一种复合制剂的制备方法及其在制备预防或治疗睡眠障碍的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种由明日草、莲子、大豆、辣椒和山楂制备而成的复合制剂的其制备方法及其在制备预防或治疗睡眠障碍药物中的应用。

背景技术

人有1/3的时间在睡眠，充足的睡眠是维持人体正常机能活动的基础，倘若缺乏充足的睡眠，其能诱发的健康风险涉及很多方面：不能快速消除身心疲惫，同时需在夜间睡眠期间合成并分泌的激素(比如，生长激素等)受到妨碍，导致免疫力下降；增加肥胖、糖尿病、高血压等生活习惯病的风险，也会引发交通事故等危及生命。有报告显示睡眠时间不足6小时的人比7小时的人死亡率高2.4倍。

睡眠障碍是指人在有充足的睡眠时间及睡眠环境时，仍对睡眠时间及睡眠质量不满足，并且影响日间社会功能紊乱的一种主观体验。表现在起始睡眠困难(入睡时间超过30min)、睡眠维持障碍、早醒、睡眠质量下降和总睡眠时间减少，临床上混合型的患者居多。引起睡眠障碍的原因主要包括以下：①社会-心理因素(如生活工作压力、紧张的人际关系及混乱作息时间)；②嘈杂的环境因素；③生理因素(如饥饿)；④食物、药物的因素⑤睡眠节奏的骤然改变。对大部人而言，诱发因素消除，机体经内稳态调节可恢复睡眠。如诱发因素持续不断，短暂的睡眠障碍得不到合理改善，可恶化成慢性的长期睡眠障碍。

目前，睡眠障碍发病的详细机制尚未明确，但得到普遍认同的是睡眠障碍患者的中枢神经异常活跃。临床上治疗睡眠障碍的药物主要为镇静、抗焦虑的西药以及安神活血的中药。西药的长期使用，会让患者容易对药物产生依赖、耐受及残留效应，一旦停药，则会引起睡眠障碍反跳。中医对睡眠障碍的认知理论成熟，不过对症治疗的话，仍需要长期服用中药。当然，长期服用成分复杂的中药亦可能会引起患者肝、肾等重要脏腑的功能障碍，所以也常被敬而远之。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于基于中医的五行学说理论，遵循“食药同源”的原则，选用生活中常食用的果蔬之原材料，提供一种针对睡眠障碍有明显预防和治疗作用且安全的果蔬之精华复合制剂。

中医认为心神主导睡眠。心主血脉、主藏神。如心血不足、心神失养则出现精神恍惚、心悸烦躁、失眠多梦。再根据中医五行学说中相生之规律，木生火，火生土。在五行中心属火，肝属木，脾属土，故肝、脾在睡眠机制中也发挥着重要作用。现代流行病学调查显示大部分失眠患者合并有心脑血管方面的疾病，故疏通血管堵塞、调节血脂可为辅助治疗。同时辅以调和营卫气血，可为机体提供充足的能量基础。该复合制剂由明日草、莲子、大豆、辣椒和山楂制备而成，各成分的具体作用如下：

(1)明日草，药食兼用的蔬菜，可解肝毒。实验数据指出明日草能明显预防肝脏内脂肪过渡蓄积、抑制肝炎形成，具有护肝和调肝作用。可用于疏肝解郁。

(2)莲子，为药食两用食品。《本经逢原》中指出莲子“取水土之余气，补助脾阴而涤除热毒”。莲子具有清心安神、交通心肾、涩精止血之功效；现代药理也证明莲子提取物的主要成分(多酚类物质)有较强的抗氧化能力，能够清除多种自由基，抑制脂质过氧化，从而减少自由基对细胞膜的损伤；同时其亦可通过抑制血小板活化、黏附和聚集，抗血栓，以确保正常供血。而这些作用均有益于健脾安神。

(3)大豆，为药食两用食品。《本草汇言》中提及黄豆“煮汁饮，能润脾燥”。现代大量研究也证明大豆低聚糖及其制品可有效降低体内胆固、甘油三酯等含量，可做血管清道夫。大豆经发酵后原有的脂肪含量显著降低的同时，新增有大量的小分子活性肽、谷氨酸(可在谷氨酸脱羧酶的作用下产生γ-氨基丁酸，赋予其具有促进脑的活化性，改善睡眠，以及良好的降血压和血脂之功效)等游离氨基酸、维生素B族类营养物质。可润脾安神，也可降低血管堵塞。

(4)山楂，为药食兼用的水果。具有活血化瘀、健脾开胃和消食化滞之功效。山楂中含有大量维生素C及山楂酸等，可增加胃液中的淀粉酶酶、脂肪酶分泌，促进消化，补充机体营养。同时也有文献记录生山楂具有活血散瘀之功效。

(5)辣椒，药食兼用的调味佳品。味辛、性热，入心、脾二经。国内外的研究文献表明，适量的辣椒素具有保护胃黏膜作用、可促进胃动力。同时研究表明辣椒中的辣椒素能明显降低血浆和肝脏中甘油三酯的浓度。故具有增加食欲、调节血脂作用。

据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中改善睡眠功能的要求，延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有改善睡眠作用。

申请人多年来一直从事中医药研究，运用“疏肝健脾、宁心安神为主、辅以调营卫通经脉”理论提出该复合制剂具有预防和治疗睡眠障碍的假说。为验证其效果，申请人对复合制剂是否具有治疗失眠的疗效做了大量的科学实验研究，通过建立戊巴比妥钠诱导小鼠催眠，建立睡眠模型，观察复合制剂是否延长戊巴比妥钠的睡眠时间、是否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期来研究该复合制剂给药对睡眠障碍的预防和治疗作用。同时，将复合制剂直接作用于正常小鼠，观察该复合制剂对小鼠是否具有直接睡眠作用。研究结果表明复合制剂能明显延长戊巴比妥钠催眠小鼠的睡眠时间，能够缩短巴比妥钠催眠小鼠的入睡潜伏期且无明显的直接睡眠作用，并对小鼠体重无不良影响，具有改善小鼠睡眠状况作用。最后，申请人通过长期大剂量的喂养小鼠复方制剂复合制剂，实验喂养显示此复方制剂对小鼠心、肝、脾、肾均无毒副作用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一种从明日草、莲子、大豆、山楂和辣椒中提取复方制剂的方法，依次包括如下步骤：

(1)分别制备明日草浸膏、莲子浸膏、大豆浸膏、山楂浸膏以及辣椒浸膏；

(2)将步骤(1)的明日草浸膏、莲子浸膏、大豆浸膏、山楂浸膏以及辣椒浸膏按照(100-500)∶(100-500)∶(100-500)∶(50-500)∶1的重量比混合均匀后，粉碎，得混合浸膏粉；

(3)向步骤(2)得到的混合浸膏粉中加入其重量1-2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物，混匀后，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入乙醇水溶液，混合均匀后制成软材，然后制粒，得复合制剂；

步骤(3)中所加的淀粉与糊精混合物中淀粉与糊精的重量比(3-6)：1。

进一步的，所述从明日草、莲子、大豆、山楂和辣椒中提取复方制剂方法包括如下步骤：

(1)明日草浸膏的制备

取明日草的干燥茎叶，粉碎后置入提取罐中，加入乙醇水溶液搅拌提取至少 2次，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到明日草浸膏；

(2)莲子浸膏的制备

取干燥的去壳莲子，粉碎后置入提取罐中，加乙醇水溶液搅拌提取至少2 次，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到莲子浸膏；

(3)大豆浸膏的制备

取干燥的发酵后的大豆，粉碎后置入提取罐中，加入水搅拌提取至少2次，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到大豆浸膏；

(4)山楂浸膏的制备

取干燥的生山楂，粉碎后置入提取罐中，加入乙醇水溶液搅拌提取至少2 次，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到山楂浸膏；

(5)辣椒浸膏的制备

取干燥的辣椒，粉碎后置入提取罐中，加入乙醇水溶液搅拌提取至少2次，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到辣椒浸膏；

(6)将步骤(1)得到的明日草浸膏、步骤(2)得到的莲子浸膏、步骤(3) 得到的大豆浸膏、步骤(4)得到山楂浸膏以及步骤(5)得到辣椒浸膏，按照 (100-500)∶(100-500)∶(100-500)∶(50-500)∶1的重量比混合均匀后，粉碎，得混合浸膏粉；

(7)向步骤(6)得到的混合浸膏粉中加入其重量1-2倍的由淀粉与糊精组成的混合物，混合物中淀粉与糊精重量比为(3-6)：1，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入乙醇水溶液制成软材，然后制粒，得到复合制剂。

更进一步的，一种从明日草、莲子、大豆、山楂和辣椒中提取复合制剂的方法包括如下步骤：

(1)明日草浸膏的制备

取明日草的干燥茎叶，粉碎后置入提取罐中，向其中加入50-80v/v％乙醇水溶液后在60-80℃下搅拌提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到明日草浸膏；

(2)莲子浸膏的制备

取去壳的干燥莲子，粉碎后置入提取罐中，向其中加入50-80v/v％乙醇水溶液后在50-80℃下搅拌提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到莲子浸膏；

(3)大豆浸膏的制备

取干燥的发酵后的大豆，粉碎后置入提取罐中，向其中加入水后在50-80℃下搅拌提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到大豆浸膏；

(4)山楂浸膏的制备

取干燥的生山楂，粉碎后置入提取罐中，向其中加入70-90v/v％乙醇水溶液后在50-80℃下搅拌提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到山楂浸膏；

(5)辣椒浸膏的制备

取干燥的辣椒，粉碎后置入提取罐中，向其中加入70-90v/v％乙醇水溶液后在60-80℃下煎煮搅拌提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，过滤后减压浓缩、真空冷冻干燥得到陈皮药浸膏；

(6)将步骤(1)得到的明日草浸膏、步骤(2)得到的莲子浸膏、步骤(3) 得到的大豆浸膏、步骤(4)得到山楂浸膏以及步骤(5)得到辣椒浸膏，按照 (100-500)∶(100-500)∶(100-500)∶(50-500)∶1的重量比混合均匀后，粉碎，得混合浸膏粉；

(7)向步骤(6)得到的混合浸膏粉中加入其重量1-2倍的由淀粉与糊精组成的混合物，混合物中淀粉与糊精重量比为(3-6)：1，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入95v/v％的乙醇水溶液制成软材，然后制粒，得到复合制剂。

进一步的，本发明内容中所述粉碎均指粉碎至80-200目的粉末。

进一步的，本发明内容中所述辣椒为辣度较高的红辣椒，产自湖南、四川、贵州、新疆等地。

进一步的，本发明内容中所述干燥的发酵后的大豆采购自湖南农户，农户在每年立冬后开始腌制(发酵)的大豆，将大豆按传统的发酵工艺，连续实施三到五次的发酵处理，最后将所得大豆进行干燥，密封装袋备用。本发明还提供了上述制备方法得到的复合制剂在制备预防或治疗疲劳药物中的应用，经科学试验验证，效果显著，安全可靠。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1、复方制剂所需原材料均来源于日常生活中随处可见的果蔬；源自天然，整个提取方法、制备工艺简单，易于实施，成本低，可被广大有睡眠障碍的朋友接受。

2、本发明制备的复合制剂能有效地预防和治疗睡眠障碍：复方制剂能明显延长戊巴比妥钠催眠小鼠的睡眠时间，能够缩短巴比妥钠催眠小鼠的入睡潜伏期且无明显的直接睡眠作用，并对小鼠体重无不良影响，具有改善小鼠睡眠状况作用。并且，长期大剂量的喂养显示此复方制剂对小鼠心、肝、脾、肾等重要脏器均无异常影响。与现有的主流疗法相比，复合制剂预防和治疗睡眠障碍具有效果好、价格便宜等优势。

3、依据成熟的中医五行理论：复合制剂通过“疏肝健脾”来调和“心神之母及子”，同时通过调营卫、通经脉来达安心神，改善睡眠之功效。科学组方，多靶点协同发挥作用，比单用更有效，适应于肝郁、脾虚、体虚等类型的睡眠障碍的群体。

附图说明

图1为实施例2制备的复合制剂长期大剂量喂养对小鼠肝脏的影响图。

图2为实施例2制备的复合制剂长期大剂量喂养对小鼠脾脏的影响图。

图3为实施例2制备的复合制剂长期大剂量喂养对小鼠心脏的影响图。

图4为实施例2制备的复合制剂长期大剂量喂养对小鼠肾脏的影响图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式解释为对本发明的保护范围的限制。

申请人对复合制剂预防和治疗睡眠障碍进行了系列、大量的科学实验验证，确认该复方可以协同阈下剂量戊巴比妥钠的催眠作用，可缩短催眠剂(戊巴比妥钠)的睡眠潜伏时间且无明显的直接睡眠作用，同时该方对小鼠体重无影响，可得出该方具有显著消除睡眠障碍，提高睡眠质量的效果。

实施例1和2中的辣椒为湖南的小米椒。

实施例1和2中干燥的发酵后的大豆为从湖南农户处直接购买，在立冬后，将大豆按传统的发酵工艺，连续实施五次发酵处理，最后将所得大豆进行干燥，密封装袋。

实施例1一种从明日草、莲子、大豆、山楂和辣椒中提取复合制剂的方法，包括如下步骤：

(1)明日草浸膏的制备

取5kg明日草的干燥茎叶粉碎成80目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入25L的50％(v/v)乙醇水溶液，在60℃下回流提取2次，每次1小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到明日草浸膏粉677.2g，测得此浸膏粉中绿原酸的含量为3.2wt％，备用。

(2)莲子浸膏的制备

取5kg去壳的干燥莲子粉碎成80目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入 25L的50％(v/v)乙醇水溶液，在60℃下回流提取2次，每次1小时，合并2 次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到莲子浸膏粉731.6g，测得此莲子浸膏粉中多酚物质的含量为6.8wt％，备用。

(3)大豆浸膏的制备

取2.5kg干燥的发酵后的大豆粉碎成80目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入25L的水，在50℃下搅拌提取2次，每次1小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到大豆浸膏粉655.3g，测得此浸膏粉中总大豆肽的含量为19.3wt％，备用。

(4)山楂浸膏的制备

取干燥的生山楂2.5kg粉碎成80目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入 25L的70％(v/v)乙醇水溶液，在50℃回流提取2次，每次1小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到山楂浸膏粉485.7g，测得山楂中总黄酮含量为6.5wt％，备用。

(5)辣椒浸膏的制备

取干燥的辣椒2.5kg粉碎成80目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入25 L的90％(v/v)乙醇水溶液，在60℃下回流提取2次，每次1小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到辣椒浸膏粉507.9g，测得此浸膏粉中辣椒素的含量为0.08wt％，备用。

(6)取步骤(1)得到的明日草浸膏粉500g、步骤(2)得到的莲子浸膏粉 100g、步骤(3)得到的大豆浸膏粉500g、步骤(4)得到的山楂浸膏粉50g 和步骤(5)得到的辣椒浸膏粉1g进行混合，混合均匀后粉碎成80目粉末，得混合浸膏粉；

(7)向步骤(6)得到的混合浸膏粉中加入其重量2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物(混合物中淀粉与糊精重量比4∶1)，混匀后，在搅拌下，再以喷雾方式，向其中加入总量为100mL的95％(v/v)乙醇水溶液，混合均匀制成软材，再采用压缩颗粒机制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得颗粒剂，即复合制剂。

实施例2一种从明日草、莲子、大豆、山楂和辣椒中提取复合制剂的方法，包括如下步骤：

(1)明日草浸膏的制备

取5kg明日草的干燥茎叶粉碎成200目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入50L的80％(v/v)乙醇水溶液，在80℃下回流提取2次，每次2小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到明日草浸膏粉1201.3g，测得此浸膏粉中绿原酸的含量为3.7wt％，备用。

(2)莲子浸膏的制备

取5kg去壳的干燥莲子粉碎成200目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入50L的80％(v/v)乙醇水溶液，在60℃下回流提取2次，每次2小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到莲子浸膏粉907.3g，测得此莲子浸膏粉中多酚物质的含量为7.51wt％，备用。

(3)大豆浸膏的制备

取2.5kg干燥的发酵后的大豆粉碎成200目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入25L的水，在80℃下搅拌提取2次，每次2小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到大豆浸膏粉775g，测得此浸膏粉中总大豆肽的含量为22.1wt％，备用。

(4)山楂浸膏的制备

取干燥的生山楂2.5kg粉碎成200目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入 25L的90％(v/v)乙醇水溶液，在80℃回流提取2次，每次2小时，合并2次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到山楂浸膏粉535.7g，测得山楂中总黄酮含量为6.8wt％，备用。

(5)辣椒浸膏的制备

取干燥的辣椒2.5kg粉碎成200目粉末，置入提取罐中，每次向其中加入 25L的90％(v/v)乙醇水溶液，在80℃下回流提取2次，每次2小时，合并2 次的提取液，减压浓缩、真空冷冻干燥得到辣椒浸膏粉597.9g，测得此浸膏粉中辣椒素的含量为0.08wt％，备用。

(6)取步骤(1)得到的明日草浸膏粉500g、步骤(2)得到的莲子浸膏粉 500g、步骤(3)得到的大豆浸膏粉500g、步骤(4)得到的山楂浸膏粉500g 和步骤(5)得到的辣椒浸膏粉1g进行混合，混合均匀后粉碎成80目粉末，得混合浸膏粉；

(7)向步骤(6)得到的混合浸膏粉中加入其重量2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物(混合物中淀粉与糊精重量比4∶1)，混匀后，在搅拌下，再以喷雾方式，向其中加入总量为100mL的95％(v/v)乙醇水溶液，混合均匀制成软材，再采用压缩颗粒机制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得颗粒剂，即复合制剂。

实施例3复方制剂对小鼠直接睡眠的影响

受试动物为湖北省实验动物中心提供的SPF级昆明雄性(8周龄)小鼠120 只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。预先饲养一个星期。

1、分组与给药

将120只小鼠各自均分为三组：第一组为延长戊巴比妥钠睡眠时间组，第二组为戊巴比妥钠阈下剂量催眠组，第三组为戊巴比妥钠睡眠潜伏时间组；每组内各设四个小组：空白对照组、低、中、高剂量组，每组各10只小鼠。空白对照组经口灌胃给予等量蒸馏水，复合制剂的低、中、高剂量组分别给予相应剂量复合制剂灌胃(分别为0.35g/kg/d、0.70g/kg/d和7.0g/kg/d，直接以复合制剂重量计量)，所用复合制剂为实施例1制备的复合制剂，用生理盐水分散后给药，1 次/天，连续30天，第30天测定的指标为终期结果。

2、睡眠实验

观察和记录所有空白对照组、复合制剂低、中、高剂量组小鼠经灌胃结束后 30分钟内出现的睡眠时间及入睡动物数。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30-60s不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失到恢复这一段时间为动物睡眠时间。

翻正反射：指清醒状态下的人和动物处于不正常体位时，可通过一系列动作将体位恢复常态的反射活动；

睡眠潜伏期：从给药到翻正反射消失的时间；

睡眠持续期：翻正反射消失到翻正反射恢复的时间。

观察小鼠翻正反射：用手轻轻地将小鼠侧卧或仰卧，小鼠能立即翻正体位、恢复正常姿势，说明翻正反射存在。将小鼠置于背卧位时，如超过30秒不能翻正者即认为翻正反射消失，进入睡眠。

3、实验结果

选择其中一组小鼠，通过连续30天给药，在第30天测定小鼠灌胃后出现的睡眠时间及入睡动物数，结果如表1所示。实验中终期末次给药后，观察给予不同剂量复合制剂的各组小鼠和给予同体积蒸馏水的空白对照组小鼠，30分钟内空白对照组及各剂量组小鼠均出现翻正反射，不出现睡眠现象。表明复方制剂的低、中、高剂量均对小鼠无直接睡眠作用。

表1实施例1制备的复合制剂对小鼠直接睡眠作用的观察结果

实施例4复合制剂对戊巴比妥钠诱导小鼠催眠时间的影响。

受试动物为湖北省实验动物中心提供的SPF级昆明雄性(8周龄)小鼠。自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。预先饲养一个星期。

1、分组与给药

实施例3中的第一组40只小鼠为研究对象。所用复合制剂为实施例1制备的颗粒制剂，用生理盐水分散后给药，1次/天，连续30天，第30天测定的指标为终期结果。

2、延长戊巴比妥钠的睡眠时间实验

经预实验，探索出在动物100％入睡同时确保睡眠时间不过长的前提下，戊巴比妥钠剂量为50mg/kg，用此剂量为正式实验戊巴比妥钠的剂量。各剂量组于末次灌胃30分钟后，出现峰作用前的10-15分钟内给各剂量组动物腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，注射量为0.2ml/20g，以翻正反射消失为指标，观察复合制剂能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

3、实验结果

通过连续30天给药，对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的时间进行测定，结果如表 2所示。实验终期时，复合制剂各剂量组(分别为7.8±1.9、7.4±1.1、7.5±2.2min) 相较于空白组(8.5±1.7min)小鼠，均无有效延长睡眠时间的作用。

表2实施例1制备的复合制剂对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响(Mean±SEM，n＝10)

实施例5复方制剂对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响

受试动物为SPF级昆明雄性(8周龄)小鼠(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。

1、分组与给药

实施案例3中的第二组40只小鼠为研究对象，所用复合制剂为实施例1制备颗粒制剂，用生理盐水分散得到，1次/天，连续30天，第30天测定的指标为终期结果。

2、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验

经预试验确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量(45mg/kg)，即80-90％小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阈下剂量。各剂量组末次灌胃30分钟后，出现峰作用前的10-15分钟内，给予各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量(45 mg/kg)，注射量为0.2ml/20g，以翻正反射消失为指标，记录30分钟内入睡动物数(翻正反射消失达1分钟以上者)。实验在24-25℃安静环境下进行。

3、实验结果

通过连续30天给药，对入睡小鼠数量进行记录，结果如表3所示。在实验终期时，各剂量组的睡眠发生率与空白对照组(10％)有比较明显的提高，低剂量组和中剂量组睡眠发生率分别为60％、70％(P<0.01)；高剂量组小鼠睡眠发生率为90％(P<0.001)。表明在第30天时，高剂量的复合制剂与阈下剂量戊巴比妥钠具有明显协同催眠作用，实验结果为阳性。

表3实施例1制备的复合制剂对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响(n＝10)

注：“**,***”为与对照组相比，存在显著性差异(P<0.01,0.001)。

实施例6复方制剂对巴比妥钠诱导小鼠入睡潜伏期的影响

受试动物为湖北省实验动物中心提供的SPF级昆明雄性(8周龄)小鼠。自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。

1、分组与给药

实施案例3中的第三组40只小鼠为研究对象，所用复合制剂为实施例1制备的颗粒制剂，用生理盐水分散后给药，1次/天，连续30天，第30天测定的指标为终期结果。

2、巴比妥钠诱导小鼠入睡潜伏期时间的测定

经预实验，探索出在动物100％入睡同时确保睡眠时间不过长的前提下，戊巴比妥钠剂量为50mg/kg，用此剂量为正式实验戊巴比妥钠的剂量。各剂量组末次灌胃30分钟后，出现峰作用前的10-15分钟内，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，注射量为0.2ml/20g，以翻正反射消失为指标，观察复合制剂对戊巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

3、实验结果

通过连续30天给药，对小鼠潜伏期进行记录测定，结果如表4所示。在实验终期时，与空白对照组(12.0±2.1min)比较，复合制剂低、中、高剂量组(分别为6.5±0.5、4.2±0.3、3.7±1.2min)的睡眠潜伏时间均有明显的缩短(P<0.01， P<0.01，P<0.05)，中剂量睡眠潜伏期最短，效果最好。表明给予小鼠复合制剂 30天时，能使戊巴比妥钠睡眠潜伏期缩短，实验结果为阳性。

表4实施例1制备的复合制剂对巴比妥钠诱导小鼠入睡潜伏期的影响(Mean±SEM，n＝10)

注：“*,**”为与对照组相比，存在显著性差异(P<0.05,0.01)。

实施例7复方制剂对小鼠体重的影响

1、体重测量

类似实施例3中小鼠的空白与复合制剂处置(只是不做睡眠实验的相应测试；其他喂养方式相同；剂量使用分别为0.35g/kg/d、0.70g/kg/d和7.0g/kg/d，所使用的复合制剂是：实施例2制备的颗粒剂)，于每个星期测量一次体重并记录，并观察小鼠的摄食、饮水和外观状态。

2、实验结果

本次实验的过程中，小鼠的摄食、饮水均正常，外观无异样。随着时间的推移，小鼠的体重不断增加(如表5，表中1周，表示经过了1周时间)，并且各剂量组与空白组之间增长趋势与增长幅度相同，说明复方制剂的不同剂量对小鼠体重均无明显影响。

表5为实施例2制备的复合制剂长期大剂量喂养对小鼠体重(g)的影响

实施例8复方制剂对小鼠的毒副作用

1、分组与给药

在实施例7中的完成体重测定实验后，将所有空白对照组、复合制剂低、中、高剂量组中每组(10只)小鼠，采用颈椎脱臼法将其处死，立即取小鼠心、肝、脾、肾保存后处理。

2、HE常规染色

将各脏器用纱布包裹，置于福尔马林溶液中固定24h后；组织流水冲洗0.5 h左右；取组织厚度为3mm；将所取组织放入脱水机中脱水；石蜡包埋后制得组织蜡块。HE常规染色。

3、实验结果

通过连续30天给药，不同剂量对小鼠肝、肾、脾和心脏的影响，结果如表5、图1至图4所示。

图1为实施例2制备的复合制剂的低、中、高剂量对小鼠肝脏的影响图。空白对照组和低、中、高剂量组小鼠的肝组织结构无紊乱，肝小叶清晰完好，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞大小基本一致，肝细胞分布均匀、分界清晰，无空泡，无脂肪化。肝窦无明显淤血肿胀。复合制剂的低、中、高剂量组小鼠的肝组织周围间质均未见炎性细胞聚集，无炎性浸润。给药组与对照组的小鼠肝组织学结构无明显差异。图片中标尺为50微米。

图2为实施例2制备的复合制剂的低、中、高剂量对小鼠脾脏的影响图。对照组和低、中、高剂量组小鼠的脾组织结构正常无紊乱，脾窦无充血，脾小梁正常无坏死，红髓和白髓结构较清晰；给药组与对照组的小鼠脾组织学结构无明显差异。图片中标尺为50微米。

图3为实施例2制备的复合制剂的低、中、高剂量对小鼠心脏组织的影响图。给药组和对照组小鼠的心脏组织细胞排列较整齐，结构正常无紊乱，间隙大小正常。纤维中无空泡变性，横纹明显。细胞核分布居中清晰，形态完整。各组均未见炎症及其他病理变化。图片中标尺为50微米。

图4为实施例2制备的复合制剂的低、中、高剂量对小鼠肾脏组织的影响图。空白对照组和给药组小鼠的肾小球较清晰，毛细血管无扩张，血管上皮细胞无明显异常，组织结构无紊乱。对照组和给药组的肾间质均未见炎性浸润，且各给药组与对照组之间组织学结构无明显差异。图片中标尺为50微米。