时间为5min、10min、15min、 20min或25min。本发明中，所述煮沸的时间是指保持沸腾的时间。本发明中，所述煮沸过程中伴随搅拌，即边煮边搅拌。本发明中，所述加热煮沸优选为直接武火加热煮沸。

在上述煮沸处理后，进行固液分离。本发明中，所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离方式即可，如过滤等。本发明中，所述过滤优选为采用4层砂布过滤。经固液分离后，得到二次分离液液和二次残渣。

关于步骤a3)：

本发明中，在得到一次分离液和二次分离液后，将二者合并，得到分离液。

关于步骤b)：将所述分离液浓缩，得到副溶血性弧菌抑制剂。

本发明中，所述浓缩的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规浓缩方式即可。本发明中，所述浓缩优选为使浓度达到25mg/mL以上，更优选为50mg/mL以上。经研究发现，本发明所得海巴戟提取液抑制剂的最小抑菌浓度(MIC)为25.00mg/mL，其最小杀菌浓度(MBC)为50.00mg/mL。

本发明还提供了一种上述技术方案中所述的制备方法制得的副溶血性弧菌抑制剂。

本发明提供的制备方法具有以下有益效果：

1、本发明以海巴戟作为提取对象，能够提取出对副溶血性弧菌有明显抑制作用的有效物质，作为副溶血性弧菌抑制剂使用。

2、本发明采用传统煎煮法，对海巴戟果进行有效物质的提取，由于在制备过程中未添加其他任何佐剂，对生态环境友好；因海巴戟果已被定义为人类健康保健品，所以用海巴戟果提取液防控凡纳滨对虾副溶血性弧菌病不会对食用对虾的人的健康产生副作用。

3、本发明采用热水煮沸方法，对晒干粉碎的海巴戟果进行煎煮，此方法简单易行，与有机溶剂无水乙醇相比，成本较低，能够降低凡纳滨对虾养殖中对副溶血性弧菌的防治成本，提高养殖利润。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

1.1原料及制备

原料：晒干的海巴戟果

方法：

S1、取30g晒干的海巴戟果粉碎后，加300mL自来水，浸泡30min后，加热煮沸5min(先文火煮沸1min，后武火煮沸4min，期间边煮边搅拌)，之后，用4层砂布过滤，得到一次滤液和一次滤渣。

S2、向一次滤渣中加入100mL自来水，直接加热煮沸5min，之后，用4层砂布过滤，得到二次滤液和二次滤渣。

S3、将一次滤液和二次滤液合并后，浓缩至30mL，此时所得提取液浓度为1g/mL。

1.2针对副溶血性弧菌进行抑菌试验

(1)菌液的制备

取出甘油冻存的副溶血性弧菌菌株，用灭菌的接种环划线接种于普通营养琼脂平板上，置于28℃恒温培养箱中培养12～16h；挑取单个菌落接种于5mL 营养肉汤固体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养12h后，用无菌生理盐水稀释，至菌液终浓度1.0×10

(2)最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

采用中药抗菌实验试管法测定海巴戟提取物的MIC和MBC。取13支无菌试管依次编号，1号试管加9mL盐度为2％的TCBS液体培养基，其余12支试管，每管加5mL盐度为2％的TCBS液体培养基。移液枪吸取浓度为1g/mL的海巴戟果提取物2mL，加入1号试管中混匀；从1号试管中取5mL加入2号试管摇匀，如此依次倍比稀释直至11号试管，最后从11号试管中吸取5mL弃去。至此， 1～12号试管中海巴戟提取物浓度分别为100.00，50.00，25.00，12.50，6.25， 3.13，1.56，0.78，0.39，0.20，0.10，0.00mg/mL，12号试管为对照。1-12号试管中分别加入浓度为1.0×10

分别取上述培养12～16h和培养48h的试管内液体，采用涂布平板的方法对海巴戟提取物的MIC和MBC值进行进一步验证。结果分别参见表1和表2。

表1添加不同浓度海巴戟提取液培养12h后副溶血性弧菌生长情况

注：“+”表示试管中有菌体生长，“-”表示试管中没有菌体生长。

表2添加不同浓度海巴戟提取液培养48h后副溶血性弧菌生长情况

注：“+”表示试管中有菌体生长，“-”表示试管中没有菌体生长。

添加不同浓度海巴戟提取液，培养12h后，1～13支试管中，4～12号试管内液体混浊，1，2，3号试管内液体澄清，继续培养48h后，3号试管出现轻微混浊，1和2号试管内液体依旧澄清，该结果初步表明，副溶血性弧菌的生长在海巴戟提取液浓度达到25.00mg/mL时明显受到抑制，当海巴戟提取液浓度达到50mg/mL时，副溶血性弧菌不生长。准备副溶血性弧菌培养皿，分别对培养12h和48h的试管内菌液进行涂布培养，培养皿中副溶血性弧菌的生长情况如上表1、表2所示。据此判断，海巴戟提取液的最小抑菌浓度(MIC) 值为25.00mg/mL。继续培养48h后，据此得出其MBC值为50.00mg/mL。

实施例2

滤纸片法测定紫外线对海巴戟提取物抑菌能力的影响

取实施例1所得海巴戟果提取液原液15mL置于灭菌培养皿中进行紫外灯照射，照射时长分别为0min、5min、10min、15min、20min、25min，将副溶血性弧菌作为指示菌，取10μL海巴戟提取物原液吸附于灭菌滤纸片上，用无菌镊子置于含菌平板表面。平板置于30℃生化培养箱中恒温培养12～16 h，观察并记录抑菌圈直径。每个试验组设置三个重复，每个平板放置3片滤纸，抑菌圈直径取平均值。结果参见表3和图1。

表3紫外线照射处理海巴戟果提取液对副溶血性弧菌的抑菌效果

通过控制紫外灯照射时长，对分别照射0，5，10，15，20，25min的海巴戟提取物进行涂布平板抑菌试验，抑菌圈直径如上表1所示，抑菌圈直径分别为11.2mm、8.4mm、8.0mm、6.7mm、0mm、0mm。根据平均值绘制折线图，参见图1，图1为紫外线对海巴戟提取物抑菌能力影响的示意图。结果表明，紫外线会影响海巴戟提取液的抑菌能力，紫外照射时间越长，抑菌能力越弱；当紫外线作用20min及以上时，培养皿中滤纸片周围无抑菌圈产生。

以上结果表明，紫外线照射会影响海巴戟提取液的抑菌效果，紫外照射时间越长，抑菌能力越弱甚至消失，推测紫外线照射可能会分解海巴戟果提取液中的活性物质，从而对其抑菌能力造成影响。凡纳滨对虾的人工养殖大都采用露天养殖场，向养殖池中添加海巴戟提取物时，应避开紫外线较强的时候，因此，最好早晚补给，尤其是在紫外线较强的海南省，以免影响其抑菌作用的发挥。

实施例3

煮沸时长对海巴戟果提取液抑菌作用的影响

按照实施例1的制备过程，分别煮沸0min(即仅浸泡，不煮沸)、5min、 10min、15min、20min、25min；上述煮沸包括两个过程的煮沸，分别为海巴戟与水第一次混合煮沸以及一次滤渣加水后的煮沸，两个过程的煮沸均控制在上述时间。将合并的滤液浓缩至浓度为1000mg/mL后，经121℃、15min 高压灭菌后分别装于EP管中，4℃保存，备用。

取7支试管，对照组编号为0，其余6支依次编号为1～6，0～6号试管中分别加入10mL TCBS培养基，1～6号试管分别加煮沸0min、5min、10min、 15min、20min、25min的海巴戟果提取物3mL，7支试管分别接种5μL副溶血性弧菌，于30℃、180r/min摇床培养12～16h。

另准备7支试管，分别取0～6号试管中的菌液1mL，加9mL PBS缓冲液，得到稀释液A0～A6，接着分别取A0～A6试管中的菌液1mL，加9mL PBS 缓冲液，得到稀释液B0～B6。

制板，分别取B0～B6试管中的菌液5μL，在培养皿上涂布均匀，每支试管设置3个重复，30℃生化培养箱中培养12～16h，观察菌落生长情况，对各个培养皿分别计数并通过以下公式计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照皿菌落数-试验皿菌落数)/对照皿菌落数×100％。

结果参见表4和图2，图2为煮沸不同时长下对海巴戟提取液抑菌率影响的示意图。

表4煮沸不同时长下对海巴戟提取液抑菌率的影响

试验表明，煮沸能够显著提高海巴戟提取液对副溶血性弧菌的抑制作用。如图2所示，浸泡30min(0组)和对照组之间差异不显著，煮沸5min和浸泡30min相比差异显著，但是和煮沸10min差异不显著。分别煮沸15，20， 25min和煮沸5，10min相比差异极显著，但是三者之间差异不显著。煮沸0， 5，10，15，20，25min的海巴戟提取液对副溶血性弧菌的抑菌率分别为12.64％， 45.76％，48.64％，71.68％，71.36％，70.88％(参见表4)。根据试验结果，分别煮沸0，5，10，15min时，海巴戟提取液的抑菌率依次增大，15min后，煮沸时长对其抑菌作用的几乎没有影响。煮沸15min的海巴戟提取液抑菌效率最大。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。