一种用于检测人乳头瘤病毒HPV73的探针及其试剂盒

本发明涉及一种探针及其试剂盒，具体涉及一种可用于人乳头瘤病毒HPV73基因捕获、测序的探针及试剂盒。

宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。宫颈癌在中国15~44岁女性各癌症发病率中居第二位，死亡率居第三位。大量研究证实，宫颈癌发生主要是由高危型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）持续感染所致，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在。目前，HPV基因型已鉴定出200余种，约40种与生殖道感染相关。根据其导致宫颈癌风险的高低将HPV分为高危型和低危险、型，其中高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。这18种型别的HPV主要与宫颈上皮内瘤变、CINⅡ、Ⅲ级和宫颈癌的发生相关。低危型一般与恶性病变无关，主要引起尖锐湿疣和低级别CIN（CINI）。因此，通过检测宫颈脱落细胞中是否有高危型HPV感染，并定期检测宫颈脱落细胞中HPV病毒是否持续性感染在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。

通常情况下，HPV感染寄主细胞之后以游离状态存在，其DNA仍自由存在寄主细胞的细胞质中，随寄主细胞的分裂复制，HPV DNA就会插入人体基因组，这个过程也称为HPV整合。一旦HPV DNA偶然整合至宿主细胞染色体中，病毒蛋白将无秩序复制，宿主细胞遗传物质结构及相关基因表达发生变化，导致主体细胞不可控制地分裂，从而诱发癌变。尽管99.7%以上的宫颈癌中均检测出HPV DNA，但却不是每一个感染高危型HPV的患者均发生了宫颈癌。随着分子生物学和细胞遗传学的进展，HPV与宿主染色体的整合才是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤，是导致宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性进展的一个重要标志。在90%以上的宫颈癌组织中均发现HPV与宿主细胞染色体的整合体，HPV与宿主细胞基因组的整合是宫颈癌发展的最重要的危险因素。低危型HPV很少导致宫颈癌，与在宿主体内的病毒载量无关，是因为其很少发生病毒整合。高危型HPV分别在HSIL和鳞状细胞癌中的整合率分别为76.2%和88.2%，在LSIL中仅37%。HPV以非游离状态存在于侵入性宫颈癌中（约60.9%），较原位癌高出20%。HPV16阳性宫颈癌病例中近90%整合，纯游离形式存在的病例仅16%。说明病毒整合发生率与宫颈癌发病率成正相关，病毒整合状态与宫颈癌病情程度成正相关。HPV DNA与人基因组整合将作为宫颈病变程度的标志物，对宫颈癌的早期诊断具有非常重要的意义。

宫颈癌早期症状不明显，只有尽早地对宫颈癌做出早期筛选预警，才能有效降低由宫颈癌引起的死亡率。传统的病理学检测手段，如宫颈涂片检测，易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型等弊端。目前临床上常用的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法，该方法检测通量低，对于不同型别的HPV要分别检测，很难满足临床上同时进行多个型别的检测的需求，对于宫颈癌的大规模筛查不太适合。更重要的是，目前所用的这些方法只能对有无HPV感染及HPV感染型别做出判断，对于HPV DNA是否与人基因组发生整合没法做出判断，而HPV整合事件是宫颈癌发生的重要因素。高通量测序技术（next-generation sequencing technology）具有准确、灵敏度高、快速和低成本的优点，可同时对多个基因进行测序，该方法不只可以实现HPV分型检测，同时可以实现HPV整合检测。液相杂交基因捕获技术可以将目标区域相关基因片段富集，结合新一代基因测序技术，能够极大地降低人类基因测序、基因学研究及基因诊断的成本，提高测序深度，更精确地发现特定区域变异信息。而捕获探针的设计是液相杂交捕获技术的核心。综上所述，本发明提供一种用于检测HPV分型及整合的探针组及试剂盒，可一次性对18种高危型HPV进行精确分型并确定其在人基因组中的整合情况，具有一次性处理多个样本、灵敏度高和特异性高的优点，临床意义重大。

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种用于检测HPV的捕获探针组及其试剂盒；本发明根据上述18种HPV全基因组序列设计合成探针序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增和测序，以达到检测样本的目的。所述探针组包含能特异性捕获全部18种HPV基因组的探针。可以全面、快速、准确的检测18种HPV分型及5种HPV整合情况，所述18种HPV分型分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82；5种HPV整合分别为HPV16、18、33、52、58。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒HPV73分型和整合的探针，探针信息见表1

本发明还提供了一种用于检测人乳头瘤病毒HPV73分型和整合的试剂盒。所述试剂盒包括本发明所述的用于检测人乳头瘤病毒HPV73分型和整合的探针；较佳的，所述试剂盒还包括建库缓冲液1、建库缓冲液2、酶1、酶2、接头、PCR扩增引物1、PCR扩增引物2、PCR反应混合液、封闭序列1、封闭序列2、封闭试剂、杂交缓冲液、PCR扩增缓冲液、PCR扩增引物3、PCR扩增反应液、阳性对照、阴性对照、捕获缓冲液、清洗缓冲液1、清洗缓冲液2和捕获磁珠；优选所述封闭序列1为Cot-1 DNA，封闭序列2为双链寡核苷酸。

进一步的，所述试剂盒各组成成分如表2所示。

本发明还公开了一种使用所述用于检测人乳头瘤病毒HPV73分型和整合的探针及其试剂盒的方法，主要包括以下几个步骤：

(1)设计HPV73的捕获探针

(2)样本DNA提取、片段化及构建DNA文库

(3)文库目标区域靶向捕获及定量

(4)高通量测序

(5)基因序列的生物信息分析

本发明提供一种对HPV基因进行捕获的方法，具体捕获过程包括：提取宫颈脱落细胞全基因组DNA，将其随机打断成200-300bp大小的片段后，部分片段含有HPV基因的序列，构建DNA文库；用本发明涉及的HPV探针（携带生物素标记，能特异性和HPVDNA序列杂交结合）与构建的预文库杂交，含有HPV基因的序列通过探针上生物素与磁珠结合，可以被特异性杂交；将不含HPV的序列洗涤除去，从而富集HPV基因片段，这样该试剂盒就将HPV序列捕获了出来；通过测序仪Nextseq CN500高通量测序并分析测序结果中的HPV信息，可获得待测样本的HPV基因型别及是否与人基因组发生整合情况。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明设计了可进行快速准确地捕获HPV73基因组全序列的探针，可以有效的提高检测特异性。以往的荧光定量PCR等方法都是只针对HPV序列的某一段区域，我们的探针检测范围可以覆盖HPV基因组全长。

（2）本发明利用HPV探针对捕获出目标区域的文库标本利用高通量测序技术测序。由于先使用HPV探针对HPV序列进行了靶向富集捕获，然后再进行高通量测序，使得其检测灵敏度高。

（3）本发明可以一次处理多个样本，通过对多个不同的样本加入不同Barcode进行区分，然后混合上机测序，可以有效的提高检测通量。

图1为末端修复、3’端加“A”反应PCR 仪参数；

图2为Pre-PCR 程序参数。

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。如无特殊说明，本发明所使用的本领域常用试剂均可通过商购途径获得。

实施例1：本发明探针组的设计和制备

根据碱基互补配对原则，针对HPV73的DNA序列设计与之互补配对的寡核苷酸探针。由于基因组序列结构复杂，存在不规则区域，例如高GC、高AT区域等，同时由于二代测序读长的限制，从而使得探针设计变得尤为关键，需要综合权衡覆盖率、均一性、捕获效率等多种因素。探针设计的具体原则如下：

（1）长度：可选区间80-150bp，一般选100bp。

（2）探针层数：即目标区域上平均被多少条探针所覆盖，一般建议3层，且需叠瓦式设计。

（3）特异性：即探针在基因组范围的唯一性，特异性越高，探针的捕获效率越高。应避免在低复杂度区域设计探针；但在特殊情况下，比如，某些热点恰好位于低复杂度区域，那么需要综合评估该区域以及相邻区域的序列情况，谨慎放置探针。

（4）结合能力：GC含量在50%左右的区域，其探针捕获能力最强。高GC区域探针结合能力强，但DNA片段自身结合能力更强（长度更长），探针竞争阻力较大；高AT区域的DNA片段自身结合能力弱，但同样探针与之结合的能力也弱，因此，在高GC和高AT区域需要适当增加探针数量来弥补竞争阻力和结合能力方面的劣势。

探针制备：先用光化学合成法，在芯片上大量合成设计的探针，再通过PCR或转录反应得到被生物素标记的探针。

实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用

本实施例所述的用于HPV检测的试剂盒试剂。

所述试剂盒组成成分包括：本发明所述的用于检测HPV的捕获探针、建库缓冲液1、建库缓冲液2、酶1、酶2、接头、PCR扩增引物1、PCR扩增引物2、PCR反应混合液、封闭序列1、封闭序列2、封闭试剂、杂交缓冲液、PCR扩增缓冲液、PCR扩增引物3、PCR扩增反应液、阳性对照、阴性对照、捕获缓冲液、清洗缓冲液1、清洗缓冲液2和捕获磁珠。具体组成成分信息如表2，

所述试剂盒的使用方法为：

1、样本文库制备

（1）片段化：将1000 ng DNA取出解冻后震荡混匀，加水补齐至100μL，利用BioruptorPico超声打断仪打断。具体参数设置如下：待冷循环仪温度降至4°C后，设置参数ON 30秒，OFF 30秒为1个循环，每10 个循环为一轮，共进行3 轮；取1 μL样品使用Qsep1进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150 bp-200 bp。

（2）末端修复加A：将上一步获得的样品进行末端修复、3’端加“A”。具体反应体系如下：35 μL DNA片段，5 μL ERA缓冲液，10 μL末端修复酶。混好后，运行 PCR 程序，设置PCR 仪参数如图1（50 μL体系，热盖85°C）；

（3）加接头：将上一步获得的样本进行接头连接。具体反应体系如下：50 μL上一步反应结束的样品，5 μL接头，15 μL无酶水，20 μL链接缓冲液，10 μL连接酶；混好后，运行PCR仪程序（要求无热盖），设置PCR仪参数：热盖关，20°C 30 分钟，降至4℃结束

（4）磁珠纯化：程序结束后，立即用纯化磁珠纯化上一步反应产物。纯化体系如下：100μL上一步反应产物，100 μL纯化磁珠。

（5）Pre-PCR扩增反应：以上一步的纯化产物为模板，进行Pre-PCR反应。具体反应体系如下：20 μL上一步的纯化产物，25 μL PCR反应混合液，2.5 μL PCR扩增反应引物1(20 μM)，2.5 μL PCR扩增反应引物2(20 μM)。混好后，将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如图2所示（50 μL体系，热盖温度105°C）；

注：PCR扩增反应引物1中TPE1.0index号为1#~8#（表3）；PCR扩增反应引物2中TPE2.0index号为1#~12#；记录好所使用的index号（表4）。

（6）磁珠纯化：程序结束后，立即用50 μL纯化磁珠纯化上一步反应产物。

2、样本液相杂交

（1）静置解冻封闭序列1和封闭序列2，配制混合液1，具体为：750ng文库，5 μL封闭序列1，2 μL封闭序列2。

（2）取出试剂盒中的封闭试剂和探针，静置解冻后振荡混匀，按照5 μL封闭试剂与2 μL探针配制混合液2（冰上操作）。

（3）取出试剂盒中的杂交缓冲液置于室温化冻，化冻后取出20μL置于65°C恒温混匀仪孵育待用。

（4）将13μL杂交缓冲液添加到混合液2中，吹打混匀后短暂离心收集液体，室温放置待用。

（5）使用可控温真空干燥仪，设置干燥温度45-50℃，打开管盖，直至混合液1浓缩至体积小于10 μL，用无酶水补齐至10μL，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用。浓缩时间不宜过长，防止蒸干。

（6）将浓缩后的混合液2置于PCR仪中95°C孵育5min，65°C孵育2min（热盖温度为105°C），孵育完成后不需要取出。

（7）将添加了杂交缓冲液的混合液1置于PCR仪中65°C孵育2min（热盖温度为105°C）。

（8）吸取20μL的混合液1添加到混合液2中，充分混匀，65°C杂交16~24 h，保持杂交产物在PCR仪中，进入捕获步骤。

3、捕获

（1）提前取出试剂盒中的磁珠室温平衡30min，振荡混匀。

（2）取出50μL磁珠置于新的反应管中，离心管置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（3）在磁珠中添加200µL捕获缓冲液，吹打混匀后，将离心管置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（4）重复步骤（3）三次。

（5）在磁珠中重新添加200µL捕获缓冲液重悬磁珠，将重悬后的磁珠加入到杂交产物中，并将PCR管置于旋转混旋仪上室温结合30min。

（6）取出试剂盒中的清洗缓冲液1和清洗缓冲液2，清洗缓冲液1室温静置待用，清洗缓冲液2置65℃预热5min以上待用。

（7）将捕获产物置于磁力架上静置1分钟静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（8）从磁力架上取下离心管，加入200 μL的清洗缓冲液1，吹打混匀后，旋转混匀仪上15min，放在磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（9）从磁力架上取下离心管，加入200 μL 65℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀后，置于恒温震荡仪（65℃，800rpm）上10分钟，置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（10）重复步骤（9）三次。

（11）从磁力架上取下离心管，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，置于磁力架上静置30sec至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）

（12）反应管留于上磁力架室温晾干3~5min使残留乙醇挥发，以磁珠表面无光泽为准（过分晾干将导致DNA得率下降）。

（13）从磁力架上取下离心管，加入30μL无酶水，重悬磁珠待用。

（14）配制混合液3，用0.2mL PCR管，具体反应体系如下：18μLPCR扩增缓冲液，1μLPCR扩增引物，1μLPCR扩增反应液。

（15）将20μL上述反应体系加入到洗涤产物中，充分混匀。

（16）置于PCR仪中按表5反应程序进行PCR扩增。

（17）扩增后纯化，使用商品化的核酸纯化磁珠进行扩增产物纯化，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。吸取全部纯化产物置于冰上，重复2-3步骤，进入测序阶段或于-20±5℃保存。

4、捕获文库质控

（1）使用核酸定量试剂盒QubitdsDNA HS Assay Kit 及配套仪器测定文库的浓度，文库浓度应大于1ng/μL。否则文捕获文库不符合要求，应重新进行杂交捕获。

（2）取样本文库或对照品文库，使用Standard Cartridge Kit(S2)及配套仪器测定文库片段大小，文库片段大小应集中在250bp～500bp之间，无明显小片段和大片段杂峰。否则建库样品不符合要求，应重新进行杂交捕获。

5、文库qPCR定量

使用KAPA Library Quantification Kit试剂盒对待上机富集文库进行定量，以调整至合适上机浓度。

（1）试剂准备：1）准备适量的DNA稀释缓冲液：使用无酶水将1XIDTE缓冲液稀释至0.1X，每个文库约需1.2mL稀释缓冲液。使用前将缓冲液放至室温。2）冰上解冻试剂盒中各组分，使用前充分混匀，短暂离心，置于冰上备用。

（2）样本准备：1）准备适当的文库稀释液（使用无酶水）。取1μL富集文库进行1：100、1：10000、1：20000稀释。

（3）向PCR反应板需要进行反应的孔中各加入混有引物的8μL混合液，混合液具体组成为：5μLMaster Mix，1μL引物，1.8μL水，0.2μLLow Rox。

（4）向每个样本孔中加入对应的2μL已稀释的DNA文库（体积比为1:1000和1:20000）。

（5）向标准品孔中各加入2μL DNA标准品，按照从低浓度到高浓度顺序加入。

（6）向阴性对照孔中加入2μL稀释缓冲液。

（7）密封PCR 反应板，放入微孔板离心机中离心1min。

（8）将反应板装载到qPCR仪上并按照下表6参数运行qPCR仪。

（9）按照KAPA Library Quantification Kit试剂盒说明书进行待检文库的浓度计算。若最终文库总摩尔质量<0.02p 摩尔，需要重新进行文库杂交富集或重新进行建库，若再次不合格，终止检测。

6、上机测序

在基因测序仪Nextseq CN500上选用测序读长为300循环（Paired-End Reads，2×150cycles）的测序试剂进行测序，建议每个样品文库测序数据量800M。待测序样本文库数量不高于48个，推荐使用NextSeq 500 Mid Output v2 Reagent kit (300 cycles) 试剂检测；待测序样本文库数量高于48个且不高于96个，推荐使NextSeq 500 High Output v2Reagent kit (300 cycles) 试剂检测。

（1）提前取出Reagent Cartridge、HT1和Flow Cell，Flow Cell置于室温平衡30min，Reagent Cartridge置于室温水浴1h，HT1室温静置解冻后振荡混匀。

（2）将所有待测序样本文库按测序数据量需求进行混合，使用核酸定量试剂盒QubitdsDNA HS Assay Kit及配套仪器稀释各文库浓度至4 nM，取一个新的离心管等体积取各文库混合，混合后的总体积不低于5μL。

（3）配制新鲜的0.2N NaOH，由1μL 1N NaOH加入到4μL纯化水中混匀得到。

（4）取5μL 4 nM混合文库至新的1.5 mL离心管中，加入5μL新鲜配制的0.2N NaOH，吹打混匀室温静置5min进行4 nM混合文库变性，变性后加入混匀后的990μLHT1将混合文库稀释至20 pM。

（5）取一个新的1.5 mL离心管加入混匀后的1365μL HT1。

（6）取135μL稀释至20 pM的混合文库加入至1365μL HT1中，使最终上机混合文库总体积为1500μL。

（7）取出室温水浴解冻的Reagent Cartridge，用无尘纸檫干，翻转5次混匀其中试剂。

（8）使用干净的1 mL移液器吸头戳破Reagent Cartridge上带有Load Samples标签的10号孔封箔口，将1300μL混合有PhiX对照品的最终上机混合文库注入10号孔。

（9）根据测序仪运行设置提示进行试剂加载操作，测序仪自检完成后，点击“开始”按钮进行测序，测序时长26-29h。

7、HPV核酸分型与整合生物信息分析流程

（1）测序完成后，使用illumina公司的bcl2fastq v2.20.0.422软件将测序生成的BCL文件转化成样本对应的fastq文件。

（2）使用illuminate v0.6软件读取测序文件中InterOp目录的记录信息，对本次测序进行质量分析与评估。Fastp v0.20.0进行质控，要求Q30质量值大于80%。

（3）质量评估完成后，预处理数据，根据fastq文件碱基及质量，对原始数据进行质量控制（基于fastp v0.20.0软件）。

（4）序列比对：将fastq文件中的碱基序列比对至人类参考基因组hg38（GRCh38）和HPV基因组上生成bam文件（基于BWA v0.7.17、samtoolsv1.9和picard v2.20.6软件：比对）。

（5）HPV型別分析：使用分型检测模块（基于hpvHPVkitTyper v1.0软件），通过序列比对文件分析样本中各种HPV的reads数和比例。

（6）HPV整合分析：使用整合检测模块（基于hpvkitHPVFusionCallerv1软件），通过序列比对文件中比对上HPV和人基因组的序列进行位点比较，分析样本中HPV整合位点，并结合数据库进行注释。

（7）结果判定：分型分析，单个HPV型別Mean depth≥10则判定为该型别分型阳性；整合分析，单位数据量中HPV整合read数≥3则判定为该型别整合阳性。

实施例3：本发明试剂盒的使用效果验证

下面通过具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

1、20例参考品样本和16例临床样本HPV分型整合的高通量测序检测

样本编号为S1~S36,其中S1~S18为10^4拷贝 /mL的分型质粒参考品，分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82，S19和S20分别是浓度为0.25ng/μL的SiHa细胞（已知的HPV16整合样本）和HeLa细胞DNA（已知的HPV18整合样本），S21~S36为临床样本。检测结果：我们利用本发明的方法及试剂盒检测到了参考品样本对应的HPV型别及整合状态，说明本发明可对实际样本进行准确快速的检测，有实际可使用价值。本发明提供的用于HPV分型及整合检测的探针组及试剂盒具有操作简便、高通量、特异性好、灵敏度高等特点。结果如下：表7为36例样本高通量测序质控结果，表8为36例样本高通量测序分型结果，表9为18例样本高通量测序整合结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉凯德维斯生物技术有限公司

<120> 一种用于检测人乳头瘤病毒HPV73的探针及其试剂盒

<130> 0

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23253

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针型别HPV73

<400> 1

actataatgt actattaaaa aaaagggtgt aaccgaaaac ggtttcaacc gaaatcggtg 60

catataaaag taggaaagca aaaaacgcta cagattggga ccgaaaacgg tttcaaccga 120

aatcggtgca tataaaagta ggaaagcaaa aaacgctaca gattgggaac gtatgtttcc 180

caattcagaa gaacgaccat aaagtaggaa agcaaaaaac gctacagatt gggaacgtat 240

gtttcccaat tcagaagaac gaccatacaa gctacaagcg ttatgtgacg aagtgaatat 300

ggaacgtatg tttcccaatt cagaagaacg accatacaag ctacaagcgt tatgtgacga 360

agtgaatatt tctatacatg atataaacct ggactgtgtg acaagctaca agcgttatgt 420

gacgaagtga atatttctat acatgatata aacctggact gtgtgttttg ccaacgtgga 480

ctgtacagat ctgaggtata tttctataca tgatataaac ctggactgtg tgttttgcca 540

acgtggactg tacagatctg aggtatatga ttttgcattt agtgatttgt gtattgtata 600

ttgccaacgt ggactgtaca gatctgaggt atatgatttt gcatttagtg atttgtgtat 660

tgtatataga aaggataaac catatggtgt atgtcaaccg atgattttgc atttagtgat 720

ttgtgtattg tatatagaaa ggataaacca tatggtgtat gtcaaccgtg tttaaaattt 780

tattctaaaa ttagagagta tagaaaggat aaaccatatg gtgtatgtca accgtgttta 840

aaattttatt ctaaaattag agagtatagg cgatatagac aatcagtata tggcactacg 900

ccgtgtttaa aattttattc taaaattaga gagtataggc gatatagaca atcagtatat 960

ggcactacgt tagaaaattt aactaacaaa cagttatgta ataggcgata tagacaatca 1020

gtatatggca ctacgttaga aaatttaact aacaaacagt tatgtaatat tttaataagg 1080

tgcggaaacg tacaaaaacc cgttagaaaa tttaactaac aaacagttat gtaatatttt 1140

aataaggtgc ggaaacgtac aaaaaccatt atgtccactg gaaaagcaaa agcatgtaga 1200

tattttaata aggtgcggaa acgtacaaaa accattatgt ccactggaaa agcaaaagca 1260

tgtagatgaa aaaaaacggt ttcatcaaat agcagaacag cattatgtcc actggaaaag 1320

caaaagcatg tagatgaaaa aaaacggttt catcaaatag cagaacagtg gaccggacgc 1380

tgtacacggt gctggagacc gatgaaaaaa aacggtttca tcaaatagca gaacagtgga 1440

ccggacgctg tacacggtgc tggagaccat ctgcaactgt ggtgtaagcg taatggaaaa 1500

cagtggaccg gacgctgtac acggtgctgg agaccatctg caactgtggt gtaagcgtaa 1560

tggaaaaaaa acaaccttgc aggacattac tttagacctg catctgcaac tgtggtgtaa 1620

gcgtaatgga aaaaaaacaa ccttgcagga cattacttta gacctgaaac caacaaccga 1680

aattgacctt acatgttacg aaacaacctt gcaggacatt actttagacc tgaaaccaac 1740

aaccgaaatt gaccttacat gttacgagtc attggacaac tcagaggatg aggatgaaac 1800

aaaccaacaa ccgaaattga ccttacatgt tacgagtcat tggacaactc agaggatgag 1860

gatgaaacag acagccatct agacagacaa gctgaacgag cgagtcattg gacaactcag 1920

aggatgagga tgaaacagac agccatctag acagacaagc tgaacgagag tgttacagaa 1980

tagttactga ctgcacgaag acagacagcc atctagacag acaagctgaa cgagagtgtt 2040

acagaatagt tactgactgc acgaagtgtc agtgcacagt cgtacttgcc attgaaagca 2100

gagtgttaca gaatagttac tgactgcacg aagtgtcagt gcacagtcgt acttgccatt 2160

gaaagcaaca aagctgattt aagagtgata gaagagttgc gtgtcagtgc acagtcgtac 2220

ttgccattga aagcaacaaa gctgatttaa gagtgataga agagttgctt atgggtacac 2280

taggtattgt gtgccccaac gcaacaaagc tgatttaaga gtgatagaag agttgcttat 2340

gggtacacta ggtattgtgt gccccaactg ttccagaaac ctataaaaga agatggctga 2400

gcttatgggt acactaggta ttgtgtgccc caactgttcc agaaacctat aaaagaagat 2460

ggctgattca ggtaattggg aagggaggtg tacgggatgg gttccagaaa cctataaaag 2520

aagatggctg attcaggtaa ttgggaaggg aggtgtacgg gatggtttaa tgtagaagcc 2580

attgtagaaa gaaaaacagg caggtaattg ggaagggagg tgtacgggat ggtttaatgt 2640

agaagccatt gtagaaagaa aaacagggga tccaattcca gaggatgaaa attatgatgg 2700

ggggatccaa ttccagagga tgaaaattat gatggagggg atacagatga gtcggaaatg 2760

ggggatttta ttgatacgta acatatacca aatatatatg ggaggggata cagatgagtc 2820

ggaaatgggg gattttattg atacgtaaca tataccaaat atatcgtaac aacaggaaat 2880

tgcacaggca ttgtatcagt ttattgatac gtaacatata ccaaatatat cgtaacaaca 2940

ggaaattgca caggcattgt atcagtcaca gcaagcaacg taagacaatg aggctatacg 3000

gcacaacagg aaattgcaca ggcattgtat cagtcacagc aagcaacgta agacaatgag 3060

gctatacgtg ttctaaaacg aaagtttaca ggtagtcctg gtcacagcaa gcaacgtaag 3120

acaatgaggc tatacgtgtt ctaaaacgaa agtttacagg tagtcctggc ggtagcccag 3180

atatgaaaag agatgaattc cgtgttctaa aacgaaagtt tacaggtagt cctggcggta 3240

gcccagatat gaaaagagat gaattcatag acaaacagct tagtccacaa ataaatgtat 3300

ggcggtagcc cagatatgaa aagagatgaa ttcatagaca aacagcttag tccacaaata 3360

aatgtattgt caataagtag cggtagaagt acatctaaac agacaaacag cttagtccac 3420

aaataaatgt attgtcaata agtagcggta gaagtacatc taaacgaaga ctgtttgagg 3480

agcaggacag tggatatggc ttgtcaataa gtagcggtag aagtacatct aaacgaagac 3540

tgtttgagga gcaggacagt ggatatggca atactgaagt ggaaacttac gagacagagg 3600

aagactgttt gaggagcagg acagtggata tggcaatact gaagtggaaa cttacgagac 3660

agaggtaccg ggacttgggg caggggtagg gtgtttacaa ggcaatactg aagtggaaac 3720

ttacgagaca gaggtaccgg gacttggggc aggggtaggg tgtttacaaa atgttaatga 3780

agaaggcaac caaattgtgt gtaccgggac ttggggcagg ggtagggtgt ttacaaaatg 3840

ttaatgaaga aggcaaccaa attgtgtcgc cacgtgaaag cagtagtggg tccagtagca 3900

caaaatgtta atgaagaagg caaccaaatt gtgtcgccac gtgaaagcag tagtgggtcc 3960

agtagcattt caaatatgga tatagaaaca gagagcacac gtcgccacgt gaaagcagta 4020

gtgggtccag tagcatttca aatatggata tagaaacaga gagcacacct ataacagata 4080

ttacaaattt attacaaagg gcatttcaaa tatggatata gaaacagaga gcacacctat 4140

aacagatatt acaaatttat tacaaaggaa tacgtaaaaa gcagcattgc tagcaaaatt 4200

cctataacag atattacaaa tttattacaa aggaatacgt aaaaagcagc attgctagca 4260

aaatttaaag aagtatatgg gttaagttat atggaattag aatacgtaaa aagcagcatt 4320

gctagcaaaa tttaaagaag tatatgggtt aagttatatg gaattagtta gaccatataa 4380

aagtgataaa acacattgcc agaagtatat gggttaagtt atatggaatt agttagacca 4440

tataaaagtg ataaaacaca ttgccaagat tgggtgtgtg ctgtgtttgg tgtaataccc 4500

gttagaccat ataaaagtga taaaacacat tgccaagatt gggtgtgtgc tgtgtttggt 4560

gtaataccct cacttgcaga aagtttaaaa tccttactaa gccaagattg ggtgtgtgct 4620

gtgtttggtg taataccctc acttgcagaa agtttaaaat ccttactaac acagtattgt 4680

atgtatatac atttgcagtg ccctcacttg cagaaagttt aaaatcctta ctaacacagt 4740

attgtatgta tatacatttg cagtgtttaa catgtacatg gggcataata gtgttagtat 4800

cacagtattg tatgtatata catttgcagt gtttaacatg tacatggggc ataatagtgt 4860

tagtattagt aagatttaag tgcaataaaa atagactaac ttaacatgta catggggcat 4920

aatagtgtta gtattagtaa gatttaagtg caataaaaat agactaacag tgcaaaaatt 4980

attaagtagt ttattaaatg tagtaagatt taagtgcaat aaaaatagac taacagtgca 5040

aaaattatta agtagtttat taaatgtaac acaagaacgc atgttaattg aacctccaag 5100

acagtgcaaa aattattaag tagtttatta aatgtaacac aagaacgcat gttaattgaa 5160

cctccaagac tacgaagtac accatgtgca ttatattggt gtaacacaag aacgcatgtt 5220

aattgaacct ccaagactac gaagtacacc atgtgcatta tattggtata gaactagttt 5280

atcaaatatt agtgaaatag gactacgaag tacaccatgt gcattatatt ggtatagaac 5340

tagtttatca aatattagtg aaatagtagg agacacacct gagtggatta aaagacaaac 5400

gtaggagaca cacctgagtg gattaaaaga caaacgttag tgcagcatag tttagatgat 5460

agtcaatttg acctatctca aatgatacag tgggcatttg acgttagtgc agcatagttt 5520

agatgatagt caatttgacc tatctcaaat gatacagtgg gcatttgata atgatataac 5580

agacgactgt gaaatagcat tttgacctat ctcaaatgat acagtgggca tttgataatg 5640

atataacaga cgactgtgaa atagcatata aatcgtaatt attaggcaat gtagacagta 5700

agtgggcatt tgataatgat ataacagacg actgtgaaat agcatataaa tcgtaattat 5760

taggcaatgt agacagtacg taagctgcat ttttaaaaag gataatgata taacagacga 5820

ctgtgaaata gcatataaat cgtaattatt aggcaatgta gacagtacgt aagctgcatt 5880

tttaaaaagt acgtaacaag gcatataaat cgtaattatt aggcaatgta gacagtacgt 5940

aagctgcatt tttaaaaagt acgtaacaag caaaatatgt aaaagactgt ggataaatcg 6000

taattattag gcaatgtaga cagtacgtaa gctgcatttt taaaaagtac gtaacaagca 6060

aaatatgtaa aagactgtgg tacaatgtgc agcgtaagct gcatttttaa aaagtacgta 6120

acaagcaaaa tatgtaaaag actgtggtac aatgtgcaga cattataaag cagcagaacg 6180

taaacaaatg tcgctgcatt tttaaaaagt acgtaacaag caaaatatgt aaaagactgt 6240

ggtacaatgt gcagacatta taaagcagca gaacgtaaac aaatgtcgca aaatatgtaa 6300

aagactgtgg tacaatgtgc agacattata aagcagcaga acgtaaacaa atgtcaatgg 6360

cacaatggat acaacataga tgtgattaga cattataaag cagcagaacg taaacaaatg 6420

tcaatggcac aatggataca acatagatgt gatttaacta atgatggtgg taattggaaa 6480

gatattggtc aatggcacaa tggatacaac atagatgtga tttaactaat gatggtggta 6540

attggaaaga tattgtgcta ttcctaagat atcaaaatgt agaattttta actaatgatg 6600

gtggtaattg gaaagatatt gtgctattcc taagatatca aaatgtagaa tttcgtactt 6660

ttttaattac attaaaacaa tttttaagtg ctattcctaa gatatcaaaa tgtagaattt 6720

cgtacttttt taattacatt aaaacaattt ttaaaaggta ttcccaaaca aaactgtata 6780

gtattattgc cttttttaat tacattaaaa caatttttaa aaggtattcc caaacaaaac 6840

tgtatagtat tatatggacc gccagataca ggaaaatcac attttggaaa ggtattccca 6900

aacaaaactg tatagtatta tatggaccgc cagatacagg aaaatcacat tttggaatga 6960

gtttaattaa atttatacaa ggtgtagtta tatggaccgc cagatacagg aaaatcacat 7020

tttggaatga gtttaattaa atttatacaa ggtgtagtta tttcgtatgt aaattcaatg 7080

gaccgccaga tacaggaaaa tcacattttg gaatgagttt aattaaattt atacaaggtg 7140

tagttatttc gtatgtaaat tcaactagtc atttttggat acaggaaaat cacattttgg 7200

aatgagttta attaaattta tacaaggtgt agttatttcg tatgtaaatt caactagtca 7260

tttttggtta tacaggaaaa tcacattttg gaatgagttt aattaaattt atacaaggtg 7320

tagttatttc gtatgtaaat tcaactagtc atttttggtt aggaatgagt ttaattaaat 7380

ttatacaagg tgtagttatt tcgtatgtaa attcaactag tcatttttgg ttatcaccct 7440

tagctgcgta aaaaatggca tgttatttcg tatgtaaatt caactagtca tttttggtta 7500

tcacccttag ctgcgtaaaa aatggcatta ttagatgcgt aaacacctgg cgtatggacg 7560

tggttatcac ccttagctgc gtaaaaaatg gcattattag atgcgtaaac acctggcgta 7620

tggacgtaca tagacaaata tttaagaacg taattagatg gttattagat gcgtaaacac 7680

ctggcgtatg gacgtacata gacaaatatt taagaacgta attagatggt aatcctatat 7740

gtttagatag aaaacataaa agtacataga caaatattta agaacgtaat tagatggtaa 7800

tcctatatgt ttagatagaa aacataaaaa tttattacaa gttaacgtac ctccattact 7860

gggtaatcct atatgtttag atagaaaaca taaaaattta ttacaagtta acgtacctcc 7920

attactgata acatcaaata caaatcctaa agcagatgat aaatttatta caagttaacg 7980

tacctccatt actgataaca tcaaatacaa atcctaaagc agatgatact tggaaatatt 8040

tacatagtag aattaaggtg tgataacatc aaatacaaat cctaaagcag atgatacttg 8100

gaaatattta catagtagaa ttaaggtgtt tactttttta aatccatttc catttgacag 8160

tacttggaaa tatttacata gtagaattaa ggtgtttact tttttaaatc catttccatt 8220

tgacagtaat gggaacccac tataccaact tactaatgaa agtttacttt tttaaatcca 8280

tttccatttg acagtaatgg gaacccacta taccaactta ctaatgaaaa ctggaaagca 8340

ttttttacaa aaacgtggtc aaatgggaac ccactatacc aacttactaa tgaaaactgg 8400

aaagcatttt ttacaaaaac gtggtcaaaa ctagatttaa cagaggacga cgacaaggaa 8460

aaactggaaa gcatttttta caaaaacgtg gtcaaaacta gatttaacag aggacgacga 8520

caaggaaaat gatggagaca ctgtgcaaac gtttaagtgc gaactagatt taacagagga 8580

cgacgacaag gaaaatgatg gagacactgt gcaaacgttt aagtgcgtgt caggacgcaa 8640

tcctagaact gtatgaacgt gaatgatgga gacactgtgc aaacgtttaa gtgcgtgtca 8700

ggacgcaatc ctagaactgt atgaacgtga cagtgtacac ctaagtgatc atattgatca 8760

tgcgtgtcag gacgcaatcc tagaactgta tgaacgtgac agtgtacacc taagtgatca 8820

tattgatcat tggaaacacg tgcgacatga aaatgtatta tcgtgacagt gtacacctaa 8880

gtgatcatat tgatcattgg aaacacgtgc gacatgaaaa tgtattatta cataaagcac 8940

gtgaaatggg actgcaaact gggaaacacg tgcgacatga aaatgtatta ttacataaag 9000

cacgtgaaat gggactgcaa actgttaaca atcaagcggt gccaagcctt gcagtatcac 9060

gacataaagc acgtgaaatg ggactgcaaa ctgttaacaa tcaagcggtg ccaagccttg 9120

cagtatcacg atccaaaggg tatacgtaaa ttgaacgtaa ataacaatca agcggtgcca 9180

agccttgcag tatcacgatc caaagggtat acgtaaattg aacgtaaaat agcactagaa 9240

agtttaaatg aatctttgta tcacgatcca aagggtatac gtaaattgaa cgtaaaatag 9300

cactagaaag tttaaatgaa tctttgtata acacagagga atggacattg caacatacaa 9360

gaatagcact agaaagttta aatgaatctt tgtataacac agaggaatgg acattgcaac 9420

atacaagttg ggaactgtgg gttacagaac ctaaacaatg ttaacacaga ggaatggaca 9480

ttgcaacata caagttggga actgtgggtt acagaaccta aacaatgttt taaaaaggat 9540

ggaaaaacag tagaggttag atgggaactg tgggttacag aacctaaaca atgttttaaa 9600

aaggatggaa aaacagtaga ggttagatat gactgtgaaa aggacaatag ccgtaaatat 9660

gaaaggatgg aaaaacagta gaggttagat atgactgtga aaaggacaat agccgtaaat 9720

atgtattttg gacacatata tattgttggt atgaaggggg ggtattttgg acacatatat 9780

attgttggta tgaagggggg tgggcaaagg taggtagcaa aatagattat aatggtatat 9840

attatgaaac agatgatgag gggggggtgg gcaaaggtag gtagcaaaat agattataat 9900

ggtatatatt atgaaacaga tgatgaggaa aaggtatact atacaagatt tgatacagat 9960

gtataatggt atatattatg aaacagatga tgaggaaaag gtatactata caagatttga 10020

tacagcgtaa aaacggtacg gggtaaaagg catatgggaa gggaaaaggt atactataca 10080

agatttgata cagcgtaaaa acggtacggg gtaaaaggca tatgggaagt acatatgggt 10140

ggtcaggtaa tatgttgtgc tgcaaaacgg tacggggtaa aaggcatatg ggaagtacat 10200

atgggtggtc aggtaatatg ttgtgctcct gtatctagcg cctgtgaagt atccattcct 10260

gagtacatat gggtggtcag gtaatatgtt gtgctcctgt atctagcgcc tgtgaagtat 10320

ccattcctga aattgttaac ccactgcaca ccacaaccac ctcctgtatc tagcgcctgt 10380

gaagtatcca ttcctgaaat tgttaaccca ctgcacacca caaccaccaa caccaccacc 10440

acctgcacca acgttgacac ctgaaattgt taacccactg cacaccacaa ccaccaacac 10500

caccaccacc tgcaccaacg ttgacaccgg tgtgccatca cggaaacggc aaagacagtg 10560

taacaccacc accacctgca ccaacgttga caccggtgtg ccatcacgga aacggcaaag 10620

acagtgtgac tcggaccaga ggcccctgga ttgtttgcat aggtgtgcca tcacggaaac 10680

ggcaaagaca gtgtgactcg gaccagaggc ccctggattg tttgcataac ctacatccca 10740

ccacagagtc ctgtacccag ttgactcgga ccagaggccc ctggattgtt tgcataacct 10800

acatcccacc acagagtcct gtacccagtg tactacacat aatgttgcgc caatagtgca 10860

ttaacctaca tcccaccaca gagtcctgta cccagtgtac tacacataat gttgcgccaa 10920

tagtgcattt aaaaggtgac aaaaacagct taaaatgttt tgtgtactac acataatgtt 10980

gcgccaatag tgcatttaaa aggtgacaaa aacagcttaa aatgttttag atatagattg 11040

cataaaggct attcacattt atttaaaagg tgacaaaaac agcttaaaat gttttagata 11100

tagattgcat aaaggctatt cacatttatt taaaaatgta acaacaacat ggcattggac 11160

ctagatatag attgcataaa ggctattcac atttatttaa aaatgtaaca acaacatggc 11220

attggaccaa tactacaaat agtaaatgtg gtgtaataac aatttaaaaa tgtaacaaca 11280

acatggcatt ggaccaatac tacaaatagt aaatgtggtg taataacatt aatgtttaca 11340

actgtattgc aacaacaaca tccaatacta caaatagtaa atgtggtgta ataacattaa 11400

tgtttacaac tgtattgcaa caacaacatt ttttacaaca tgtaaaaata ccacaaacta 11460

tcattaatgt ttacaactgt attgcaacaa caacattttt tacaacatgt aaaaatacca 11520

caaactattg tagttacatc aggatacatg tctttgtaac attttttaca acatgtaaaa 11580

ataccacaaa ctattgtagt tacatcagga tacatgtctt tgtaacattg gttacacagt 11640

atatatgatt ctttgtatat tgtagttaca tcaggataca tgtctttgta acattggtta 11700

cacagtatat atgattcttt gtatatttgt atttttgttt tgtgttggct tttgtttgtg 11760

cttggttaca cagtatatat gattctttgt atatttgtat ttttgttttg tgttggcttt 11820

tgtttgtgct tgtgtgtgtc gcttgcagtg tctgtgtata ttgtattttt gttttgtgtt 11880

ggcttttgtt tgtgcttgtg tgtgtcgctt gcagtgtctg tgtatattta cccatggtta 11940

ttggtattga ttataataac cgcttgtgtg tgtcgcttgc agtgtctgtg tatatttacc 12000

catggttatt ggtattgatt ataataacct ttatacatgt atcacaatca ttgttaaaag 12060

ttttacccat ggttattggt attgattata ataaccttta tacatgtatc acaatcattg 12120

ttaaaagtat tttttttata tgttttggta ttttatattc ccctttatac atgtatcaca 12180

atcattgtta aaagtatttt ttttatatgt tttggtattt tatattccta tggcacttgt 12240

acattacccg tatacattac atattttttt tatatgtttt ggtattttat attcctatgg 12300

cacttgtaca ttacccgtat acattacaaa taacataaac aattttacat atataataaa 12360

ccctatggca cttgtacatt acccgtatac attacaaata acataaacaa ttttacatat 12420

ataataaact gcctaatatt tttagtgtac ccgtagtcgc aaaataacat aaacaatttt 12480

acatatataa taaactgcct aatattttta gtgtacccgt agtcgcaagc gtgacacaca 12540

catacgaaaa aaacgtgcat cctgcctaat atttttagtg tacccgtagt cgcaagcgtg 12600

acacacacat acgaaaaaaa cgtgcatctg caacacaatt atataaaaca tgtaaacaag 12660

cagcgtgaca cacacatacg aaaaaaacgt gcatctgcaa cacaattata taaaacatgt 12720

aaacaagcag gtacgtgccc tcctgatgta attcccaagg tctgcaacac aattatataa 12780

aacatgtaaa caagcaggta cgtgccctcc tgatgtaatt cccaaggttg aaggtagtac 12840

tatagctgat aatatattaa agcaggtacg tgccctcctg atgtaattcc caaggttgaa 12900

ggtagtacta tagctgataa tatattaaaa tatggtagta ttggagtttt ttttggggga 12960

tttgaaggta gtactatagc tgataatata ttaaaatatg gtagtattgg agtttttttt 13020

gggggattgg gaataggtag tgggtctgga tcaggggggc gaatatggta gtattggagt 13080

tttttttggg ggattgggaa taggtagtgg gtctggatca ggggggcgta ctggatacgt 13140

tccattatct acaggcacac ctgggaatag gtagtgggtc tggatcaggg gggcgtactg 13200

gatacgttcc attatctaca ggcacaccat ctaaaccagt tgaaattcca ttacaaccta 13260

tgtactggat acgttccatt atctacaggc acaccatcta aaccagttga aattccatta 13320

caacctatac gaccatcagt tgttacgtct gttgggcctt ccatctaaac cagttgaaat 13380

tccattacaa cctatacgac catcagttgt tacgtctgtt gggccttcag attcttctat 13440

tgtttcatta gtggaagaat ctacgaccat cagttgttac gtctgttggg ccttcagatt 13500

cttctattgt ttcattagtg gaagaatcaa gttttataga gtcaggtata cctggtccta 13560

ccagattctt ctattgtttc attagtggaa gaatcaagtt ttatagagtc aggtatacct 13620

ggtcctacat ctatagtgcc ttctacttca gggtttgata tcaagtttta tagagtcagg 13680

tatacctggt cctacatcta tagtgccttc tacttcaggg tttgatatta caacttctgt 13740

aaacagtaca cctgctatta tcatctatag tgccttctac ttcagggttt gatattacaa 13800

cttctgtaaa cagtacacct gctattatag atgtatctgc tattagtgat actacacaaa 13860

tttacaactt ctgtaaacag tacacctgct attatagatg tatctgctat tagtgatact 13920

acacaaatat ctgttacaac atttaaaaat ccaaccttta ctagatgtat ctgctattag 13980

tgatactaca caaatatctg ttacaacatt taaaaatcca acctttactg acccatctgt 14040

gttgcaacct cctccaccct tatctgttac aacatttaaa aatccaacct ttactgaccc 14100

atctgtgttg caacctcctc cacccttaga agcctctggc agacttttat tttcaaatga 14160

cctgacccat ctgtgttgca acctcctcca cccttagaag cctctggcag acttttattt 14220

tcaaatgaca ctgtaactac ccattcatat gaaaatatac ctagaagcct ctggcagact 14280

tttattttca aatgacactg taactaccca ttcatatgaa aatatacctc ttgacacatt 14340

tgtagttaca acagaccaca acactgtaac tacccattca tatgaaaata tacctcttga 14400

cacatttgta gttacaacag accacaatag tattgttagt agtacgccca tcccagggag 14460

gctcttgaca catttgtagt tacaacagac cacaatagta ttgttagtag tacgcccatc 14520

ccagggaggc aacctgctgc acgcttagga ttatatggac gtagtattgt tagtagtacg 14580

cccatcccag ggaggcaacc tgctgcacgc ttaggattat atggacgtgc aatacaacag 14640

gttaaggttg tagaccctgc gggcaacctg ctgcacgctt aggattatat ggacgtgcaa 14700

tacaacaggt taaggttgta gaccctgcgt ttttaactac gcctacacgt ttagtaacat 14760

agtgcaatac aacaggttaa ggttgtagac cctgcgtttt taactacgcc tacacgttta 14820

gtaacatatg acaaccctgc ctttgaaggc ctgcaggata cgcgttttta actacgccta 14880

cacgtttagt aacatatgac aaccctgcct ttgaaggcct gcaggataca acattagagt 14940

ttcagcacag tgacttgcat aatgacaacc ctgcctttga aggcctgcag gatacaacat 15000

tagagtttca gcacagtgac ttgcatacgt atcctgattc tgatttttta gatattgtaa 15060

acaacattag agtttcagca cagtgacttg catacgtatc ctgattctga ttttttagat 15120

attgtaaaat tacataggcc tgctttaacc tctagaaaaa ccgtatcctg attctgattt 15180

tttagatatt gtaaaattac ataggcctgc tttaacctct agaaaaacag gcatacgtgt 15240

tagtagattg ggacaacgtg caattacata ggcctgcttt aacctctaga aaaacaggca 15300

tacgtgttag tagattggga caacgtgcaa cactttctac tagaagtggc aaacgtatag 15360

gcaggcatac gtgttagtag attgggacaa cgtgcaacac tttctactag aagtggcaaa 15420

cgtataggtg ctaaagtaca tttttatcat gatataagtc cgcaacactt tctactagaa 15480

gtggcaaacg tataggtgct aaagtacatt tttatcatga tataagtcct atacctacta 15540

atgatattga acgtaaacct tgtgctaaag tacattttta tcatgatata agtcctatac 15600

ctactaatga tattgaacgt aaacctttag ttacaccaca aacacctagt atagtaactg 15660

gcctatacct actaatgata ttgaacgtaa acctttagtt acaccacaaa cacctagtat 15720

agtaactggt agtagtatta atgatgggtt atatgatgtg ttagttacac cacaaacacc 15780

tagtatagta actggtagta gtattaatga tgggttatat gatgtgtttt tagacaatga 15840

tgtagaagag actgtactac aggtagtagt attaatgatg ggttatatga tgtgttttta 15900

gacaatgatg tagaagagac tgtactacaa caaacatata cacctacaag tatacatagt 15960

attttagaca atgatgtaga agagactgta ctacaacaaa catatacacc tacaagtata 16020

catagtaata gtttagttag tagtgatatt tctactgcaa ccaacaaaca tatacaccta 16080

caagtataca tagtaatagt ttagttagta gtgatatttc tactgcaact gcaaatacaa 16140

ctattccttt tagtactggg tatagtttag ttagtagtga tatttctact gcaactgcaa 16200

atacaactat tccttttagt actgggttag acacacatcc tggtccagat attgctttac 16260

cctgcaaata caactattcc ttttagtact gggttagaca cacatcctgg tccagatatt 16320

gctttaccac taccttctac agaaactatt tttacaccaa ttagacacac atcctggtcc 16380

agatattgct ttaccactac cttctacaga aactattttt acaccaatag tgccattaca 16440

gcctgctggt cctatatata tccactacct tctacagaaa ctatttttac accaatagtg 16500

ccattacagc ctgctggtcc tatatatatt tatgggtcag gttttatatt acaccctagt 16560

ttagtgccat tacagcctgc tggtcctata tatatttatg ggtcaggttt tatattacac 16620

cctagttatt atttgttaaa gcgcaaacgt aaacgtctgt cttatgggtc aggttttata 16680

ttacacccta gttattattt gttaaagcgc aaacgtaaac gtctgtcata ttcttttaca 16740

gatgtggcga cctactgcgt aattatttgt taaagcgcaa acgtaaacgt ctgtcatatt 16800

cttttacaga tgtggcgacc tactgcgtaa aaggtatacc tgccccctgt gtctgtgtct 16860

acatattctt ttacagatgt ggcgacctac tgcgtaaaag gtatacctgc cccctgtgtc 16920

tgtgtctaag gttgtaagca cagatgaata tgtaacaaga agcaaaggta tacctgcccc 16980

ctgtgtctgt gtctaaggtt gtaagcacag atgaatatgt aacaagaaca aatatatatt 17040

attcgtaagg tagcacacgt taaggttgta agcacagatg aatatgtaac aagaacaaat 17100

atatattatt cgtaaggtag cacacgtttg ttggctgtgg gacacccata ttttcctatc 17160

aacaaatata tattattcgt aaggtagcac acgtttgttg gctgtgggac acccatattt 17220

tcctatcaag gattctcaaa aacgtaaaac catagttcct attgttggct gtgggacacc 17280

catattttcc tatcaaggat tctcaaaaac gtaaaaccat agttcctaaa gtttcaggtt 17340

tgcaatacag ggtgtttagg caggattctc aaaaacgtaa aaccatagtt cctaaagttt 17400

caggtttgca atacagggtg tttaggcttc gtttaccaga tcctaataaa tttggatttc 17460

cgtttcaggt ttgcaataca gggtgtttag gcttcgttta ccagatccta ataaatttgg 17520

atttccagcg taatcctttt ataatcctga taaggagcgc cttgcaatac agggtgttta 17580

ggcttcgttt accagatcct aataaatttg gatttccagc gtaatccttt tataatcctg 17640

ataaggagcg cctagtatgg ccagcgtaat ccttttataa tcctgataag gagcgcctag 17700

tatgggcctg ttctggtgtg gaggttggac gtggacaacc cttaggtata ggtactagtg 17760

cgcctagtat gggcctgttc tggtgtggag gttggacgtg gacaaccctt aggtataggt 17820

actagtggca atccatttat gaataaatta gatgatactg ggacgtggac aacccttagg 17880

tataggtact agtggcaatc catttatgaa taaattagat gatactgaaa cgtatcctaa 17940

atacattgct ggacaaaata ggcaatccat ttatgaataa attagatgat actgaaacgt 18000

atcctaaata cattgctgga caaaatacag atggtagaga atgtatgtca gtggattata 18060

gaaacgtatc ctaaatacat tgctggacaa aatacagatg gtagagaatg tatgtcagtg 18120

gattataaac aaacacagtt gtgtatttta ggttgtaggc cagatggtag agaatgtatg 18180

tcagtggatt ataaacaaac acagttgtgt attttaggtt gtaggcctcc cttaggggaa 18240

cattggggtc caggcacgcc aacaaacaca gttgtgtatt ttaggttgta ggcctccctt 18300

aggggaacat tggggtccag gcacgccatg tacttcacaa actgttaata ctggtgattg 18360

cctcccttag gggaacattg gggtccaggc acgccatgta cttcacaaac tgttaatact 18420

ggtgattgtc ccccactgga attaaagaac acccctatac ccatgtactt cacaaactgt 18480

taatactggt gattgtcccc cactggaatt aaagaacacc cctatacagg atggtgatat 18540

gatagatgtt ggctttggag gtcccccact ggaattaaag aacaccccta tacaggatgg 18600

tgatatgata gatgttggct ttggagccat ggattttaaa gctttacaag caaataaaag 18660

caggatggtg atatgataga tgttggcttt ggagccatgg attttaaagc tttacaagca 18720

aataaaagtg atgtacctat tgatatttct aacactacct gccatggatt ttaaagcttt 18780

acaagcaaat aaaagtgatg tacctattga tatttctaac actacctgta aatacccaga 18840

ttatttaggc atggctgctg gtgatgtacc tattgatatt tctaacacta cctgtaaata 18900

cccagattat ttaggcatgg ctgctgatcc ctatggtgat tccatgtggt tttatcttcg 18960

gatccctatg gtgattccat gtggttttat cttcgtaggg aacaaatgtt tgttcgacac 19020

ttatttaaca gggctggtga taccggtgat aaaatcccag cgtagggaac aaatgtttgt 19080

tcgacactta tttaacaggg ctggtgatac cggtgataaa atcccagatg acctaatgat 19140

taaaggcaca ggcaatactg acagggctgg tgataccggt gataaaatcc cagatgacct 19200

aatgattaaa ggcacaggca atactgcaac accatccagt tgtgtttttt atcctacacc 19260

gatgacctaa tgattaaagg cacaggcaat actgcaacac catccagttg tgttttttat 19320

cctacaccta gtggttccat ggtttcttca gcgtaacagt gcaacaccat ccagttgtgt 19380

tttttatcct acacctagtg gttccatggt ttcttcagcg taacagttgt ttaataaacc 19440

ttattggttg caaaaggcac cctagtggtt ccatggtttc ttcagcgtaa cagttgttta 19500

ataaacctta ttggttgcaa aaggcacagg gacaaaataa tggtatttgt tggcctagtg 19560

gttccatggt ttcttcagcg taacagttgt ttaataaacc ttattggttg caaaaggcac 19620

agggacaaaa taatggtatt tgttggcata atcgtttaat aaaccttatt ggttgcaaaa 19680

ggcacaggga caaaataatg gtatttgttg gcataatcaa ttatttttaa ctgttgtaga 19740

tactactaga agccagggac aaaataatgg tatttgttgg cataatcaat tatttttaac 19800

tgttgtagat actactagaa gcactaattt ttctgtatgt gtaggtacac aggcaattat 19860

ttttaactgt tgtagatact actagaagca ctaatttttc tgtatgtgta ggtacacagg 19920

ctagtagctc tactacaacg tcgtacaact ctaagcacta atttttctgt atgtgtaggt 19980

acacaggcta gtagctctac tacaacgtcg tacaactcta attttaagga atatttaaga 20040

ccgtaagaag agtggctagt agctctacta caacgtcgta caactctaat tttaaggaat 20100

atttaagacc gtaagaagag tttgatttac agtttgtttt tcagttatgt aaaaatttta 20160

aggaatattt aagaccgtaa gaagagtttg atttacagtt tgtttttcag ttatgtaaaa 20220

ttagtttaac tactgaggta atgacatata tacgtttgat ttacagtttg tttttcagtt 20280

atgtaaaatt agtttaacta ctgaggtaat gacatatata cattctatga attctactat 20340

attggaagag tggcagttat gtaaaattag tttaactact gaggtaatga catatataca 20400

ttctatgaat tctactatat tggaagagtg gaattttggt cttaccccac cacattagtt 20460

taactactga ggtaatgaca tatatacatt ctatgaattc tactatattg gaagagtgga 20520

attttggtct taccccacca ccgtcaggta cttcattcta tgaattctac tatattggaa 20580

gagtggaatt ttggtcttac cccaccaccg tcaggtactt tagaggaaac atatagatat 20640

gtaacatcac aggaattttg gtcttacccc accaccgtca ggtactttag aggaaacata 20700

tagatatgta acatcacagg ctattagttg ccaacgtcct caacctccta aaggaggaaa 20760

catatagata tgtaacatca caggctatta gttgccaacg tcctcaacct cctaaagaaa 20820

cagaggaccc atcgtacaag ctatcctttt ggggaaacag aggacccatc gtacaagcta 20880

tccttttggg atgtagatct taaggaaaag ttttctgcag aattagacca gtttcctttg 20940

ggaagaaaat ttttgggatg tagatcttaa ggaaaagttt tctgcagaat tagaccagtt 21000

tcctttggga agaaaatttt tattacaact tggtcgtagt gcacgtccta agtgaattag 21060

accagtttcc tttgggaaga aaatttttat tacaacttgg tcgtagtgca cgtcctaagt 21120

tacaagcttc taaacgttct gcatctgcta ccatattaca acttggtcgt agtgcacgtc 21180

ctaagttaca agcttctaaa cgttctgcat ctgctaccac aagtgccaca cctaagaaaa 21240

aacgtgctaa acggttacaa gcttctaaac gttctgcatc tgctaccaca agtgccacac 21300

ctaagaaaaa acgtgctaaa cgtatttaat aagtgtaatg tgtatgtgtt gttccacaag 21360

tgccacacct aagaaaaaac gtgctaaacg tatttaataa gtgtaatgtg tatgtgttgt 21420

ttgttgtatg ttacatgtgt tttgtatgtt tgtcgtattt aataagtgta atgtgtatgt 21480

gttgtttgtt gtatgttaca tgtgttttgt atgtttgttt gttgtatgtt aactgtttac 21540

taatactgtg tgttgttgta tgttacatgt gttttgtatg tttgtttgtt gtatgttaac 21600

tgtttactaa tactgtgtgt atgtttatgt acatgtgtat aactgtttgt ttagttgtat 21660

gttaactgtt tactaatact gtgtgtatgt ttatgtacat gtgtataact gtttgtttat 21720

atatatgtat gtatttgtgt gtatgtgtat gtgtatgttt atgtacatgt gtataactgt 21780

ttgtttatat atatgtatgt atttgtgtgt atgtgtatgt gtatgtgtat gtgtagtaat 21840

gtttgtatgt atgtatatat gtatgtattt gtgtgtatgt gtatgtgtat gtgtatgtgt 21900

agtaatgttt gtatgtatgt ttaataaagt ttatatgtgt gttgtgtggg tgggtgtatg 21960

tgtatgtgta gtaatgtttg tatgtatgtt taataaagtt tatatgtgtg ttgtgtgggt 22020

ggtttacttg actactgtgc ttccattttg tatgtttaat aaagtttata tgtgtgttgt 22080

gtgggtggtt tacttgacta ctgtgcttcc attttgtata gtcgccattt taccgtaatt 22140

aaggtaaaaa gggggtttac ttgactactg tgcttccatt ttgtatagtc gccattttac 22200

cgtaattaag gtaaaaaggg caaccgattt cggttgcaca gtaaaacatg tttagtcgcc 22260

attttaccgt aattaaggta aaaagggcaa ccgatttcgg ttgcacagta aaacatgttt 22320

taatgtgttt tgctgttgta gcaaaatagt tgtgcaaccg atttcggttg cacagtaaaa 22380

catgttttaa tgtgttttgc tgttgtagca aaatagttgt actgtttttg gcttcctgca 22440

ggcaacttgg cagaatgtgt tttgctgttg tagcaaaata gttgtactgt ttttggcttc 22500

ctgcaggcaa cttggcaggg tttgtttcct taacatgttc atcccacgca agggggtttg 22560

tttccttaac atgttcatcc cacgcaaggt tataaaggta aaaggcgcca cctggcagtt 22620

actcatttgt ctgcaattat ttaaacaatg tctaggttat aaaggtaaaa ggcgccacct 22680

ggcagttact catttgtctg caattattta aacaatgtct tgcacacaca ttttttaccc 22740

accctatcat aaaactcatt tgtctgcaat tatttaaaca atgtcttgca cacacatttt 22800

ttacccaccc tatcataaaa ttgcttttaa gcacatacct atactatgta caccttgcac 22860

acacattttt tacccaccct atcataaaat tgcttttaag cacataccta tactatgtac 22920

acagtgtact cttggcagaa cattgttttt taaattgctt ttaagcacat acctatacta 22980

tgtacacagt gtactcttgg cagaacattg ttttttaacg tacaagtaat tgttttataa 23040

atgagtaata acgacagtgt actcttggca gaacattgtt ttttaacgta caagtaattg 23100

ttttataaat gagtaataac gtgttactca tactgcacct aaaaagttaa acccgtacaa 23160

gtaattgttt tataaatgag taataacgtg ttactcatac tgcacctaaa aagttaaacc 23220

tatttggatc acacaacgta caatttattt ctt 23253

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agattgcatg acgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agattgctat cggtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatcacaag cagtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agattcgctg atgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatcgcttt gtgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatccgatg aagtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

caagcagaag acggcatacg agattgacca cagtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

caagcagaag acggcatacg agatgaagcc atgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

caagcagaag acggcatacg agatttctgg tggtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

caagcagaag acggcatacg agatccgaaa acgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

caagcagaag acggcatacg agatcgaaaa gggtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

caagcagaag acggcatacg agataaccag ctgtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头

<400> 14

ctacaataat tcatgtataa aactaagggc tagtataaaa gcagacattt tcgtaaccaa 60